專利名稱：山羊可誘導(dǎo)多能干細胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種山羊由成體細胞重編程為類似胚胎干胞的可誘導(dǎo)多能干細胞(Induced pluripotent stem cell,簡稱iPS細胞)的制備方法。
背景技術(shù)：
山羊在畜牧、醫(yī)藥方面都有巨大的應(yīng)用前景，通過對山羊胚胎干細胞(ESC)系進行操作可以產(chǎn)生克隆動物或者轉(zhuǎn)基因動物，對建造人類疾病模型、器官移植、改良物種、增加經(jīng)濟效益等方面意義重大。ESCs是指來源于哺乳動物囊胚內(nèi)細胞團的一類細胞。這類細胞呈圓形，核質(zhì)比很大，自穩(wěn)定性很好，具有無限增殖、自我更新的能力，能夠在體外培養(yǎng)的環(huán)境中永久傳代，并保持正常核型；ESCs還具有“全能性”，無論在體內(nèi)還是體外環(huán)境，它們都能分化成成體生物所有的細胞類型。建立動物ESC細胞系對于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物和克隆動物都具有非常重要的意義。基于胚胎干細胞研究的反向遺傳學(xué)手段對于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、基因敲除模型的建立等方面具有巨大的推動作用。從25年前小鼠胚胎干細胞獲得到現(xiàn)在，人們利用反向遺傳學(xué)手段不斷建立和完善各種小鼠模型(Demers, S. P.，et al. (2007), Cloning and stemcells,9,512-522)。經(jīng)典的建立ESC細胞系的方法是從囊胚的內(nèi)細胞團分離出ESCs.但是利用這個方法所建立的真正意義的胚胎干細胞系被報道的哺乳動物只有小鼠(Evans MJ,et al. (1981)，Nature，292，154-156)、恒河猴(Liu，et al. (2008)，Cell Stem Cell,3,587-590)、人(Takahashi K.，et al. (2007)，Cell，131，861-872)和大鼠(Li, etal. (2008)，Cell，135，1299-1310)。而其他多數(shù)哺乳動物，包括豬、牛、羊等，雖然也有科學(xué)家嘗試建立相應(yīng)胚胎干細胞系，但都沒有獲得一株被認可的細胞系，其中很重要的一個原因就是沒有尋找到適合這些動物ESC全能性維持的培養(yǎng)基。此外，山羊的胚胎發(fā)育過程以及維持山羊ESCs全能性的通路研究都不夠清楚，導(dǎo)致目前并沒有產(chǎn)生山羊ESC細胞系，也就制約了轉(zhuǎn)基因山羊及克隆羊的應(yīng)用，由上，建立山羊ES細胞系迫在眉睫。2006年8月,Yamanaka實驗室利用外源表達0ct4, Sox2, c_Myc, Klf4四個轉(zhuǎn)錄因子，成功誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細胞為類似小鼠胚胎干細胞的“可誘導(dǎo)的多能干細胞”(induced pluripotent stem cells, iPS),這項實驗結(jié)果說明分化細胞可以通過幾個轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)，重編程到全能性的狀態(tài)(Takahashi K.，et al. (2006) Cell, 126,663-676)；2007年，人類iPS的建立，進一步驗證了該方法的可行性(Takahashi K.，et al. (2007)，Cell, 131,861-872 ；Yu, et al. (2007)，Science, 318,1917-1920)，之后，恒河猴，大鼠，豬等物種的iPS細胞系相繼建立。大鼠是iPS細胞系早于ES系建立的先例，盡管iPS細胞并非百分之百的ES細胞，但有理由相信，iPS細胞可以運用到那些使用傳統(tǒng)方法無法建立ES細胞的物種上，比如山羊
