專利名稱：一種利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)l-乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物質(zhì)利用開發(fā)領(lǐng)域，具體涉及一種無需額外添加酸堿調(diào)控pH，直接利用堿性生物質(zhì)殘?jiān)还奘桨l(fā)酵生產(chǎn)纖維素L-乳酸的方法。
背景技術(shù)：
乳酸(lactic acid)又稱2-羥基丙酸，是一種重要的多用途有機(jī)酸，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化工等行業(yè)。由于乳酸含有一個不對稱的碳原子，可分為L型和D型兩種。其中尤以L-乳酸應(yīng)用范圍廣泛，生產(chǎn)研究受到普遍重視。工業(yè)上乳酸的生產(chǎn)有發(fā)酵法和化學(xué)法?；瘜W(xué)法是以乙醛和氫氰酸為原料合成的， 生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重，且難于合成單一構(gòu)型的L-乳酸，目前已逐漸被綠色環(huán)保的微生物發(fā)酵法所取代。微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的優(yōu)勢明顯，原料廉價，生產(chǎn)工藝更加清潔，生產(chǎn)效率更高，但傳統(tǒng)的乳酸發(fā)酵生產(chǎn)主要以淀粉質(zhì)和糖蜜為原料，原料成本在生產(chǎn)總成本中占有很大的比例，這在一定程度上限制了整個乳酸工業(yè)及聚乳酸行業(yè)的發(fā)展。我國雖然是世界主要糧食生產(chǎn)國，但由于飲食結(jié)構(gòu)以淀粉類為主，糧食問題依然緊張，利用淀粉類原料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸從長久看存在“與民爭糧”的局面。因此，我國乳酸生產(chǎn)必須具備本國特色， 利用木質(zhì)纖維素為主的生物質(zhì)資源生產(chǎn)乳酸具有重要的經(jīng)濟(jì)與社會意義。發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸常用的微生物有乳酸菌和根霉。使用乳酸菌發(fā)酵為同型厭氧發(fā)酵，能耗很低，糖酸轉(zhuǎn)化率理論值為100%，因而生產(chǎn)成本較低。近來，歐美各國的普拉克公司、ADM公司、卡吉爾公司為了降低生產(chǎn)成本，均采用了細(xì)菌發(fā)酵。細(xì)菌發(fā)酵的缺點(diǎn)是營養(yǎng)需求復(fù)雜，需多種營養(yǎng)因子，如氨基酸、維生素和礦物質(zhì)；此外，細(xì)菌發(fā)酵L-乳酸時因易混入產(chǎn)生消旋酶的其他菌，使所產(chǎn)的L-乳酸易發(fā)生消旋，光學(xué)純度不高。根霉發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸特點(diǎn)為發(fā)酵營養(yǎng)要求簡單，產(chǎn)物為高光學(xué)純度的L-乳酸，菌體大，容易分離，且能產(chǎn)生高活性的淀粉酶、果膠酶甚至是少量纖維素酶，因此在木質(zhì)纖維素生產(chǎn)L-乳酸研究中被廣泛使用。但是米根霉菌的乳酸產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率低于乳酸細(xì)菌，并且產(chǎn)物中含有大量副產(chǎn)物，給乳酸的提取和精制帶來很大困難；根霉菌在發(fā)酵過程中需要通氣攪拌，使得動力消耗增加， 生產(chǎn)成本上升。基于上述原因，近年來芽孢桿菌以其發(fā)酵溫度高、不易染菌和營養(yǎng)要求低的優(yōu)勢逐漸吸引更多研究者的關(guān)注。對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，部分凝結(jié)芽孢桿菌具有己糖、戊糖全糖發(fā)酵生產(chǎn)高純度L-乳酸的能力，美國專利文獻(xiàn)號US2005/0250192A1中記載了能夠利用葡萄糖和木糖生產(chǎn)乳酸的多株凝結(jié)芽孢桿菌，如Mrain 36D1可以耐熱、耐酸，其利用純葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸報道產(chǎn)量為25. 2g/L ；純木糖發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸報道產(chǎn)量23. 4g/L ；利用甘蔗渣還原糖(主要為葡萄糖和木糖)為底物報道產(chǎn)量為55. 5g/L。中國專利文獻(xiàn)號 20100176868. 9中記載了凝結(jié)芽孢桿菌DSM 23183和DSM 23184可以直接利用五碳糖和六碳糖發(fā)酵生產(chǎn)高濃度L-乳酸。因此，利用凝結(jié)芽孢桿菌同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸既可以通過酶解和發(fā)酵同步解除糖對酶解的抑制，又可以充分利用生物質(zhì)原料中的纖維素和半纖維素，實(shí)現(xiàn)己糖和戊糖的同步發(fā)酵，目前鮮見報道。
