專利名稱：一種輔酶q10生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法，尤其是涉及一種輔酶QlO生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的新方法。
背景技術(shù)：
輔酶QlO (2，3 二甲氧基-5-甲基6癸異戊烯基苯醌，Coenzyme Q10，CoQlO)，又名泛醌，癸烯醌，廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)，是生物細(xì)胞呼吸鏈中的重要遞氫體。輔酶QlO是一種重要的生化藥物，近年來已廣泛應(yīng)用于各類心臟病、糖尿病、癌癥、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病治療。此外，在治療壞血病、十二指腸潰瘍、壞死性牙周炎以及促進(jìn)胰腺功能和分泌等方面也有顯著效果。同時(shí)，Co QlO還具有抗衰老作用，在化妝品和保健品領(lǐng)域有廣泛的市場。輔酶QlO的制備方法主要有3種，即動(dòng)植物組織提取、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。動(dòng)植物組織提取法中動(dòng)物輔酶QlO含量低，而且各種化學(xué)成份復(fù)雜，并受原料和來源限制，因此產(chǎn)品成本高，價(jià)格昂貴，規(guī)模化生產(chǎn)受到了一定限制。化學(xué)合成法在技術(shù)上比較成熟，但其產(chǎn)物為順反異構(gòu)體的混合物，生物活性低，生產(chǎn)成本高，限制其工業(yè)化生產(chǎn)的程度。 微生物發(fā)酵法由于原料廉價(jià)豐富，產(chǎn)物分離過程相對(duì)簡單，產(chǎn)物為天然品，不存在異構(gòu)體問題，生物活性好，易被人體吸收，且可以通過發(fā)酵罐實(shí)現(xiàn)規(guī)?；I(yè)化生產(chǎn)，因此成為最有發(fā)展?jié)摿Φ妮o酶QlO生產(chǎn)方法。在微生物發(fā)酵生產(chǎn)中，種子的擴(kuò)大培養(yǎng)是發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序，種子液質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)起著關(guān)鍵作用。優(yōu)良的種子可以縮短發(fā)酵周期、穩(wěn)定產(chǎn)量與質(zhì)量、提高設(shè)備的利用率。因此種子擴(kuò)大培養(yǎng)是輔酶QlO發(fā)酵關(guān)鍵。目前，輔酶QlO發(fā)酵通常的種子培養(yǎng)工藝流程為斜面一母種一一級(jí)擴(kuò)培一二級(jí)擴(kuò)培一三級(jí)擴(kuò)培(如需要)一發(fā)酵，其中大多數(shù)的母種都是采用液體發(fā)酵培養(yǎng)法。中國專利CN101519681公開了一種輔酶QlO的生產(chǎn)發(fā)酵工藝，在保持輔酶QlO發(fā)酵品質(zhì)的前提下，根據(jù)輔酶QlO產(chǎn)生菌代謝過程中主要副產(chǎn)物5-脫甲氧基輔酶QlO的合成速率及其含量變化，反饋調(diào)節(jié)代謝初始反應(yīng)，并對(duì)合成代謝起限速作用，從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)目的產(chǎn)物輔酶QlO的積累進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，通過對(duì)發(fā)酵配方中主要底物濃度的優(yōu)化，及在發(fā)酵過程中對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速的優(yōu)化調(diào)控，使輔酶QlO的發(fā)酵水平有較大幅度的提升，輔酶QlO發(fā)酵水平可提高到3000u/ml以上，放罐最佳時(shí)機(jī)的確定提高了細(xì)胞內(nèi)輔酶QlO生產(chǎn)的時(shí)間利用率， 降低了發(fā)酵成本，使發(fā)酵原材料消耗大大降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)輔酶QlO發(fā)酵種子培養(yǎng)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供能提高產(chǎn)能的一種輔酶QlO生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法。本發(fā)明采用的菌種為類球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides JDW-610，已于2010 年12月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號(hào)為CGMCCNo. 4497。保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明包括以下步驟1)菌種傳代采用斜面菌種傳代，斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)；2)固料種子培養(yǎng)基的制備將固料培養(yǎng)基蒸煮后晾干，分裝滅菌，所述固料培養(yǎng)基包含固料組分與液體組分；3)固料種子的培養(yǎng)將新鮮斜面菌種類球紅細(xì)菌Iihodobacter sphaeroides加無菌水制成菌懸液，倒入固料培養(yǎng)基，培養(yǎng)后作為一級(jí)發(fā)酵的母種。