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種山羊可誘導(dǎo)多能干細胞的制備方法。根據(jù)本發(fā)明的山羊可誘導(dǎo)多能干細胞的制備方法，包括步驟A)構(gòu)建tet-on可誘導(dǎo)慢病毒載體系統(tǒng),所述轉(zhuǎn)錄因子選自0ct4、Sox2、c_Myc、Klf4、Lin28、Nanog、SV401arge T、hTert ；B)采用步驟A)所得慢病毒載體將所述轉(zhuǎn)錄因子以組合形式感染山羊成體細胞，挑選形態(tài)類似胚胎干細胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合胚胎干細胞特性的細胞克隆，得到山羊iPS細胞。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述山羊成體細胞為山羊原代耳尖成纖維細胞。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述慢病毒載體以組合形式攜帶的轉(zhuǎn)錄因子包括0ct4、 Sox2、c_Myc、Klf4、Lin28、Nanog、SV40 largeT、hTert。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟B)克隆的產(chǎn)生是在感染第12天消化為單細胞按I : 3的比例傳代至輻照過的小鼠胚胎成纖維細胞上，繼續(xù)培養(yǎng)14天，挑取克隆。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟B)的傳代培養(yǎng)是將山羊iPS克隆按I : 5 10的比例傳至輻照過的小鼠胚胎成纖維細胞上。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟B)的篩選是篩選堿性磷酸酶染色呈陽性的細胞。C)山羊iPS細胞的干細胞多能性鑒定根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟C)山羊iPS細胞的多能性鑒定包括實時定量PCR對山羊iPSC細胞系內(nèi)源多能性基因的檢測，如0ct4、Sox2、nanog被誘導(dǎo)表達，此外CDHK Dnmt3b> TDGF> Daxl> Rexl> Sall4 等干細胞 marker 均被誘導(dǎo)表達；指標為I)堿性磷酸酶表達呈陽性；2)干細胞表面特異標記 SSEA-I (+)、Rexl (+)、SSEA-3 (-)、SSEA_4(_)、Tra-1-60(+)、Tra-1-81(+)、E-Cadherin(+)；3)Nanog基因的啟動子區(qū)域被去甲基化；4)撤DOX后，山羊外源基因的表達檢測，表明外源基因被有效關(guān)閉；5)自然分化形成胚狀體后,外胚層NeuroD (+)、Fibronectin(+),中胚層Myf5(+)、Enolse3(+)、VEGFR2(+)和內(nèi)胚層 DCNl (+)、AFP (+)；6)體外隨機分化，免疫熒光檢測到外胚層Tujl(+)、GFAP(+)，中胚層a_SMA(+)、Myotube (+)，內(nèi)胚層 FoxA2 (+)；7)山羊iPS細胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述畸胎瘤具有外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。本發(fā)明有助于確立山羊ES細胞建系的最適培養(yǎng)條件和方法；山羊iPS細胞是山羊基因打靶的良好載體，本發(fā)明的山羊iPS細胞將利于揭示山羊各基因功能和復(fù)雜的發(fā)育事件；此外，山羊iPS是豬的iPS成功誘導(dǎo)后第一項其它大型偶蹄目物種的iPS，這對于其它動物iPS的誘導(dǎo)有著重大指導(dǎo)意義。


圖 I 是病毒載體 Lenti-EFl a -EGFP-tetO-cDNA 和 Lenti-EFl a -rtTA-IRES-EGFP結(jié)構(gòu)圖。圖2是山羊iPS細胞獲得的實驗流程圖。圖3是不同轉(zhuǎn)錄因子組合情況下，山羊PEF被誘導(dǎo)所產(chǎn)生的克隆數(shù)與堿性磷酸酶檢測陽性克隆數(shù)統(tǒng)計結(jié)果圖。圖4是山羊iPS細胞形態(tài)熒光鏡檢結(jié)果圖，其中A :山羊未完全重編程克隆形態(tài)B 低倍鏡下山羊的ES-Iike克隆C :ES-like克隆形態(tài)D :高倍鏡下的山羊iPS細胞。圖5是山羊iPS細胞表面及多能型marker檢測圖，其中A :堿性磷酸酶、B =SSEA-UC :SSEA-3、D :SSEA-4、E :Rexl、F :Tra-l_60、G :Tra-l_81、H :E_Cadherin。圖6是Realtime PCR檢測山羊iPS細胞多能性Marker表達情況電泳圖，從左到右依次為山羊耳尖成纖維細胞，山羊iPS細胞8-3，山羊iPS細胞8-4，山羊iPS細胞8-7， 山羊iPS細胞8-9，陰性對照。