專利名稱：一種小鼠白內(nèi)障模型及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及小鼠白內(nèi)障自發(fā)突變基因純系BALB/ cAnSlac-Crygc-del的構(gòu)建及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小鼠已成為研究人類疾病的一種重要模式生物，哺乳動物發(fā)育相關(guān)的功能基因的鑒定多來源于自發(fā)或誘發(fā)突變的小鼠。小鼠先天性白內(nèi)障(congenital cataract)為出生時或出生后第一年內(nèi)發(fā)生的晶狀體混濁，小鼠白內(nèi)障表型多由單基因突變引起，且具有高度的遺傳異質(zhì)性，與晶狀體發(fā)育和分化有關(guān)的基因突變可形成遺傳性白內(nèi)障。2006年在，在BALB/cAnSlac近交系小鼠與ICR遠(yuǎn)交系的雜交Fl代群體中，發(fā)現(xiàn) 2只自發(fā)突變導(dǎo)致白內(nèi)障的小鼠(上述兩品系雜交自發(fā)突變導(dǎo)致白內(nèi)障小鼠的幾率為千分之0. 625)。經(jīng)與BALB/cAnSlac進(jìn)一步回交10代，繁育攜帶白內(nèi)障癥狀的純系小鼠，保持了穩(wěn)定的顯性常染色體遺傳特征，但未知其具體突變基因及位置。目前對單基因遺傳致病基因的克隆多采用位置克隆的策略。通過覆蓋高密度的遺傳位標(biāo)(marker)在家系中進(jìn)行基因組掃描，基因組掃描的關(guān)鍵是計算所需遺傳位標(biāo)的個數(shù)。一般認(rèn)為72只F2代患病白內(nèi)障小鼠僅需要46個STR(short tandem repeat)位點(diǎn)用于基因定位。對于顯性遺傳性白內(nèi)障小鼠，若某位點(diǎn)純合基因型占患病樣本的比率低于 25%，即為連鎖，通過連鎖分析的方法，先找到與致病基因緊密連鎖的標(biāo)記，從而將致病基因初步定位于染色體某一適當(dāng)狹窄的區(qū)域，然后在該區(qū)域內(nèi)使用覆蓋程度更高的標(biāo)記物作深入的連鎖分析，就可將致病基因確定在較小的區(qū)域。cDNA測序技術(shù)結(jié)合基因分型技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了白內(nèi)障基因的突變位點(diǎn)和方式，由此構(gòu)建的小鼠白內(nèi)障自發(fā)突變基因純系，給予了我們從遺傳學(xué)角度研究個體疾病發(fā)生機(jī)制的良好平臺。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種攜帶白內(nèi)障癥狀的純系小鼠BALB/c+/+ 的模型及其構(gòu)建方法，本發(fā)明的白內(nèi)障癥狀純系小鼠BALB/c+/+可以研究在與C3H/He連續(xù)回交2代基礎(chǔ)上，挑選白內(nèi)障癥狀小鼠用于遺傳學(xué)鑒定白內(nèi)障基因，得到了穩(wěn)定遺傳的小鼠白內(nèi)障自發(fā)突變基因純系BALB/cAnSlac-Crygc-del，是用遺傳學(xué)方法研究自發(fā)性白內(nèi)障致病機(jī)制的有力工具。本發(fā)明的小鼠白內(nèi)障模型構(gòu)建方法，包括(1)回交(a)取BALB/cAnSlac小鼠與SLAC: ICR小鼠雜交，獲得子代，篩選出白內(nèi)障小鼠；(b)以白內(nèi)障小鼠為父本，以BALB/cAnSlac品系為母本雜交得到Fl代；Fl代挑選白內(nèi)障癥狀小鼠與BALB/cAnSlac回交至少10代，培育成攜帶白內(nèi)障癥狀的純系小鼠BALB/ c+/+ ；(C) BALB/c+/+小鼠與遺傳背景已知的C3H/He連續(xù)回交2代，獲得F2代，挑選白內(nèi)障癥狀小鼠用于遺傳學(xué)鑒定。(2)遺傳學(xué)鑒定(a)從 NCBI (National Center for Biotechnology Information)選取平均覆蓋 19條常染色體的共44個STR位點(diǎn)，STR位點(diǎn)在C3H/HeJSlac和BALB/cAnSlac兩個品系中的片斷長度互不相同，并相差4個bp以上，對這些位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計，鑒定回交小鼠的基因組 DNA。(b)從 NCBI (National Center for Biotechnology Information)上進(jìn)一步選取精細(xì)定位所用遺傳位標(biāo)，STR位點(diǎn)在C3H/HeJSlac和BALB/cAnSlac兩個品系中的片斷長度互不相同，并相差4個bp以上，然后對這些STR位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計，通過全基因組掃描與單倍型分析，將白內(nèi)障相關(guān)基因精細(xì)定位到小的區(qū)段內(nèi)；(c)挑選區(qū)段內(nèi)晶狀體蛋白基因Cryg作為候選基因，針對其cDNA序列設(shè)計合適的引物，以野生型、白內(nèi)障雜合型、純合型為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物測序；(d)對Cryg突變位點(diǎn)設(shè)計一對熒光引物，以野生型、白內(nèi)障雜合型、純合型為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證Cryg突變位點(diǎn)，其中上游引物5，一 3，CAGAATGCGGCTGTATGAGA下游引物5，一 3，GAGCCCGCCTTAGCATCTAC。(e)BALB/cAnSlac-Crygc-del純系的突變基因?yàn)镃rygc亞基第三個外顯子1個堿
