專利名稱：針對(duì)her-3的抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合蛋白，包括結(jié)合于HER-3的抗體及其結(jié)合片段以及編碼它們的多核苷酸序列。本發(fā)明也提供了用于生產(chǎn)本發(fā)明結(jié)合蛋白的表達(dá)載體和包含該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明還提供了用于診斷和治療與HER-3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或其配體調(diào)蛋白(heregulin)相關(guān)疾病的組合物和方法。
背景技術(shù)：
人類表皮生長(zhǎng)因子受體3 (HER-3，也稱為ErbB!3)是一種受體蛋白酪氨酸激酶，屬于受體蛋白酪氨酸激酶的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)亞家族，該家族還包括HER-1(也稱為 EGFR)、HER-2 和 HER-4 (Plowman 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 87 (1990)，4905-4909 ； Kraus 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 (1989)，9193-9197 ；以及 Kraus 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 (1993)，2900-2904)。與典型的表皮生長(zhǎng)因子受體一樣，跨膜受體 HER-3由+胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ECD)、ECD內(nèi)的二聚體結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(TKD)和C端磷酸化結(jié)構(gòu)域組成。配體調(diào)蛋白(HRG)與HER-3的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且通過促進(jìn)其與其他人類表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)家族成員的二聚化，并且使HER-3的跨膜結(jié)構(gòu)域磷酸化，從而激活受體介導(dǎo)的信號(hào)通路。HER家族成員間的二聚體放大了 HER-3的信號(hào)電位，它既是信號(hào)多樣化的方式也是信號(hào)放大的方式。例如，在HER家族成員中，HER-2/HER-3的異源二聚體誘導(dǎo)了最重要的促有絲分裂信號(hào)中的一個(gè)。HER-3已被發(fā)現(xiàn)在一些類型的癌癥如乳腺癌、胃腸癌和胰腺癌中過表達(dá)。有趣的是，已有研究表明HER-2/HER-3的表達(dá)和癌癥從非侵襲階段發(fā)展到侵襲階段有相關(guān)性 (Alimandi 等人的 Oncogene 10,1813-1821 ；deFazio 等人的 Cancer 87，487-498 ;Naidu 等人的Br. J. Cancer 78，1385-1390)。因此，干擾HER-3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的制劑是令人期望的。已經(jīng)報(bào)道了鼠源或嵌合型HER-3抗體，比如在專利US596851UUS5480968和W003013602 中。最近研究表明，一種針對(duì)HER-2的人源化單克隆抗體赫賽Hercept in ) ，干擾了 HER-2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)人類癌癥有治療效果(Fendly等人的Hybridoma 6， 359-370 ；Hudziak 等人的 MoI. Cell. Biol. 9，1165-1172 ；Stebbing 等人的 Cancer Treat. Rev. 26,287-290)。已表明赫賽打 可以通過兩種不同的機(jī)制起作用，也就是免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞的參與和直接的細(xì)胞毒及凋亡誘導(dǎo)作用。但是，只有那些高表達(dá)HER-2的患者對(duì)赫賽彡丁 的治療反應(yīng)顯著，因此，限制了適合治療的患者數(shù)目。而且，耐藥性的發(fā)展或是腫瘤細(xì)胞中HER-2表達(dá)或其表位序列的改變可能會(huì)使那些有希望被治療的患者不能與抗體反應(yīng)從而消除了其治療作用。因此，需要有更多的靶向治療藥物涉及HER家族的其它成員，如HER-3。附圖簡(jiǎn)要說明

圖1表示了 HER-3在一系列人類癌細(xì)胞系中的表達(dá)程度，表明HER-3在多種人類癌癥均表達(dá)。圖2表示了 FACS分析HER-3抗體與穩(wěn)定表達(dá)HER家族不同成員的Rati細(xì)胞或僅含有空載體的Rati細(xì)胞的結(jié)合情況。圖3表示的是抗體競(jìng)爭(zhēng)bins定位于HER3結(jié)構(gòu)域。圖4表示的是利用本發(fā)明的抗HER-3抗體進(jìn)行間接的FACSkatchard抗體親和分析的結(jié)果。分析表明本發(fā)明的抗HER-3抗體對(duì)表達(dá)于細(xì)胞表面的HER-3具有高親和力和高
結(jié)合常數(shù)。圖5表示的是本發(fā)明的抗HER-3抗體加速了 HER-3的內(nèi)吞作用。圖6a_e表示的是利用本發(fā)明的抗HER-3抗體進(jìn)行的配體競(jìng)爭(zhēng)分析的結(jié)果。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的抗體特異地降低了 [1251]4-服6/[1251]-3-服6與表達(dá)內(nèi)源冊(cè)1 -3的細(xì)胞的結(jié)合。圖7a表示的是利用本發(fā)明的抗HER-3抗體進(jìn)行HER-3磷酸酪氨酸酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)的結(jié)果。本發(fā)明的抗體能夠抑制β-HRG介導(dǎo)的HER-3活化，表現(xiàn)為受體酪氨酸磷酸化程度增加。圖7b表示了利用滴定過的抗體進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖8表示的是利用本發(fā)明的抗HER-3抗體與p42/p44MAP激酶進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。本發(fā)明的抗體能夠降低β -HRG介導(dǎo)的ρ42/ρ44ΜΑΡ-激酶活化，表現(xiàn)為MAP-激酶磷酸化程度增加。圖9表示的是利用本發(fā)明的抗HER-3抗體與磷酸AKT進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。本發(fā)明的抗體能夠降低β-HRG介導(dǎo)的AKT活化，表現(xiàn)為AKT的磷酸化。