其中，山羊iPS細胞8-3為8個病毒因子誘導(dǎo)出的山羊可誘導(dǎo)多能干細胞3號克隆，其余同理。圖7是絕對定量檢測山羊iPS細胞基因表達情況電泳圖，從左到右依次為山羊耳尖成纖維細胞，人胚胎干細胞，山羊iPS細胞8-3，山羊iPS細胞8-4，山羊iPS細胞8-7，山羊iPS細胞8-9。圖8是Nanog啟動子區(qū)去甲基化檢測結(jié)果圖，分別為山羊耳尖成纖維細胞，山羊iPS細胞8-3，山羊iPS細胞8-4，山羊iPS細胞8-7，山羊iPS細胞8_9。圖9撤DOX后，山羊外源基因的表達檢測結(jié)果圖，分別為山羊iPS及撤DOX 2天、4天、6天、8天的外源基因表達檢測。圖10是Realtime PCR檢測山羊iPS細胞在體外向三個胚層的分化能力圖，從左到右泳道依次是山羊iPS細胞8-3，山羊iPS細胞8-4，山羊iPS細胞8-7，山羊iPS細胞8-9，山羊iPS細胞8-3的EB，山羊iPS細胞8_4的EB，山羊iPS細胞8_7的EB，山羊iPS細胞8-9的EB和陰性對照。圖11是山羊iPS細胞體外隨機分化情況的免疫染色圖。圖12是山羊iPS細胞畸胎瘤免疫組化圖，其中A :角化上皮(外胚層)B :平滑肌(中胚層)C :脂肪組織(中胚層)D腺管(內(nèi)胚層)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。以下實施例中，用到的培養(yǎng)基有山羊原代耳尖成纖維細胞的培養(yǎng)基，具體組成為90%的D-MEM培養(yǎng)液(購自Invitrogen, 12571) ;10%的胎牛血清(購自 HyClone，SH30396. 03)。山羊iPS細胞的培養(yǎng)基，具體組成為79%的Knockout D-MEM/F12培養(yǎng)液(購自Invitrogen, 12660) ;20%的Knockout SR(購自 Invitrogen, 10828) ；lmM L-谷氨酸(購自Invitrogen, 25030) ;1*% 的非必須氨基酸(購自 Invitrogen, 11140050) ；0. ImMP-疏基乙醇(購自 Sigma, M7522)。以下實施例中所使用的原始慢病毒載體Lenti-EFl a -IRES-EGFP購自Invitrogen公司，具有氨節(jié)抗性。
以下實施例中，通用的細胞培養(yǎng)產(chǎn)品均購自Invitrogen公司。實施例I、慢病毒載體的構(gòu)建
I. I、從NCBI網(wǎng)站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)查詢干細胞中特異表達或高表達的特定基因(0ct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Lin28, Nanog, hTert, SV401argeT antigen 和rtTA)的編碼區(qū)，根據(jù)編碼區(qū)序列設(shè)計引物，并引入酶切位點，引物序列如表I所示(其中F表示正向引物，R表示反向引物)。表I引物序列表

基因~GenBank~|引物|對應(yīng)
名稱序列號名稱_引物序列__的酶
0ct4 雇 002701 1F ggggGGATCCgccaccatggcgggacacctggcttc BamHI
IRgcgcGCT AGCtcagtttgaatgcatgggagNheI
Sox2 NP 003097 2F ggggGGATCCgccaccatgtacaacatgatggagacgg BamHI___2R__gcgcGCT AGCtcacatgtgtgagaggggcag__NheI
u _______ 3F ggggGGATCCgccaccatgcccctcaacgttagcttca BamHI
c-Myc NP—002458 ---
___3R__gcgcGCT AGCttacgcacaagagttccgtagc__NheI
Klf4 NP 004226 4F ggggGGATCCgccaccatgaggcagccacctggcgag BamHI___4R__gcgcGCT AGCttaaaaatgcctcttcatgtg__NheI
_________ 5F ggggAGATCTgccaccatgagtgtggatccagcttgtc BglII
Nanog NP—079141 ---
___5R__gcgcGCT AGCtcacacgtcttcaggttgcatg__NheI
Lin28 m 078950 6F ggggGGATCCgccaccatgggctccgtgtccaaccag BamHI