基缺失突變。其中回交過程中，(a)中所述突變小鼠顯示先天性白內(nèi)障，(b)中所述雜合子突變小鼠為與(a)中所述突變小鼠類似的核型和放射狀白內(nèi)障，(b)中所述純合子突變小鼠剛出生就形成完全白內(nèi)障。所述雜合子突變小鼠的晶狀體變小，純合子突變小鼠晶狀體空泡化。所述步驟(1)小鼠購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。所選擇的全基因組掃描和精細(xì)定位STR如表1和表4所示。從NCBI (National Center for Biotechnology Information)進(jìn)入小鼠基因組數(shù)據(jù)庫，每條小鼠染色體上選取2 3個小鼠STR(short tandem r印eat)位點(diǎn)，且在每條染色體上分布平均，約40cM，共44個STR位點(diǎn)。本發(fā)明還提供了一種小鼠白內(nèi)障模型，其經(jīng)由以下步驟獲得(a)取BALB/cAnSlac小鼠與ICR小鼠雜交，獲得子代，篩選出白內(nèi)障突變小鼠；(b)以白內(nèi)障突變小鼠為父本，以BALB/cAnSlac品系為母本雜交得到Fl代；Fl代挑選白內(nèi)障癥狀小鼠與BALB/cAnSlac回交至少10代，培育成攜帶白內(nèi)障癥狀的純系小鼠， 即獲得小鼠白內(nèi)障模型。上述模型為小鼠白內(nèi)障BALB/cAnSlac-Crygc-del模型，突變純系小鼠BALB/ cAnSlac-Crygc-del的突變基因?yàn)镃rygc，且Crygc基因缺乏編碼第三個外顯子最后15個
氨基酸。有益效果(1)白內(nèi)障癥狀純系小鼠BALB/c+/+可以研究在與C3H/He連續(xù)回交2代基礎(chǔ)上， 挑選白內(nèi)障癥狀小鼠用于遺傳學(xué)鑒定白內(nèi)障基因，得到了穩(wěn)定遺傳的小鼠白內(nèi)障自發(fā)突變基因純系BALB/cAnSlac-Crygc-del，是用遺傳學(xué)方法研究自發(fā)性白內(nèi)障致病機(jī)制的有力工具。(2)所獲得的白內(nèi)障突變小鼠，可用于先天性白內(nèi)障的治療研究。


圖1為回交遺傳效應(yīng)示意圖。圖2為白內(nèi)障與非白內(nèi)障小鼠眼睛圖。注A為野生型，B為純合型，C為雜合型圖3為Cryg的cDNA測序圖。注圖中箭頭處1為野生型小鼠，2為雜合型小鼠，3為純合型小鼠，箭頭所指處示 Cryg缺失1個堿基G。圖4為Cryg突變位點(diǎn)驗(yàn)證圖。注A為白內(nèi)障純合型小鼠，B為白內(nèi)障雜合型小鼠，C為野生型小鼠。白內(nèi)障純合子與野生型有Ibp的差異。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式有同樣羅于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1 小鼠白內(nèi)障純系模型構(gòu)建1.回交(a)取BALB/cAnSlac小鼠與Slac ICR小鼠雜交，獲得子代，篩選出白內(nèi)障小鼠；(b)以白內(nèi)障小鼠為父本，以BALB/cAnSlac品系為母本雜交得到Fl代；Fl代挑選白內(nèi)障癥狀小鼠與BALB/cAnSlac回交10代，培育成攜帶白內(nèi)障癥狀的純系小鼠BALB/ c+/+ ；(c) BALB/c+/+小鼠與C3H/He連續(xù)回交2代，獲得F2代，挑選白內(nèi)障癥狀小鼠用于遺傳學(xué)鑒定。2.鑒定回交從 NCBI (National Center for Biotechnology Information)得到選取 STR 位點(diǎn)的序列，然后對這些位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計，主引物設(shè)計主要借助01igo6. 0程序完成。表1本發(fā)明中全基因組掃描選擇的STR位點(diǎn)
權(quán)利要求
1.一種小鼠白內(nèi)障模型構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)回交(a)取BALB/cAnSlac小鼠與ICR小鼠雜交，獲得子代，篩選出白內(nèi)障突變小鼠；(b)以白內(nèi)障突變小鼠為父本，以BALB/cAnSlac品系為母本雜交得到Fl代；Fl代挑選白內(nèi)障癥狀小鼠與BALB/cAnSlac回交至少10代，培育成攜帶白內(nèi)障癥狀的純系小鼠BALB/ cAnSlac-Crygc-del ；(2)遺傳學(xué)鑒定利用STR位點(diǎn)進(jìn)行基因組掃描，及cDNA測序技術(shù)對純系小鼠BALB/cAnSlac-Crygc-del 進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定。