另外，乳酸發(fā)酵生產(chǎn)中一個重要障礙是發(fā)酵過程中乳酸的積累不僅會引起終產(chǎn)物抑制，還會導(dǎo)致PH下降進(jìn)一步抑制乳酸發(fā)酵和細(xì)胞生長。為了克服這一問題，工業(yè)乳酸或乳酸鹽發(fā)酵過程通常需要添加堿性中和劑維持發(fā)酵PH，并及時將游離乳酸從發(fā)酵液中移除。因此，乳酸發(fā)酵生產(chǎn)中堿性中和劑的用量是導(dǎo)致乳酸生產(chǎn)成本較高的重要因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種低成本、高得率的利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn) L-乳酸的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明技術(shù)方案的理論基礎(chǔ)如下生物質(zhì)堿處理是生物質(zhì)酶解糖化前一種常見的預(yù)處理方法。堿處理后獲得的廢液為富含木質(zhì)素的堿性溶液，通常需要酸中和后也能達(dá)到廢水排放要求，但由于富含堿性物質(zhì)可以直接用于乳酸發(fā)酵過程的PH調(diào)控，這樣不僅發(fā)酵工段無需額外流加乳酸中和劑，減少乳酸發(fā)酵過程中的堿耗，還可以減少堿預(yù)處理工段的廢水排放，降低污水處理費(fèi)用；堿處理殘?jiān)鼮楦缓w維素和半纖維素的植物纖維渣，由于去除了一部分木質(zhì)素，易于為纖維降解酶水解。利用凝結(jié)芽孢桿菌在厭氧條件下可以同步利用木糖和葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，而且發(fā)酵溫度和PH與通常纖維酶水解反應(yīng)條件基本吻合的特性，通過簡單的直接添加纖維降解酶就可以實(shí)現(xiàn)同步糖化發(fā)酵解除糖類物質(zhì)積累，從而達(dá)到提高纖維素轉(zhuǎn)化率和乳酸得率的目的，同時較高的發(fā)酵溫度和厭氧條件具備了生料發(fā)酵的條件，使得操作過程更加簡單，易于管理。具體的技術(shù)方案如下一種利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，包括如下步驟(1)生物質(zhì)經(jīng)堿液熱處理后，固液分離得到液體I和殘?jiān)麵I ；(2)將含有殘?jiān)麵I的培養(yǎng)基加入到糖化發(fā)酵罐中，向糖化發(fā)酵罐內(nèi)加入纖維降解酶，在50 55°C下，水解反應(yīng)0. 5 6小時；(3)維持糖化發(fā)酵罐溫度為50 55°C，利用液體I調(diào)節(jié)經(jīng)步驟(2)處理后的培養(yǎng)基PH值至6. 0 6. 5，向糖化發(fā)酵罐內(nèi)接入凝結(jié)芽孢桿菌，厭氧條件下進(jìn)行殘?jiān)麵I同步糖化發(fā)酵48 生產(chǎn)L-乳酸，同時流加液體I維持發(fā)酵液pH值為5. 2 5. 8。步驟(1)中，所述的生物質(zhì)為玉米芯、玉米秸稈、麥稈、稻稈和甘蔗渣中的任意一種或多種。步驟(1)中，所述的堿液為堿的水溶液，所述的堿為Na0H、Ca0、Ca (OH) JPNH4OH中的任意一種或多種。步驟⑵中，含有殘?jiān)麵I的培養(yǎng)基，其中殘?jiān)麵I在培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比為 100 300g/L。該培養(yǎng)基中不含有包括CaO, Ca(OH)2,或CaCO3的鈣類乳酸中和劑。該培養(yǎng)基的配方需適合凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，一般包含碳源100 300g/L，氮源1 10g/L，無機(jī)鹽0. 15 lg/L。其中，碳源即為殘?jiān)麵I，氮源為酵母膏、氯化銨、蛋白胨或玉米漿干粉，無機(jī)鹽為MnSO4或MgSO4。步驟O)中，所述的纖維素降解酶來源于里氏木霉、綠色木霉、黑曲霉和康寧木霉中的任意一種或多種，一般具有含有纖維素酶、木聚糖酶和葡萄糖苷酶活。步驟O)中，纖維素降解酶的用量控制為4 10FPU/g殘?jiān)麵I。