___6R__gcgcGCT AGCtcaatt ctgtgcctccgggag__NheI
, m 7F gcgc AGATCTgccaccatgccgcgcgctccccgctg BglII hTert NP—001180305--—---5555-----
___7R__gcgcGTCGACtcagtccaggatggt cttgaag__Sail
SV40 Yp Q0370O3O2 8F ggggGAATTCgccaccatggataaagttttaaacagagaggaatc EcoRI Large T 一
___8R__gcgcGT CGACttatgtttcaggttcagggggagg__Sail注引物序列中大寫的字母為引入的酶切位點。

I. 2、PCR 擴增以人類總cDNA為模板，利用表I中各基因引物進行PCR擴增，具體如下

反應(yīng)體系(25U I) : 10XpfxMix 2. 5 U I，AccuPrime pfx 酶 0. 2 U I，上下游引物 (50 u M)各 0. 25 u I，模板 0. 25 u I，ddH20 21. 55 u I 反應(yīng)條件％°C2min ；95 °C 20sec 66 °C 20sec 68 °C 3Osec,循環(huán) 35 次；68°C IOmin0
I. 3、慢病毒載體的構(gòu)建將所得PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用天根公司的通用型DNA純化回收試劑盒(離心柱型)回收各基因片段，分別利用各自酶切位點雙酶切，用相應(yīng)的酶雙酶切慢病毒載體 LV-EFl a -EGFP-tetO-cDNA 和 Lenti-EFl a -cDNA-IRES-EGFP，得到慢病毒載體的骨架片段，將慢病毒載體的骨架片段和各基因片段用T4DNA連接酶(Fermentas公司)于22°C連接3h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化GBE180感受態(tài)細菌(制備方法見http://www. chem.uga.edu/scottgrp/GrDProtocols/ComDetent cell preparation, htm)， 在瓊月旨平板上(含氨芐抗生素)，于37 °C培養(yǎng)12小時，從平板上挑取陽性單菌落，使用博大泰克B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定為正確方可使用，將所得載體分別命名為 Lenti-EFl a -EGFP-tet0_0ct4、Lenti-EFl a -EGFP-tetO_Sox2、Lenti-EFl a -EGFP_tetO_cMyc、Lenti-EFl a -EGFP_tetO_Klf4、Lenti-EFl a -EGFP-tetO_Lin28、Lenti-EFl a -EGFP-tetO_Nanog、Lenti-EFl a -EGFP-1et0_hTert、Lenti-EFl a -EGFP-1et0-SV40T 和Lenti-EFla -rtTA-IRES-EGFP。實施例2、細胞培養(yǎng)2. I、山羊原代耳尖成纖維細胞(PEF)的培養(yǎng)取山羊耳朵，75%酒精清洗后剃毛，浸泡于含雙抗(青霉素、鏈霉素)的PBS中15min，再依次使用PBS，無血清培養(yǎng)基(D-MEM)清洗耳朵數(shù)次，然后將耳朵浸泡于少量含30% FBS的D-MEM中，同時使用無菌剪刀將其剪成小塊，移至培養(yǎng)瓶中，小塊之間保持較小的距離，培養(yǎng)瓶倒置。6-8小時后，補加含30% FBS的D-MEM，正置，此后每天補加少量該培養(yǎng)基，一般3、4天后可明顯觀察到成纖維細胞，約一周后傳代，傳代時使用PBS清洗細胞2次，37°C下0. 25%胰酶消化5min，以10% FBS的D-MEM終止反應(yīng)吹打。首次傳代按I比I或2傳(視細胞量而定)，此后每3至4天傳代，按I比3或4傳，山羊原代耳尖成纖維細胞(PEF)傳10代以上依然有較好的增殖能力。2. 2、其它細胞的培養(yǎng)293T細胞(購自中科院上海生命科學(xué)研究院生化細胞所細胞庫)的培養(yǎng)傳代時37°C下0. 25%胰酶消化5min，使用10% FBS的D-MEM終止反應(yīng)，吹打后按I比8 10傳代。小鼠胚胎成纖維(MEF)細胞根據(jù)文獻(ThomsonJA. , Itskovitz-Eldor J.,Shapiro SS.，et al. Science. Nov 61998 ；282(5391) :1145-1147 及 Xu，C.