圖10表示的是本發(fā)明的人抗HER-3抗體抑制了 MCF7細(xì)胞增值。本發(fā)明的抗體抑制了人類癌細(xì)胞中HRG誘導(dǎo)的細(xì)胞增值。圖11表示的是本發(fā)明的人抗HER-3抗體抑制了 MCF7細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。圖lh-i表示的是本發(fā)明的人抗HER-3抗體抑制了非貼壁依賴性細(xì)胞的生長(zhǎng)。圖13表示的是本發(fā)明的人抗HER-3抗體對(duì)T47D人類乳腺癌細(xì)胞的異種移植生長(zhǎng)的抑制。圖14表示的是通過對(duì)小鼠施用抗Her3(Ul_59 and U1-53)或抗EGFR(愛必妥) 抗體，減少了小鼠中BxPC3人類胰腺癌細(xì)胞數(shù)量。圖15表示的是本發(fā)明的人類抗HER-3抗體以及與抗EGFR(愛必妥)的抗體的聯(lián)合，降低了人類胰腺癌細(xì)胞BxPC3的異種移植生長(zhǎng)。圖16表明本發(fā)明的抗體延緩了黑色素瘤細(xì)胞(HT144)在nu/nu小鼠中的生長(zhǎng)。圖17表示的是本發(fā)明的人類HER-3抗體(U1_53，U1_59 and U1-7)降低了人類結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的異種移植生長(zhǎng)。圖18表示的是本發(fā)明的人類抗HER-3抗體(Ul-59，Ul-53 andUl-7)降低了人類肺癌細(xì)胞Calu-3的異種移植生長(zhǎng)。圖19表示的是本發(fā)明的人類抗HER-3抗體(Ul-7，Ul-59 andUl-53)降低了人類胰腺癌細(xì)胞BxPC3的異種移植生長(zhǎng)。
圖20表明本發(fā)明的抗體(U1-59)導(dǎo)致HER-3在BxPC3人類胰腺癌異種移植中受到抑制。發(fā)明_既述本發(fā)明的首要方面涉及一種結(jié)合于HER-3的分離的結(jié)合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種分離的結(jié)合蛋白包括重鏈氨基酸序列，其包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，該CDR選自以下序列組成的群組(a)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的CDRHl ；(b)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的⑶RH2 ；以及(c)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的CDRH3 ；和/或輕鏈氨基酸序列，其包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，所述⑶R選自以下序列組成的群組(d)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRLl ；(e)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRL2 ；以及(f)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRL3。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種分離的結(jié)合蛋白包括重鏈氨基酸序列，其選自以下序列組成的群組SEQ ID Nos :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230 ；和/或
輕鏈氨基酸序列，其選自以下序列組成的群組SEQ ID Nos :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、 90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、 172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的結(jié)合蛋白包括如下所示的重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列SEQ ID NOs :2和4、6和8、10和 12、14 和 16、18 和 20,22 和 24,26 和 28,30 和 32,36 和 38,42 和 44,46 和 48,50 和 52,54 和 56,60 和 58,62 和 64,66 和 68,70 和 72,74 和 76,78 和 82,80 和 82,84 和 86,88 和 90、 92 和 94,96 和 98,100 和 102,104 和 106,108 和 110、112 和 114、116 和 118、122 和 124,126 和 128、130 禾口 132、134 禾口 136，138 禾口 140、142 禾口 144、146 禾口 148、150 禾口 152、154 禾口 156、 158 和 160、162 和 164、166 和 168、170 和 172、174 和 176、178 和 180、182 和 184、186 和 188,190 和 192,194 和 196,198 和 200,202 和 204,206 和 208,210 和 212,214 和 216,218 和 220,222 和 224,226 和 228,230 和 232 ；或者SEQ ID NOs :34、40、60、62或120所示的重鏈氨基酸序列；或者SEQ ID NOs 58或64所示的輕鏈氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明，能與HER-3結(jié)合的分離的結(jié)合蛋白與HER-3胞外部分的至少一個(gè)表位相互作用。這些表位優(yōu)選定位于Ll結(jié)構(gòu)域(第19-184位氨基酸)、S1 (第185-327位氨基酸)和S2結(jié)構(gòu)域(第500-632位氨基酸)或L2結(jié)構(gòu)域(第3觀_499位氨基酸)，其中Ll 結(jié)構(gòu)域是氨基端結(jié)構(gòu)域，Sl和S2結(jié)構(gòu)域是兩個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，L2位于兩個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)。這些表位也可定位于這些結(jié)構(gòu)域的組合區(qū)域，但并不限于Ll和 Sl部分組成的表位。更加優(yōu)選的是這樣一種分離的結(jié)合蛋白，它能夠結(jié)合于成熟的HER-3、 特別成熟的人類HER-3蛋白的1-160，161-358，359-575，1-358和/或359-604位氨基酸殘基形成的三維結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的，本發(fā)明的一種分離結(jié)合蛋白是一種支架蛋白，具有抗體樣的結(jié)合活性或是一種抗體，如抗HER-3的抗體。