在步驟1)中，所述斜面培養(yǎng)基的配方可為葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨 5g/L,氯化鈉5g/L，硫酸銨0. 5g/L，維生素B1 1 μ g/L，維生素K 1 μ g/L，維生素A 1. 5 μ g/ L, Na2MoO4 · 2Η20 0. 8 μ g/L, ZnSO4 · 7Η20 L 2 μ g/L, KNO3 0. 33 μ g/L, NaBr 0. 44 μ g/L,瓊脂20g/L，pH可為72 ；所述培養(yǎng)的條件可為滅菌溫度121°C，滅菌時(shí)間25min，30°C避光培養(yǎng)Mh，4 °C保藏備用，使用前先活化。在步驟2)中，所述固料組分的配方按質(zhì)量比可為麩皮25，大米25，小米50 ；所述液體組分的配方可為葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/L，氯化鈣2g/ L，硫酸銨 0. 5g/L，維生素 B1 lyg/L，維生素 K lyg/L，維生素 A 1. 5 μ g/L，CuSO2 · 5H20 0· 6 μ g/L, Na2MoO4 · 2Η20 0. 8 μ g/L, ZnSO4 · 7Η20 L 2 μ g/L, KNO3 0. 33 μ g/L, NaBr 0. 44 μ g/ L，pH可為72;所述固料組分與液體組分的質(zhì)量比可為10 7;所述蒸煮的溫度可為80°C， 蒸煮的時(shí)間可為40min ；所述分裝滅菌，可將固料培養(yǎng)基按200g/瓶分裝進(jìn)規(guī)格為IOOOmL 的K氏瓶中，滅菌的溫度可為121°C，滅菌的時(shí)間可為30min。在步驟幻中，所述培養(yǎng)，可采用在30°C避光培養(yǎng)1 后再次搖勻繼續(xù)培養(yǎng)至Mh。本發(fā)明在保持輔酶QlO發(fā)酵原有品質(zhì)的前提下，根據(jù)輔酶QlO產(chǎn)生菌的生理特性， 通過大量的種子工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以簡化種子工藝、提高輔酶QlO產(chǎn)能為目的，建立輔酶QlO 固料母種工藝，對(duì)其種子培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，提供了一種最終影響發(fā)酵，可提高產(chǎn)能的一種輔酶QlO生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法。本發(fā)明首次在輔酶QlO發(fā)酵擴(kuò)種工藝中采用固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的新方法，使用麩皮、大米、小米等固料代替瓊脂粉制備固料種子培養(yǎng)基，由于麩皮、大米、小米作為固體載體相對(duì)瓊脂平板具備更大的表面積，因此在有限的體積可提供更多的種子量；另外，由于這些固體原料本身富含多種生長因子，尤其是小米、麩皮的微量養(yǎng)分更豐富，因此非常有利于種子培養(yǎng)；同時(shí)，由于固料種子保存更方便，不易老化，因此便于發(fā)酵生產(chǎn)安排。由此可見，本發(fā)明相比液體母種具備以下優(yōu)點(diǎn)①菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)、同步性較好，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；②生理狀態(tài)穩(wěn)定，保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力；③ 簡化擴(kuò)種工藝，更易安排發(fā)酵過程。本發(fā)明首次在輔酶QlO發(fā)酵中建立固料母種發(fā)酵培養(yǎng)方法，并應(yīng)用于中試與大試發(fā)酵中，取得理想的發(fā)酵結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 液體種與固體種輔酶QlO搖瓶發(fā)酵的比較固體種搖瓶發(fā)酵流程新鮮斜面一固體種一搖瓶發(fā)酵一發(fā)酵液提取一HPLC檢測QlO效價(jià)。具體過程如下斜面、固料種子的培養(yǎng)同發(fā)明內(nèi)容所述；將備好的固料種子加入400mL無菌水洗下固料表面的菌苔制成菌懸液，按10 %接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，200r/min避光培養(yǎng)48h，提取發(fā)酵液檢測效價(jià)。液體種搖瓶發(fā)酵流程新鮮斜面一液體一級(jí)種一二級(jí)發(fā)酵一發(fā)酵液提取一HPLC 檢測發(fā)酵水平。具體過程如下斜面菌種菌懸液的制備同發(fā)明內(nèi)容所述；將備好的斜面菌懸液按1. 2%接種量接入一級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)基，30°C，200r/min避光培養(yǎng)Mh ；將一級(jí)搖瓶種子按10%移種量移接到二級(jí)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，3(TC，2(K)r/min避光培養(yǎng)48h，提取發(fā)酵液檢測效價(jià)。液體種與固體種搖瓶發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比如表1，結(jié)果表明固體種體現(xiàn)以下優(yōu)占.