，et al. NatBiotechnol. 2001,19(10) :971-4)的方法制備，作為滋養(yǎng)層細胞鋪于平板備用。實施例3、病毒包裝3. I、包裝質(zhì)粒的擴增將實施例I中得到的九種鑒定正確的載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌以進行擴增，經(jīng)AxygenAxyPrep plasmid Maxiprep Kit試劑盒(Axygen公司)中抽后,在超凈工作臺中進行純化，即用中抽后質(zhì)粒的十分之一體積的3M NaAC和2倍體積的無水乙醇混勻后，13000rpm離心15min，去上清，使用75%乙醇漂洗，吸去上清，于超凈工作臺中吹干后，使用無菌去離子蒸懼水溶解質(zhì)粒，最后使用分光光度計及凝膠電泳確定質(zhì)粒的濃度。
3. 2、轉(zhuǎn)染按照Invitrogen 公司轉(zhuǎn)染試劑盒(ViraPower Lentiviral ExpressionSystems)的說明書,使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將步驟3. I中的六個慢病毒質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒ViraPower Packaging Mix (Invitrogen公司)共同轉(zhuǎn)染293T細胞。具體步驟為轉(zhuǎn)染實驗前一天鋪293T細胞，使第二天細胞可生長至90%滿，對于一個丁75瓶,取911區(qū) ViraPower Packaging Mix 和 3 u g 病毒質(zhì)粒于 I. 5mL opti-MEM 中，輕輕混勻，另取已搖勻的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑36 U I于另一份I. 5mL opti-MEM中，輕輕混勻后，室溫放置5min，將上述兩份分別含DNA和轉(zhuǎn)染試劑的opti-MEM輕輕混勻，室溫放置20min后將上述混合液至于293T細胞90%滿的T75培養(yǎng)瓶中。按相同的方法轉(zhuǎn)染其它五種慢病毒質(zhì)粒。
3. 3、病毒滴度測定將步驟3. 2中轉(zhuǎn)染獲得的六種病毒分別在24h內(nèi)更換培養(yǎng)基，此后收集轉(zhuǎn)染48h，72h和96h的病毒上清，一般無需進行病毒濃縮，而直接取5 Ul和I Ul上述六種病毒，分別于24孔板中懸浮感染15萬293T細胞，同時加入polybrene,由感染48h后六種病毒感染的293T細胞的GFP情況來確定病毒滴度，可由視野中GFP陽性細胞所占比例估算15萬細胞中GFP陽性總細胞數(shù)，繼而獲知單位體積病毒上清中的病毒顆粒數(shù)，即為相應(yīng)病毒的滴度。實施例4、病毒感染將實施例3包裝的慢病毒，以MOI 5感染5X IO4個山羊原代耳尖成纖維細胞(PEF)，所用病毒的滴度約為5 8X 106IU/mL，實驗分為10組a)實驗組I :8個轉(zhuǎn)錄因子的全組合；b)實驗組 2 8 因子 _SV401arge T (8 因子去掉 SV401arge T)；c)實驗組3 :8因子-hTert (8因子去掉hTert)；d)實驗組4 8因子_0ct4(8因子去掉0ct4)；e)實驗組5 :8因子_Sox2 (8因子去掉Sox2)；f)實驗組6 8因子_cMyc(8因子去掉cMyc)；g)實驗組7 :8因子-Klf4 (8因子去掉Klf4)；h)實驗組8 :8因子-Lin28(8因子去掉Lin28)；i)實驗組9 8因子-Nanog (8因子去掉Nanog)；j)空白對照組僅攜帶有綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒；每組實驗均有6個平行樣，其中3個用于堿性磷酸酶(AP)染色，統(tǒng)計陽性克隆數(shù)，另3個樣用于克隆挑選。感染48小時后，將上述細胞用0. 25%胰酶，37°C下消化5min，計數(shù)后傳代轉(zhuǎn)移至鋪好小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的6孔板中，傳代后24h內(nèi)改用加入10000X DOX的人胚胎干細胞(ES)培養(yǎng)基，隔天換液，待出現(xiàn)克隆后每天換液。在克隆出現(xiàn)12天后，將上述細胞用0. 25%胰酶，37°C下消化5min，計數(shù)后傳代轉(zhuǎn)移至鋪好小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的6孔板中，傳代后24h內(nèi)改用人胚胎干細胞(ES)培養(yǎng)基，持續(xù)天天換液，直至12天左右，形態(tài)好的克隆出現(xiàn)。實施例5、轉(zhuǎn)染后陽件細胞的篩誅