尤其是，抗HER-3的抗體選自下列抗體組成的群組Ul-I抗體、U1-2抗體、U1-3抗體、U1-4抗體、U1-5抗體、U1-6抗體、U1-7抗體、 U1-8 抗體、U1-9 抗體、U1-10 抗體、Ul-Il 抗體、U1-12 抗體、U1-13 抗體、U1-14 抗體、U1-15 抗體、U1-16抗體、U1-17抗體、U1-18抗體、U1-19抗體、U1-20抗體、U1-21抗體、U1-22抗體、U1-23抗體、U1-24抗體、U1-25抗體、U1-26抗體、U1-27抗體、U1-28抗體、U1-29抗體、 U1-30 抗體、U1-31 抗體、U1-32 抗體、U1-33 抗體、U1-34 抗體、U1-35 抗體、U1-36 抗體、U1-37 抗體、U1-38抗體、U1-39抗體、U1-40抗體、U1-41抗體、U1-42抗體、U1-43抗體、U1-44抗體、U1-45抗體、U1-46抗體、U1-47抗體、U1-48抗體、U1-49抗體、U1-50抗體、U1-51抗體、 U1-52 抗體、U1-53 抗體、Ul-55. 1 抗體、U1-55 抗體、Ul-57. 1 抗體、U1-57 抗體、U1-58 抗體、 U1-59抗體、Ul-61. 1抗體、U1-61抗體、U1-62抗體或者具有其中一種所述抗體的至少一條重鏈或輕鏈的抗體。特別優(yōu)選的是U1-49抗體(SEQ IDNO :42/44)、U1_53抗體(SEQ ID NO M/56)和U1-59抗體(SEQ ID NO :70/7 抗體或是具有其中一種所述抗體的至少一條重鏈或輕鏈的抗體。此外，本發(fā)明的另外實(shí)施方案提供了偶聯(lián)上一個(gè)標(biāo)記基團(tuán)或是效應(yīng)基團(tuán)的分離的結(jié)合蛋白。優(yōu)選的，這種結(jié)合蛋白對(duì)治療過增殖性疾病有用，特別是腫瘤疾病，例如乳腺癌、胃腸癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、涎腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、睪丸癌、軟組織肉瘤、頭頸部癌、其他表達(dá)或過表達(dá)HER-3的癌癥以及腫瘤轉(zhuǎn)移的形成。本發(fā)明的其他方面涉及編碼本發(fā)明結(jié)合蛋白的分離的核酸分子、含有編碼本發(fā)明結(jié)合蛋白的分離的核酸分子的載體和一種宿主細(xì)胞，例如用所述的核酸分子或載體轉(zhuǎn)化 CHO細(xì)胞和NS/0骨髓瘤細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明結(jié)合蛋白的方法，該方法從分泌結(jié)合蛋白的宿主細(xì)胞來制備所述的結(jié)合蛋白。優(yōu)選的，本發(fā)明的結(jié)合蛋白制備自分泌該結(jié)合蛋白的雜交瘤細(xì)胞株或是用編碼本發(fā)明結(jié)合蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞或其他細(xì)胞類型。本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明結(jié)合蛋白的方法，該方法從針對(duì)編碼本發(fā)明結(jié)合蛋白的一種或多種核酸分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物或真菌的組織、產(chǎn)物或分泌物來制備所述的結(jié)合蛋白。優(yōu)選的，本發(fā)明的結(jié)合蛋白制備自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如奶牛、綿羊、兔、 雞或者其他哺乳動(dòng)物或禽類的組織、產(chǎn)物或分泌物，轉(zhuǎn)基因植物如玉米、煙草或其他植物， 或者轉(zhuǎn)基因真菌如曲霉、畢赤酵母或其他真菌種類。本發(fā)明的另一方面涉及一種藥物組合物，其包括作為活性劑的本發(fā)明的至少一種結(jié)合蛋白與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑混合成的一種活性劑。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物另外包括至少一種其他活性劑，例如至少一種抗腫瘤劑。本發(fā)明的其他方面還涉及本發(fā)明的至少一種結(jié)合蛋白，任選的至少一種其他活性劑，例如至少一種抗腫瘤劑與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑混合在制備藥物組合物的種的用途。這種藥物組合物適用于診斷、預(yù)防或治療一種過增殖性疾病，特別是腫瘤疾病，如乳腺癌、胃腸癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、涎腺癌、肺癌、 腎癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、或其他表達(dá)或過表達(dá) HER-3的癌癥以及腫瘤轉(zhuǎn)移形成。此外，本發(fā)明另一方面涉及診斷與HER-3表達(dá)相關(guān)的疾病或狀況的一種方法，其中包括將含有至少一種本發(fā)明的結(jié)合蛋白與樣品接觸，并檢測(cè)HER-3的存在。優(yōu)選的疾病或狀況包括上面提及的過增殖性疾病。本發(fā)明的另一方面是在有需要的患者身上預(yù)防或治療與HER-3表達(dá)相關(guān)的疾病或狀態(tài)的一種方法，其中包括對(duì)患者施用有效量的本發(fā)明的至少一種結(jié)合蛋白，和任選的至少一種其他活性劑，例如至少一種抗腫瘤劑。優(yōu)選的患者是哺乳動(dòng)物患者，更優(yōu)選的是人類患者。優(yōu)選的HER-3表達(dá)相關(guān)的疾病或狀況是上面提及的過增殖性疾病。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及診斷、預(yù)防或治療與HER-3表達(dá)相關(guān)的疾病或狀況的一種試劑盒，其中包括至少一個(gè)本發(fā)明的結(jié)合蛋白和/或核酸分子和/或載體。任選的是， 本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包含至少一種其他活性劑，例如至少一種抗腫瘤劑。優(yōu)選的，與 HER-3表達(dá)相關(guān)的疾病或狀況是上面提及的過增殖性疾病。詳細(xì)說明本發(fā)明的首要方面涉及一種結(jié)合至HER-3的分離的結(jié)合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的結(jié)合蛋白包括重鏈氨基酸序列，其包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，該CDR選自以下序列組成的群組