^ \\\ ·①菌體形態(tài)個(gè)體較大，更飽滿；②菌種活力較強(qiáng)，菌濃較高；③簡化種子工藝。表1液體種與固體種搖瓶發(fā)酵結(jié)果
終止發(fā)酵液檢測
種子工藝 _
OD濕重(g/5mL)鏡檢效價(jià)(IU/mL)液體種0.1900.310菌體圓形、個(gè)小73.46液體種0.1980.317菌體圓形、個(gè)小76.25液體種0.1870.306菌體圓形、個(gè)小69.61固體種0.2110.324菌體圓形飽滿、個(gè)大87.98固體種0.2270.336菌體圓形飽滿、個(gè)大93.38固體種0.2240.334菌體圓形飽滿、個(gè)大89.48 實(shí)施例2 液體種與固體種100L小試罐輔酶QlO發(fā)酵的比較固體種小試流程新鮮斜面一固體種一30L種子罐一100L發(fā)酵罐一發(fā)酵液提取 HPLC檢測發(fā)酵水平。具體過程如下新鮮斜面與固體種子菌懸液的制備同上；將備好的固體種子菌懸液按1. 2%接種量接入 30L 種子罐，接后 15L，30°C，pH5. 5 5. 8, 200r/min, 0. 02 0. 04MPa,通氣量 0. 8 1. Im3A避光培養(yǎng)30h ；將種子液按10%接種量壓入100L發(fā)酵罐中，接后60L，32°C， pH5. 5 5. 8，200r/min, 0. 02 0. 05MPa,通氣量 1. 8 2. 8m3/h 避光培養(yǎng) 88h 發(fā)酵結(jié)束， 在發(fā)酵40h后每他取樣檢測效價(jià)。液體種小試流程新鮮斜面一液體一級(jí)搖瓶種子一30L 二級(jí)種子罐一100L發(fā)酵罐 —發(fā)酵液提取HPLC檢測發(fā)酵水平。具體過程如下斜面菌懸液的制備同上。將備好的斜面菌懸液按接種量接入液體一級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)基，3(TC，200r/min避光培養(yǎng)Mh ；按1. 2 %接種量將一級(jí)搖瓶種子液接入二級(jí)種子罐，接后 15L，30°C，pH5. 5 5. 8，200r/min，0. 02 0. 04MPa，通氣量 0. 8 1. lm3/h 避光培養(yǎng)30h ；將二級(jí)種子液按10%移種量壓入100L發(fā)酵罐中，接后60L，32°C，pH5. 5 5. 8， 200r/min, 0. 02 0. 05MPa,通氣量1. 8 2. 8m3/h避光培養(yǎng)88h發(fā)酵結(jié)束，在發(fā)酵40h后每取樣檢測效價(jià)。發(fā)酵過程總共進(jìn)行2次補(bǔ)料，補(bǔ)料時(shí)間分別為發(fā)酵5 和72h，補(bǔ)料體積按發(fā)酵液中控制含糖量4g/L，pH5. 5 5. 8為準(zhǔn)。液體種與固體種小試100L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比如表2，結(jié)果表明固體種體現(xiàn)以下優(yōu)點(diǎn)①菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)、同步性較好，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；②生理狀態(tài)穩(wěn)定，保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力；③簡化擴(kuò)種工藝，縮短發(fā)酵周期。表2液體種與固體種100L小試罐發(fā)酵結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種輔酶Qio生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法，其特征在于，采用的菌種為類球紅細(xì)菌Miodobacter sphaeroides,已于2010年12月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號(hào)為 CGMCCNo. 4497 ；所述方法包括以下步驟1)菌種傳代采用斜面菌種傳代，斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)；2)固料種子培養(yǎng)基的制備將固料培養(yǎng)基蒸煮后晾干，分裝滅菌，所述固料培養(yǎng)基包含固料組分與液體組分；3)固料種子的培養(yǎng)將新鮮斜面菌種類球紅細(xì)菌Iihodobactersphaeroides加無菌水制成菌懸液，倒入固料培養(yǎng)基，培養(yǎng)后作為一級(jí)發(fā)酵的母種。