5. I、感染細胞的熒光鏡檢及堿性磷酸酶(AP)染色用熒光顯微鏡觀察實施例4感染后的細胞，發(fā)現(xiàn)感染后48小時有綠色熒光表達。感染7天后，僅第I組和第3組有明顯的細胞聚集，克隆生長代謝很快，形成很大的團塊，無法挑取克隆。在傳代后12天，將克隆用胰酶消化，傳代至新的輻照后的小鼠胚胎成纖維細胞上。繼續(xù)培養(yǎng)，5到6天之后，圓形致密的克隆開始出現(xiàn)。顯微鏡觀察的結(jié)果如圖4所示，其形態(tài)主要有兩種，一類是小鼠胚胎干細胞類(mES-like)克隆，其細胞致密，克隆表面光滑，邊緣平滑，邊界清晰光亮(見轉(zhuǎn)染山羊PEF所得圖4B);另一類克隆中部明顯突起，細胞相對松散，邊緣不夠平滑，邊界相對模糊(圖4A)，為非ES-Iike克隆。傳代第12天對10組實驗下6個平行樣中的3個進行堿性磷酸酶(AP)染色，統(tǒng)計陽性克隆數(shù)，結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，僅第I組和第3組的病毒組合產(chǎn)生了 AP陽性的克隆，兩組的5X IO4個山羊PEF傳代后分別形成19±2個和2±0. 4個AP陽性的iPS細胞集落。
由以上結(jié)果可知山羊要比小鼠、大鼠、人、恒河猴、和豬更難，需要更多的外源轉(zhuǎn)錄因子參與重編程的過程。SV40大T抗原對于山羊的重編程是必需的，沒有SV40大T抗原的參與，甚至不會產(chǎn)生細胞聚集。傳代對編程完善克隆的釋放十分重要，沒有經(jīng)過傳代的細胞產(chǎn)生不了好的克隆。5. 2、陽性細胞的篩選在感染后26天隨機挑選克隆，使用0.25%胰酶37°C下消化5min，吹打為單細胞后，用含10 % SR (血清替代物)+10 % FBS的D-MEM的Knock D-MEM/F12培養(yǎng)液終止反應(yīng)，此后每天更換該培養(yǎng)基，此時細胞增殖很快，每三天可傳一代，每三天按I : 5 10傳代(視克隆總數(shù)而定)至輻照過的滋養(yǎng)層細胞MEF上，此后不斷進行克隆挑選和AP檢測。山羊iPS細胞經(jīng)多次挑克隆和傳代，其形態(tài)逐漸類似于小鼠胚胎干細胞。實施例6、干細胞特件檢泖丨取傳至15代的小鼠成纖維細胞形成的克隆8-3、8-4、8-7、8_9進行以下檢測，以證明其具備干細胞特性。6. I、堿性磷酸酶表達使用Chemicon Alkaline Phosphatase Detection Kit (Millipore 公司)進行染色，具體步驟如下使用PBS清洗細胞兩次，4% PFA (多聚甲醛)室溫固定l_2min，TBST清洗一遍，AP染料(按試劑盒中注明的配制)避光染色15min，TBST再清洗一遍后使細胞浸泡于PBS中。顯微鏡檢測，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，細胞被染成紫紅色，而紫紅色表示細胞具有堿性磷酸酶活性，從而說明反復(fù)挑克隆后的山羊iPS細胞具有很強的堿性磷酸酶活性，進一步地說形成的山羊iPS克隆具有胚胎干細胞特性，即表達堿性磷酸酶。6. 2、山羊iPS細胞的未分化狀態(tài)檢測用realtime PCR方法檢測山羊iPS細胞與誘導(dǎo)前細胞山羊PEF進行對比，分析其未分化基因表達水平。6. 2. I、引物設(shè)計由于未分化的細胞會特異性表達以下基因，包括0ct4、Sox2、Nanog、Q)Hl、Dnmt3b、TDGF、Daxl、Rexl、Sall4，所以可通過檢測這些基因的表達情況得知所獲得的山羊iPS細胞的未分化狀態(tài)。未分化marker引物序列設(shè)計如表2所示，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(其中f表示正向引物，r表示反向引物)。表2未分化marker引物序列設(shè)計表
權(quán)利要求