(a)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的CDRHl ；(b)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的CDRH2 ；以及(c)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的CDRH3 ；和/或輕鏈氨基酸序列，其包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，該CDR選自以下序列組成的群組(d)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRLl ；(e)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRL2 ；以及(f)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRL3。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的結(jié)合蛋白包括重鏈氨基酸序列，其選自以下序列組成的群組SEQ ID Nos :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230 ；和/或一條輕鏈氨基酸序列，選自以下序列組成的群組SEQ ID Nos :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、 90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、 172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的結(jié)合蛋白包括如下所示的重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列SEQ ID NOs :2 和 4、6 和 8、10 和 12、14 和 16、18 和 20、22 和 24J6 和 28、30 和 32、36 和 38,42 和 44,46 和 48,50 和 52,54 和 56,60 和 58,62 和 64,66 和 68,70 和 72,74 和 76,78 和 82,80 和 82,84 和 86,88 和 90,92 和 94,96 和 98、100 和 102、104 和 106、108 和 110、112 和 114、116 和 118、122 和 124、126 和 128、130 和 132、134 和 136，138 和 140、142 和 144、146 和 148、150 和 152、154 和 156、158 和 160、162 和 164、166 和 168、170 和 172、174 和 176、178 和 180、182 和 184、186 和 188、190 和 192、194 和 196、198 和 200,202 和 204、 206 和 208,210 和 212,214 和 216,218 和 220,222 和 224,226 和 228,230 和 232 ；或者SEQ ID NOs :34、40、60、62或120所示的重鏈氨基酸序列；或者SEQ ID NOs 58或64所示的輕鏈氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明的結(jié)合蛋白的氨基酸并不僅限于20種常見氨基酸(見 Immunology-Α Synthesis (第二版，E. S. Golub 禾口 D. R. Gren, Eds. , Sinauer Associates, Sunderland,Mass. (1991))，其通過引用被納入本文)。例如，氨基酸分子可能包括20種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(如D-型氨基酸)、非天然氨基酸如α _，α -雙取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸以及其他非常見氨基酸。非常見氨基酸也可作為本發(fā)明結(jié)合蛋白的合適組分，其實(shí)例包括4-羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、 ε -N-乙酰基賴氨酸、0-磷酸絲氨酸、N-乙?；z氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、 5-羥基賴氨酸、σ -N-甲基精氨酸和其他類似氨基酸基亞氨基酸，如4-羥基脯氨酸。此外，根據(jù)本發(fā)明，如果變異維持在SEQ ID NOs :1_232所示的氨基酸序列中的至少75%，較優(yōu)選為至少80%、90%、95%，最優(yōu)選為99%，那么SEQ ID NOs 1-232所示的氨基酸序列中的少量變異預(yù)期也包含在本發(fā)明中。這些變異可能發(fā)生在框架區(qū)(也就是在互補(bǔ)決定區(qū)外)、互補(bǔ)決定區(qū)內(nèi)、或者同時(shí)在框架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)內(nèi)。SEQ IDNOs :1-232所示的氨基酸序列中的優(yōu)選變異，也就是刪除、插入和/或替代至少一個(gè)氨基酸，發(fā)生在靠近功能結(jié)構(gòu)域的邊界。結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域可以通過核酸和/或氨基酸數(shù)據(jù)與公共或?qū)Ｓ行蛄袛?shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)來鑒定。計(jì)算機(jī)比對(duì)方法可以用來判別序列基序或預(yù)測(cè)出現(xiàn)在其他已知結(jié)構(gòu)和 /或功能的結(jié)合蛋白的蛋白構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。判別折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白序列的方法是已知的。參考 Bowie 等人的 Science 253,164 (1991) ^Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed. , W. H. Freeman 禾口 Company, New York (1984))、Introduction to Protein Structure (C. Branden 禾口 J. Tooze, eds. , Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))、和Thornton等人的Nature 354，105 (1991)，其通過引用被納入本文。因此， 根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠識(shí)別序列基序和結(jié)構(gòu)構(gòu)象，它們可能用于定義結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域。SEQ ID NOs :1_174和1-232所示的氨基酸序列中特別優(yōu)選的變異是那些能夠?qū)е陆Y(jié)合蛋白降低對(duì)蛋白水解或氧化敏感性、改變糖基化形式或者改變結(jié)合親和力或者賦予或修飾其他物化或功能特性。尤其是，保守氨基酸的替代也是預(yù)期的。保守的替代是發(fā)生在與側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸的家族內(nèi)。