2.依據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)遺傳學(xué)鑒定具體為(a)JA NCBI (National Center for Biotechnology Information) ^ΙΨ^Μ 19 條常染色體的共44個STR位點(diǎn)，STR位點(diǎn)在C3H/HeJSlac和BALB/cAnSlac兩個品系中的片斷長度互不相同，并相差4個bp以上，對這些位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計，鑒定回交小鼠的基因組 DNA ；(b)從NCBI (National Center for Biotechnology Information)上進(jìn)一步選取精細(xì)定位所用遺傳位標(biāo)，STR位點(diǎn)在C3H/HeJSlac和BALB/cAnSlac兩個品系中的片斷長度互不相同，并相差4個bp以上，然后對這些STR位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計，通過全基因組掃描與單倍型分析，將白內(nèi)障相關(guān)基因精細(xì)定位到小的區(qū)段內(nèi)；(c)挑選區(qū)段內(nèi)晶狀體蛋白基因Cryg作為候選基因，針對其cDNA序列設(shè)計合適的引物，以野生型、白內(nèi)障雜合型、純合型為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物測序；(d)對Cryg突變位點(diǎn)設(shè)計一對熒光引物，以野生型、白內(nèi)障雜合型、純合型為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證Cryg突變位點(diǎn)，其中上游引物 5’ 一 3’ CAGAATGCGGCTGTATGAGA下游引物 5’ 一 3’ GAGCCCGCCTTAGCATCTAC ；(e)BALB/cAnSlac-Crygc-del純系的突變基因?yàn)镃rygc亞基第三個外顯子1個堿基缺失突變。
3.依據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(a)中選取的STR位點(diǎn)如下表所示
4.依據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(b)中選取的STR位點(diǎn)如下表所示 STR所在染色體所在位置(cM) 兩品系PCR產(chǎn)物片斷長度差異(bp)
5.依據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中突變的Crygc基因缺乏編碼第三個外顯子最后15個氨基酸。
6.依據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中步驟(a)中所述突變小鼠顯示先天性白內(nèi)障，步驟(b)中Fl代為雜合子突變小鼠，其表現(xiàn)為與步驟(a)中所述突變小鼠類似的核型和放射狀白內(nèi)障，步驟(b)中所述純合子突變小鼠剛出生就形成完全白內(nèi)障。
7.依據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于雜合子突變小鼠的晶狀體變小，純合子突變小鼠晶狀體空泡化。
8.依據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中所述突變純系小鼠是稱為BALB/ cAnSlac-Crygc-del 的品系。
9.一種小鼠白內(nèi)障模型，其特征在于經(jīng)由以下步驟獲得(a)取BALB/cAnSlac小鼠與ICR小鼠雜交，獲得子代，篩選出白內(nèi)障突變小鼠；(b)以白內(nèi)障突變小鼠為父本，以BALB/cAnSlac品系為母本雜交得到Fl代；Fl代挑選白內(nèi)障癥狀小鼠與BALB/cAnSlac回交至少10代，培育成攜帶白內(nèi)障癥狀的純系小鼠，即獲得小鼠白內(nèi)障模型。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的小鼠白內(nèi)障模型，其特征在于所述模型為小鼠白內(nèi)障 BALB/cAnSlac-Crygc-del 模型，突變純系小鼠 BALB/cAnSlac-Crygc-del 的突變基因?yàn)?Crygc,且Crygc基因缺乏編碼第三個外顯子最后15個氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及小鼠白內(nèi)障自發(fā)突變基因純系BALB/cAnSlac-Crygc-del的構(gòu)建及其應(yīng)用。依據(jù)本發(fā)明公開的方法可以篩選獲得多種突變小鼠，為研究白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制、治療方法打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)。根據(jù)本發(fā)明所述的方法獲得的白內(nèi)障癥狀純系小鼠BALB/cAnSlac-Crygc-del，可以用于先天性白內(nèi)障的治療研究，能夠?yàn)榘變?nèi)障的防治作出突出的貢獻(xiàn)。
文檔編號C12Q1/68GK102450230SQ201110051569
公開日2012年5月16日 申請日期2011年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月3日
發(fā)明者孫宗國, 李凱, 趙國際, 陳燁, 鮑世民 申請人:東華大學(xué), 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院