1.一種山羊可誘導(dǎo)多能干細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 A)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體，所述轉(zhuǎn)錄因子選自0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4,Lin28、Nanog、hTert、SV40 IargeT antigen ； B)采用步驟A)所得慢病毒載體，將所述轉(zhuǎn)錄因子以組合形式感染山羊成體細胞，挑選形態(tài)類似胚胎干細胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合胚胎干細胞特性的細胞克隆，得到山羊可誘導(dǎo)多能干細胞。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述山羊成體細胞為原代耳尖成纖維細胞。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述慢病毒載體以組合形式攜帶的轉(zhuǎn)錄因 子的組合形式為0ct4、Sox2、c_Myc、Klf4、Lin28、Nanog、hTert、SV40 IargeT antigen。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟B)的傳代培養(yǎng)是將山羊iPS克隆按I : 5 10的比例傳至輻照過的小鼠胚胎成纖維細胞上。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟B)的篩選是篩選堿性磷酸酶染色呈陽性的細胞。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟C)山羊可誘導(dǎo)多能干細胞的干細胞多能性鑒定。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述干細胞多能性鑒定包括檢測以下指標 1)堿性磷酸酶表達呈陽性； 2)干細胞表面特異標記SSEA-I (+)、Rexl (+)、SSEA-3 (-)、SSEA-4 (-)、Tra-1-60 (+)、Tra-1-81(+)、E-Cadherin(+)； 3)自然分化形成胚狀體后，外胚層NeuroD(+)、Fibronectin (+),中胚層Myf5 (+)、Enolse3(+) ,VEGFR2 (+)和內(nèi)胚層 DCNl (+)、AFP (+)； 4)隨機分化后，免疫熒光檢測到外胚層Tujl(+)、GFAP(+)，中胚層a-SMA(+)、Myotube (+)，內(nèi)胚層 FoxA2 (+)； 5)山羊可誘導(dǎo)多能干細胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述指標4)形成的畸胎瘤具有外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述山羊可誘導(dǎo)多能干細胞的干細胞多能性鑒定還包括檢測指標6)Nanog基因的啟動子區(qū)域被去甲基化。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述山羊可誘導(dǎo)多能干細胞在撤去DOX后關(guān)閉外源基因表達。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種山羊可誘導(dǎo)多能干細胞的制備方法，包括步驟A)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體，所述轉(zhuǎn)錄因子選自O(shè)ct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28、Nanog；B)采用步驟A)所得慢病毒載體將所述轉(zhuǎn)錄因子以組合形式感染山羊成體細胞，挑選形態(tài)類似胚胎干細胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合胚胎干細胞特性的細胞克隆，得到山羊可誘導(dǎo)多能干細胞。本發(fā)明有助于確立山羊ES細胞建系的最適培養(yǎng)條件和方法；山羊可誘導(dǎo)多能干細胞是山羊基因打靶的良好載體，山羊可誘導(dǎo)多能干細胞將利于揭示山羊各基因功能和復(fù)雜的發(fā)育事件。
文檔編號C12N15/867GK102653774SQ20111005158
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月4日
發(fā)明者任江濤, 何麗夏子, 崔春, 廖靜, 樸永俊, 肖磊, 鮑磊 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院