優(yōu)選的氨基酸家族如下酸性家族=天冬氨酸、谷氨酸； 堿性家族=賴氨酸、精氨酸、組氨酸；非極性家族=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及無(wú)電荷極性氨基酸家族=甘氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。較優(yōu)選的氨基酸家族是脂肪羥基家族=絲氨酸和蘇氨酸；含酰胺家族=天冬酰胺和谷氨酰胺；脂肪族家族=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；以及芳香族氨基酸=苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，可以合理的預(yù)測(cè)，亮氨酸用異亮氨酸或纈氨酸、冬氨酸用谷氨酸、蘇氨酸用絲氨酸的單獨(dú)的替代；或者一種氨基酸用一種結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸的相似的替代不會(huì)對(duì)結(jié)合蛋白的結(jié)合或特性產(chǎn)生主要影響，特別是當(dāng)替代不包括框架區(qū)位點(diǎn)的氨基酸。但是，所有其他所有可能的氨基酸替代也預(yù)期屬于本發(fā)明。一種氨基酸的改變是否產(chǎn)生一種有功能的結(jié)合蛋白，也就是說，產(chǎn)生的結(jié)合蛋白能夠與 HER-3結(jié)合并降低HER家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以很容易用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)或 FACS分析產(chǎn)生的蛋白結(jié)合HER-3的特異活性或者體內(nèi)或體外功能分析來確定。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的結(jié)合蛋白至少與HER-3胞外部分的至少一個(gè)表位相互作用。這些表位優(yōu)選定位于Ll結(jié)構(gòu)域(第19-184位氨基酸)，Sl (第185-327位氨基酸)和 S2結(jié)構(gòu)域(第500-632位氨基酸)或L2結(jié)構(gòu)域(第3觀_499位氨基酸)，或位于HER-3結(jié)構(gòu)域的組合，其中Ll結(jié)構(gòu)域是氨基端結(jié)構(gòu)域，Sl和S2結(jié)構(gòu)域是兩個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，它們位于L2結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)。這些表位也可定位于這些結(jié)構(gòu)域的組合區(qū)域，但并不限于 Ll和Sl部分組成的表位。此外，本發(fā)明的結(jié)合蛋白的進(jìn)一步特征是其能結(jié)合于HER-3并降低了 HER-3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)本發(fā)明，HER-3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的降低可能，例如會(huì)由于 HER-3的下調(diào)所致，從而導(dǎo)致至少HER-3分子從細(xì)胞表面的部分消失；或者由于HER-3基本上以一種非活性形式穩(wěn)定在細(xì)胞表面，也就是與非穩(wěn)定形式相比表現(xiàn)出較低信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種形式?；蛘?，HER-3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的降低可能也是由于影響(例如降低或者抑制)了配體或HER家族的另一成員與HER-3的結(jié)合以及GRB2與HER-2或SHC的結(jié)合，其通過抑制受體酪氨酸磷酸化、AKT磷酸化、Ρ (2酪氨酸磷酸化或ERK2磷酸化，或者通過降低腫瘤的侵襲性來實(shí)現(xiàn)?；蛘撸琀ER-3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的降低可能也是由于影響(例如降低或者抑制) 了 HER-3與其他HER家族成員形成二聚體。其他實(shí)施例中的一個(gè)實(shí)施例可以是降低或抑制了 HER-3-EGFR蛋白復(fù)合物的形成。優(yōu)選的，本發(fā)明的結(jié)合蛋白是一種支架蛋白，具有抗體樣結(jié)合活性或是一種抗體， 也就是抗HER-3的抗體。本發(fā)明文本中所使用的術(shù)語(yǔ)“支架蛋白”是指含有暴露的表面區(qū)域的一條多肽鏈或蛋白，其對(duì)氨基端插入、替代或缺失高度耐受。根據(jù)本發(fā)明可以使用的支架蛋白的實(shí)例是金黃色葡萄球菌的A蛋白、大菜粉蝶的膽素結(jié)合蛋白、或者其他lipocalins、錨蛋白重復(fù)蛋白及人纖連蛋白(見綜述Binz and Pluckthun, Curr Opin Biotechnol，16，459-69)。支架蛋白的工程化可視為移植或整合親和功能到穩(wěn)定折疊蛋白的結(jié)構(gòu)框架表面或內(nèi)部。根據(jù)本發(fā)明，親和功能是指蛋白結(jié)合親和力。支架可以結(jié)構(gòu)上獨(dú)立于賦予結(jié)合特性的氨基酸序列。一般說來，顯現(xiàn)出適合發(fā)展這種人工親和試劑的蛋白可通過合理的、或最常見的、組合蛋白工程技術(shù)如針對(duì)HER-3篩選，采用純化的蛋白或展示在細(xì)胞表面的蛋白，作為結(jié)合試劑用于人工支架庫(kù)體外展示，這些技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(Skerra，J. Mol. Recog.，2000 ；Binz and Plilckthim，2005)。此外，具有抗體一樣結(jié)合活性的支架蛋白可以來源于含有該支架結(jié)構(gòu)域的受體多肽，其可以用受體多肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域移植并賦予包含這種支架結(jié)構(gòu)域的受體多肽具有供體多肽的結(jié)合特性。所述的插入結(jié)合域可以是，例如，抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)， 特別是抗HER-3抗體的CDR。插入可以是通過各種本領(lǐng)域抑制的方法實(shí)現(xiàn)，例如，多肽合成、 編碼氨基酸的核酸合成以及通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種重組方法。此外，本文中所使用術(shù)語(yǔ)“抗體”或“抗HER-3抗體”指一種單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、人源化抗體(Jones等人，Nature321 (1986)，522-525 ；Riechmann等人，Nature 332 (1988)，323-329 ；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992)，593-596)、嵌合抗體(Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 81 (1984)，6851-6855)、由至少兩個(gè)抗體組成的多特異抗體(例如雙特異抗體)或其抗體片段。