步驟(3)中，凝結(jié)芽孢桿菌接種量為體積比5 15%。D-乳酸和L-乳酸產(chǎn)量的測定方法采用HPLC色譜儀為Agilent 1200，配備手性分析柱Sumichiral OA 5000 (4. 6mm-150mm)。具體操作條件為流動相為1. OmM的CuSO4溶液， 流速1. OmL/min ；檢測波長254nm(UV)；柱溫;35°C和進(jìn)樣量20ul。
乳酸光學(xué)純度=一,χ 100% L -乳酸生成量+ D -乳酸生成量
乳酸得率=__x 100o/o
生物質(zhì)渣消耗量X (生物質(zhì)渣纖維素含量+0.9 +生物質(zhì)渣半纖維素含量+ 0.88)本發(fā)明的有益效果本發(fā)明與目前利用生物質(zhì)制備L-乳酸的方法相比，不但可以提高纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化為乳酸的綜合效率，使其在酶用量10FPU/g的情況下乳酸得率(包括纖維素和半纖維素)達(dá)到90%，而且在發(fā)酵過程中后采用堿廢液中和乳酸，可以降低乳酸生產(chǎn)工業(yè)中的堿耗和廢水排放。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 稱取Ikg的玉米芯，粉碎成1 2cm左右的顆粒，加入氫氧化鈉0. ^g、水7. 5kg, 于100°C左右蒸煮60min后，壓濾分離蒸煮液和殘?jiān)@得堿處理廢液I和堿處理玉米芯殘?jiān)麵I。在3L糖化發(fā)酵罐中配制2L同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基絕干堿處理玉米芯殘?jiān)麵I 150g/L，酵母膏 5g/L，氯化銨 lg/L,MgSO4O. 5g/L，pH 自然。加入 20mL 酶活為 150FPIU/mL 的纖維素降解酶(纖維素降解酶Celluclast為Novozymes商品酶，里氏木霉ATCC 26921生產(chǎn))，升溫至50°C，攪拌速度200rpm，水解反應(yīng)6小時。凝結(jié)芽孢桿菌預(yù)培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(DSM 23183)加入200mL種子培養(yǎng)基中，在 180rpm、50°C不通氣條件下培養(yǎng)18h。種子培養(yǎng)基配方(g/L)葡萄糖50，酵母膏5，氯化銨 1，CaCO3 10，MgSO4 · 7Η20 0. 5，pH 自然。維持糖化發(fā)酵罐溫度50 55°C，利用堿處理廢液I調(diào)節(jié)pH至6. 5 ；將200mL種子預(yù)培養(yǎng)液倒入糖化發(fā)酵罐中，不通氣厭氧條件下進(jìn)行殘?jiān)麵I同步糖化發(fā)酵72h，流加廢液I 維持反應(yīng)過程PH至5. 4。發(fā)酵結(jié)束后取上清液檢測L-乳酸和D-乳酸濃度，計(jì)算乳酸得率和L-乳酸光學(xué)純度。實(shí)驗(yàn)共設(shè)3次重復(fù)，測定L-乳酸濃度達(dá)到117. lg/L，光學(xué)純度為97. 3% ；乳酸綜合得率為93. 2%0實(shí)施例2 稱取3kg的玉米秸稈，切成1 2cm左右的碎段，按固液重量比1 10加入濃度為5% (w/w)的NaOH溶液，于90°C左右蒸煮120min后，離心3500rpml5min固液分離，獲得堿處理廢液I和堿處理玉米秸稈殘?jiān)麵I。在5L糖化發(fā)酵罐中配制3L同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基堿處理玉米秸稈殘?jiān)麵I 200g/ L，酵母膏 7g/L，氯化銨 1. 2g/L，MgSO4 0. 5g/L，pH 自然。加入 20mL 酶活為 150FPIU/mL 纖維素降解酶(來源于康寧木霉)，升溫至50°C，攪拌速度200rpm，水解反應(yīng)6小時。凝結(jié)芽孢桿菌預(yù)培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(DSM 23183)接入300mL新鮮種子培養(yǎng)基中，在180rpm、50°C不通氣條件下培養(yǎng)18h。種子培養(yǎng)基配方(g/L)葡萄糖50，酵母膏5， 氯化銨 1，CaCO3 10，MgSO4 · 7Η20 0. 5，pH 自然。維持糖化發(fā)酵罐溫度50 55°C，利用堿處理廢液I調(diào)節(jié)pH至5. 5 ；將300mL預(yù)培養(yǎng)液倒入糖化發(fā)酵罐中，不通氣厭氧條件下進(jìn)行殘?jiān)?1同步糖化發(fā)酵72h，流加廢液I維持反應(yīng)過程PH至5. 2。發(fā)酵結(jié)束后取上清液檢測L-乳酸和D-乳酸濃度，計(jì)算乳酸得率和L-乳酸光學(xué)純度。