2.如權(quán)利要求1所述的一種輔酶QlO生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟1)中，所述斜面培養(yǎng)基的配方為葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L， 氯化鈉5g/L，硫酸銨0. 5g/L，維生素B1 lyg/L，維生素K lyg/L，維生素A 1.5yg/L, Na2MoO4 · 2Η200· 8 μ g/L, ZnSO4 · 7H20 1. 2 μ g/L, KNO3 0. 33 μ g/L, NaBr 0. 44 μ g/L,瓊脂 20g/L，pH 為 72。
3.如權(quán)利要求1所述的一種輔酶QlO生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟1)中，所述培養(yǎng)的條件為滅菌溫度121°C，滅菌時(shí)間25!^11，301避光培養(yǎng)對(duì)11，41保藏備用。
4.如權(quán)利要求1所述的一種輔酶QlO生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟幻中，所述固料組分的配方按質(zhì)量比為麩皮25，大米25，小米50。
5.如權(quán)利要求1所述的一種輔酶QlO生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法，其特征在于， 在步驟幻中，所述液體組分的配方為葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/ L，氯化鈣2g/L，硫酸銨0. 5g/L，維生素B1 lyg/L，維生素K lyg/L，維生素A 1.5 μ g/L, CuSO2 · 5H20 0· 6 μ g/L, Na2MoO4 · 2Η20 0. 8 μ g/L, ZnSO4 · 7Η20 L 2 μ g/L, KNO3 0. 33 μ g/L, NaBr 0. 44 μ g/L, ρΗ 為 72。
6.如權(quán)利要求1所述的一種輔酶QlO生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟幻中，所述固料組分與液體組分的質(zhì)量比為10 7。
7.如權(quán)利要求1所述的一種輔酶QlO生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟2)中，所述蒸煮的溫度為80°C，蒸煮的時(shí)間為40min。
8.如權(quán)利要求1所述的一種輔酶QlO生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟2)中，所述分裝滅菌，是將固料培養(yǎng)基按200g/瓶分裝進(jìn)規(guī)格為IOOOmL的K氏瓶中， 滅菌的溫度為121°C，滅菌的時(shí)間為30min。
9.如權(quán)利要求1所述的一種輔酶QlO生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟幻中，所述培養(yǎng)，是采用在3o°c避光培養(yǎng)1 后再次搖勻繼續(xù)培養(yǎng)至Mh。
全文摘要
一種輔酶Q10生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法，涉及一種固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法。提供能提高產(chǎn)能的一種輔酶Q10生產(chǎn)的固料母種發(fā)酵培養(yǎng)的方法。采用的菌種為類球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides。采用斜面菌種傳代，斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)；將固料培養(yǎng)基蒸煮后晾干，分裝滅菌，所述固料培養(yǎng)基包含固料組分與液體組分；將新鮮斜面菌種類球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides加無菌水制成菌懸液，倒入固料培養(yǎng)基，培養(yǎng)后作為一級(jí)發(fā)酵的母種。在種子工藝中使用，有效提高輔酶Q10發(fā)酵水平，節(jié)省發(fā)酵級(jí)數(shù)縮短了周期，簡化生產(chǎn)環(huán)節(jié)，降低生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P7/66GK102154182SQ20111005036
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者吳松剛, 吳美瓊, 鄭毅, 陳俊煌, 陳大軍, 陳金卿, 黃建忠 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古金達(dá)威藥業(yè)有限公司, 廈門金達(dá)威集團(tuán)股份有限公司