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”包括上述提及的抗體的任意部分，優(yōu)選的是它們的抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的范例包括Fab 片段、Fab'片段、F(ab' )2 片段、Fv 片段、雙抗體(Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 (1993)，6444-6448)、單鏈抗體分子(PlUckthun in :The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, EDS,Springer Verlag, N. Y. (1994), 269-315)和其他片段，只要表現(xiàn)出所需的結(jié)合HER-3能力。此外，本文中所使用術(shù)語(yǔ)“抗體”或“抗HER-3抗體”可以包含抗體樣分子包括工程化抗體亞結(jié)構(gòu)域或天然發(fā)生的抗體變異體。這些抗體樣分子可以是單結(jié)構(gòu)域抗體如單一的 VH或VL結(jié)構(gòu)域，其或者是天然來源如camel ids (Muyldermans等人，Reviews in Molecular Biotechnology 74，277-302)，或者通過人類、camelids或其他物種體外展示庫(kù)獲得(Holt 等人，Trends Biotechnol.，21，484-90)。根據(jù)本發(fā)明，“Fv片段”是包含完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。 這一區(qū)域由一條重鏈或輕鏈通過緊密的非共價(jià)結(jié)合形成的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中每個(gè)可變區(qū)的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)相互作用確定了二聚體的表面抗原結(jié)合位點(diǎn)。總的說來，這六個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)賦予了抗體的抗原結(jié)合特性。但是，即使單獨(dú)一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或者包含僅三個(gè)抗原特異的互補(bǔ)決定區(qū)的半個(gè)Fv片段)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管通常親和力要比完整結(jié)合位點(diǎn)低?！癋ab片段”也包括輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū) (CHl)。“Fab片段”不同于與“Fab'片段”，其在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基端添加了一些殘基， 包括來源于抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸?！癋(ab' )2”最初產(chǎn)生于一對(duì)“Fab'片段”， 其中間含有鉸鏈半胱氨酸。制備這些抗體片段的方法如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗HER-3抗體是IgA-、IgD-, IgE-, IgG-或IgM-類型，優(yōu)選的是IgG-或IgM-類型，包括(但不限于)IgGl-、IgG2_、IgG3_、 IgG4-、IgMl-和IgM2類型。在最優(yōu)選實(shí)施例中，抗體是IgGl-、IgG2_、或IgG4_類型。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明抗HER-3的抗體是針對(duì)HER-3胞外結(jié)構(gòu)域(EOT)產(chǎn)生的抗HER-3抗體。在某些方面，例如與作為治療候選物的抗HER-3抗體的產(chǎn)生有關(guān)，理想的是本發(fā)明的抗HER-3抗體能夠固定補(bǔ)體并參與補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)。許多抗體同種型能夠相同，包括(但不限于)下列鼠IgM,鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG3、人IgM、人IgGl、人lgG3 和人IgA。應(yīng)當(dāng)了解，產(chǎn)生的抗體最初不需要具有這種同種型，相反，產(chǎn)生的抗體可以具有任意同種型，這種抗體可以是轉(zhuǎn)變的同種型，其通過在合適的表達(dá)載體中，用本領(lǐng)域熟悉的傳統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，將分子克隆的V區(qū)域基因或cDNA附加到分子克隆的恒定區(qū)基因或cDNA分子中，然后通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)在宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體。這種同種型轉(zhuǎn)變的抗體也可具有Fc區(qū)域，其已經(jīng)通過分子工程來實(shí)現(xiàn)具有比自然發(fā)生的變異體更好的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(Idusogie等，JImmunol.，166，2571-2575)，并可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)。這些技術(shù)包括直接重組技術(shù)的使用(見美國(guó)專利No. 4，816，397)、細(xì)胞融合技術(shù)(見美國(guó)專利No s. 5，916，771和6，207，418)等等。在細(xì)胞融合技術(shù)中，制備了具有任何想要的同種型重鏈的骨髓瘤或其他細(xì)胞株如CH0，制備了具有的輕鏈的其他骨髓瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞株例如CH0。這些細(xì)胞然后可以被融合，表達(dá)完整抗體細(xì)胞株就可以被分離到。作為一個(gè)例子，一種人抗-HER-3 IgG4抗體，具有想要的結(jié)合于HER-3抗原的能力，可以通過簡(jiǎn)單的同種型轉(zhuǎn)變來產(chǎn)生人IgM、人IgGl或IgG3同種型，同時(shí)仍具有相同的可變區(qū) (其定義了抗體的特異性和一些親和性)。這樣的分子然后可能能夠固定補(bǔ)體和參與補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒。此外，也比較理想的是，本發(fā)明的抗HER-3抗體能夠結(jié)合于效應(yīng)細(xì)胞(如單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK))的Fc受體，并參與抗體依賴的細(xì)胞毒作用(ADCC)。有許多抗體的同種型能夠有同樣的功能，包括(但不限于)下列鼠源IgGh、鼠源IgG2b、鼠源IgG3、 人IgGl和人IgG3。應(yīng)當(dāng)了解的是，產(chǎn)生的抗體最初不需要具有這種同種型，相反，產(chǎn)生的抗體可以具有任意同種型，這種抗體可以是轉(zhuǎn)變的同種型，其通過在合適的表達(dá)載體中，用本領(lǐng)域熟悉的傳統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，將分子克隆的V區(qū)域基因或cDNA附加到分子克隆的恒定區(qū)基因或cDNA分子中，然后通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)在宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體來實(shí)現(xiàn)。這種同種型轉(zhuǎn)變的抗體也可具有Fc區(qū)域，其已經(jīng)通過分子工程使具有比自然發(fā)生的變異體更好的抗體依賴的細(xì)胞毒作用(Shields等人，J Biol Chem.，276，6591-6604)，并可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)。這些技術(shù)包括直接重組技術(shù)的使用(見美國(guó)專利 No. 4，816，397)、細(xì)胞融合技術(shù)(見美國(guó)專利No s. 5，916，771和6，207，418)等等。在細(xì)胞融合技術(shù)中，制備了具有任何想要的同種型重鏈的骨髓瘤或其他細(xì)胞株如CH0，制備了具有的輕鏈的其他骨髓瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞株例如CH0。這些細(xì)胞然后可以被融合，表達(dá)完整抗體細(xì)胞株就可以被分離到。作為一個(gè)例子，一種人抗-HER-3 IgG4抗體，具有想要的結(jié)合于 HER-3抗原的能力，其可以通過簡(jiǎn)單的同種型轉(zhuǎn)變來產(chǎn)生人IgGl或IgG3同種型，同時(shí)仍具有相同的可變區(qū)(其定義了抗體的特異性和一些親和性)。這樣的分子然后可能能夠與效應(yīng)細(xì)胞的Fc γ R結(jié)合并能夠參與抗體依賴的細(xì)胞毒作用。此外，根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)了解的是，本發(fā)明的抗HER-3抗體是一種全人或人源化抗體。人類抗體避免了異種抗體(例如，具有鼠源或大鼠來源的可變區(qū)和/或恒定區(qū)的抗體) 引起的某些問題。異種來源的蛋白如鼠源或大鼠來源的蛋白可導(dǎo)致患者針對(duì)抗體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，接著通過抗體中和以及/或嚴(yán)重的、甚至威脅生命的變態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致抗體的快速清除、失去治療效果。優(yōu)選的，本發(fā)明的抗HER-3抗體選自以下抗體組成的群組Ul-I抗體、U1-2抗體、U1-3抗體、U1-4抗體、U1-5抗體、U1-6抗體、U1-7抗體、 U1-8 抗體、U1-9 抗體、U1-10 抗體、Ul-Il 抗體、U1-12 抗體、U1-13 抗體、U1-14 抗體、U1-15 抗體、U1-16抗體、U1-17抗體、U1-18抗體、U1-19抗體、U1-20抗體、U1-21抗體、U1-22抗體、U1-23抗體、U1-24抗體、U1-25抗體、U1-26抗體、U1-27抗體、U1-28抗體、U1-29抗體、 U1-30 抗體、U1-31 抗體、U1-32 抗體、U1-33 抗體、U1-34 抗體、U1-35 抗體、U1-36 抗體、U1-37 抗體、U1-38抗體、U1-39抗體、U1-40抗體、U1-41抗體、U1-42抗體、U1-43抗體、U1-44抗體、U1-45抗體、U1-46抗體、U1-47抗體、U1-48抗體、U1-49抗體、U1-50抗體、U1-51抗體、 U1-52 抗體、U1-53 抗體、Ul-55. 1 抗體、U1-55 抗體、Ul-57. 1 抗體、U1-57 抗體、U1-58 抗體、 U1-59 抗體、Ul-61. 1 抗體、U1-61 抗體、U1-62 抗體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白偶聯(lián)上了一個(gè)標(biāo)記基團(tuán)。這種結(jié)合蛋白特別適合于診斷應(yīng)用。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記基團(tuán)”是指一種可檢測(cè)的標(biāo)記，例如放射性標(biāo)記的氨基酸或生物素化部分，其可以通過標(biāo)記的抗生物素蛋白來檢測(cè) (例如結(jié)合上熒光標(biāo)記的鏈霉親和素或可使用光學(xué)或比色方法來檢測(cè)的酶活性)。用來標(biāo)記多肽或糖蛋白如抗體的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法，可以用于完成本發(fā)明。適合的標(biāo)記基團(tuán)的實(shí)例包括(但不限于)下列放射性同位素或放射性核素(如M、14C、15N，、35S、 9°Y、99TC、mIn、125I、mI)、熒光基團(tuán)(例如FITC、羅丹明、鑭系無(wú)機(jī)發(fā)光材料)、酶基團(tuán)(例如辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶、熒光酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、生物素基團(tuán)、 或者可由第二報(bào)告體識(shí)別的預(yù)定多肽表位(例如亮氨酸拉鏈型配對(duì)序列、第二抗體的結(jié)合位置、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)。在某些實(shí)施方案中，可能想到的是，標(biāo)記基團(tuán)是利用不同長(zhǎng)度的間隔臂連接的，以降低潛在的空間位阻。可選的，在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以偶聯(lián)到一個(gè)效應(yīng)基團(tuán)上。這種結(jié)合蛋白特別適合于治療應(yīng)用。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)基團(tuán)”系指細(xì)胞毒基團(tuán)如放射性同位素或放射性核素、毒素、治療基團(tuán)或本領(lǐng)域熟知的其他效應(yīng)基團(tuán)。合適的效應(yīng)基團(tuán)的實(shí)例是放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N，、35S、9°Y、99TC、mIn、125I、mI)、 加里剎霉素、海兔毒素類似物如auristatins、以及化療試劑如geldanamycin和美登素衍生物，包括DM1。在某些實(shí)施方案中，可能想到的是，效應(yīng)基團(tuán)是利用不同長(zhǎng)度的間隔臂連接的，以降低潛在的空間位阻。本發(fā)明的一個(gè)次要方面涉及制備本發(fā)明分離的結(jié)合蛋白的過程，包括從分泌本結(jié)合蛋白的宿主細(xì)胞中制備本結(jié)合蛋白的步驟。根據(jù)本發(fā)明，可使用的宿主細(xì)胞是雜交瘤細(xì)胞；真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如倉(cāng)鼠、兔、大鼠、豬、小鼠或其他動(dòng)物細(xì)胞；植物細(xì)胞； 真菌細(xì)胞，例如釀酒酵母、畢赤酵母；原核細(xì)胞如大腸桿菌；或者本領(lǐng)域熟知的其他細(xì)胞， 用來生產(chǎn)結(jié)合蛋白。從宿主細(xì)胞中用于制備和分離結(jié)合蛋白(如支架蛋白或者抗體)的各種方法是本領(lǐng)域熟知的，可用來實(shí)施本發(fā)明。此外，用于制備結(jié)合蛋白片段(如支架蛋白片段或抗體片段)的方法，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化、現(xiàn)代克隆技術(shù)、單鏈抗體
( Pluckthun :The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore,EDS,Springer Verlag,N. Y. (1994)，269-315)和雙抗體(Hoilinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (1993)，6444-6448)，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可用來實(shí)施本發(fā)明。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白制備于分泌該結(jié)合蛋白的雜交瘤細(xì)胞。見 Kdhler 等人的 Nature 256 (1975), 495.在本發(fā)明的一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白通過重組制備，其中在宿主細(xì)胞中優(yōu)化或/和放大表達(dá)結(jié)合蛋白、并從所述的細(xì)胞中分離該結(jié)合蛋白。為了這個(gè)目的，在合適的條件下宿主細(xì)胞用編碼結(jié)合蛋白的DNA或含有編碼結(jié)合蛋白DNA的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，以產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合蛋白。參見如美國(guó)專利No. 4，816，567。優(yōu)選的宿主細(xì)胞可以是CHO細(xì)胞、NS/0雜交瘤細(xì)胞、人胚腎293細(xì)胞、大腸桿菌和釀酒酵母。關(guān)于那些是抗體的結(jié)合蛋白，這些抗體可以從遺傳工程化的動(dòng)物產(chǎn)生全人抗體或者從噬菌體、酵母、核糖體或大腸桿菌抗體展示庫(kù)中制備。參見例如=Clacks0n等人， Nature 352 (1991)，624-628，Marks 等人，J. Mol. Biol. 222 (1991)，581-597，F(xiàn)eldhaus and Siegel J Immunol Methods. 290,69-80, Groves and Osbourn, Expert Opin Biol Ther.,
145,125-135 and Jostock and Dubel, Comb Chem High Throughput Screen.8，127—133。人類抗體避免和具有鼠源或大鼠可變和/或恒定區(qū)的抗體相關(guān)的問題。存在這些鼠源或大鼠來源的蛋白會(huì)導(dǎo)致這些抗體被患者快速清除或?qū)е禄颊哚槍?duì)這種抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。為了避免使用鼠源或大鼠來源的抗體，全人抗體可經(jīng)由導(dǎo)入有功能的人類抗體座位到嚙齒類動(dòng)物、其他哺乳動(dòng)物或動(dòng)物產(chǎn)生，以使該嚙齒類動(dòng)物、其他哺乳動(dòng)物或動(dòng)物產(chǎn)生全人抗體。產(chǎn)生完整人類抗體的方法是通過使用XEN0M0USE 株小鼠，其已被工程化含有人類重鏈座位和K -輕鏈座位的2451Λ和1901Λ大小的種系構(gòu)型片段。其他XenoMouse 株小鼠含有人類重鏈座位和κ-輕鏈座位的9801Λ和8001Λ大小的種系構(gòu)型片段。還有其他XenoMouse株小鼠含有人類重鏈座位和κ -輕鏈座位的9801Λ和8001Λ大小的種系構(gòu)型片段加上7401Λ大小種系構(gòu)型的完整的人類λ -輕鏈座位。見Mendez等人的Nature Genetics 15:146-156(1997)和 Green 和 Jakobovits J. Exp. Med. 188 :483-495(1998)。 XENOMOUSE 株小鼠可從 Abgenix，Inc. (Fremont, CA)獲得。XENOMOUSE 小鼠的生產(chǎn)深入討論和說明于下列美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào) 07/466，008，申請(qǐng)于 1990 年 1 月 12 日、07/610，515，申請(qǐng)于 1990 年 11 月 8 日、07/919，297， 申請(qǐng)于1992年7月24日、07/922，649，申請(qǐng)于1992年7月30日、08/031，801，申請(qǐng)于1993 年3月15日、08/112，848，申請(qǐng)于1993年8月27日、08/234，145，申請(qǐng)于1994年4月28日、 08/376，279，申請(qǐng)于 1995 年 1 月 20 日,08/430, 938，申請(qǐng)于 1995 年 4 月 27 日,08/464, 584， 申請(qǐng)于1995年6月5日、08/464，582，申請(qǐng)于1995年6月5日、08/463，191，申請(qǐng)于1995 年6月5日、08/462，837，申請(qǐng)于1995年6月5日、08/486，853，申請(qǐng)于1995年6月5日、 08/486，857，申請(qǐng)于 1995 年 6 月 5 日、08/486，859，申請(qǐng)于 1995 年 6 月 5 日、08/462，513， 申請(qǐng)于1995年6月5日、08/724，752，申請(qǐng)于1996年10月2日、和08/759,620，申請(qǐng)于 1996年12月3日；美國(guó)專利
發(fā)明者B·拉丁斯基, D·弗里曼, E·伯吉斯, M·特里德, M·羅瑟, S·哈特曼 申請(qǐng)人:U3制藥有限公司, 安進(jìn)公司