實(shí)驗(yàn)共設(shè)3次重復(fù)，測定L-乳酸濃度達(dá)到140g/L，光學(xué)純度為97. 2% ；乳酸綜合得率為90. 2%0實(shí)施例3:稱取Ikg制糖工業(yè)壓榨后的甘蔗渣，按固液重量比1 10加入濃度為3% (w/w) 的NaOH，于100°C左右蒸煮60min后，離心3500rpml5min固液分離，獲得堿處理廢液I和堿處理甘蔗殘?jiān)麵I。在3L糖化發(fā)酵罐中配制2L同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基堿處理甘蔗渣100g/L，玉米漿干粉5g/L，氯化銨lg/L，MgSO4 0. 5g/L，pH自然。加入13mL酶活為150FPIU/mL纖維素降解酶(纖維素降解酶Celluclast為Novozymes商品酶，里氏木霉ATCC 26921生產(chǎn))；升溫至50°C，攪拌速度200rpm，水解反應(yīng)3小時。凝結(jié)芽孢桿菌預(yù)培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(DSM 23183)接入200mL種子培養(yǎng)基中，在 180rpm、50°C不通氣條件下培養(yǎng)18h。種子培養(yǎng)基配方(g/L)葡萄糖50，玉米漿干粉5，氯化銨 1, CaCO3 10，MgSO4 · 7Η20 0. 5，pH 自然。維持糖化發(fā)酵罐溫度50 55°C，將200mL預(yù)培養(yǎng)液倒入糖化發(fā)酵罐中，不通氣厭氧條件下進(jìn)行殘?jiān)麵I同步糖化發(fā)酵72h，流加溶液I維持反應(yīng)過程PH至5. 4。發(fā)酵結(jié)束后取上清液檢測L-乳酸和D-乳酸濃度，計(jì)算乳酸得率和L-乳酸光學(xué)純度。實(shí)驗(yàn)共設(shè)3次重復(fù)，測定L-乳酸濃度達(dá)到92. 2g/L，光學(xué)純度為97. 5%;乳酸綜合得率為96. 1% ο
權(quán)利要求
1.一種利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)生物質(zhì)經(jīng)堿液熱處理后，固液分離得到液體I和殘?jiān)麵I；(2)將含有殘?jiān)麵I的培養(yǎng)基加入到糖化發(fā)酵罐中，向糖化發(fā)酵罐內(nèi)加入纖維素降解酶，在50 55°C下，水解反應(yīng)0. 5 6小時；(3)維持糖化發(fā)酵罐溫度為50 55°C，利用液體I調(diào)節(jié)經(jīng)步驟(2)處理后的培養(yǎng)基pH 值至6. 0 6. 5，向糖化發(fā)酵罐內(nèi)接入凝結(jié)芽孢桿菌，厭氧條件下進(jìn)行殘?jiān)麵I同步糖化發(fā)酵 48 生產(chǎn)L-乳酸，同時流加液體I維持發(fā)酵液pH值為5. 2 5. 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于步驟(1) 中，所述的生物質(zhì)為玉米芯、玉米秸稈、麥稈、稻稈和甘蔗渣中的任意一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于步驟(1) 中，所述的堿液為堿的水溶液，所述的堿為NaOH、CaO, Ca(OH)2和NH4OH中的任意一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于步驟(2) 中，含有殘?jiān)麵I的培養(yǎng)基，其中殘?jiān)麵I在培養(yǎng)基中的濃度為100 300g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于步驟(2) 中，所述的纖維素降解酶來源于里氏木霉、綠色木霉、黑曲霉和康寧木霉中的任意一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于步驟(2) 中，纖維素降解酶的用量控制為4 10FPU/g殘?jiān)麵I。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于步驟(3) 中，凝結(jié)芽孢桿菌接種量為體積比5 15%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，生物質(zhì)經(jīng)堿液熱處理后，固液分離得到液體I和殘?jiān)麵I；將含有殘?jiān)麵I的培養(yǎng)基加入到糖化發(fā)酵罐中，加入纖維素降解酶，在50～55℃下，水解反應(yīng)0.5～6小時；維持糖化發(fā)酵罐溫度為50～55℃，利用液體I調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至6.0～6.5，向糖化發(fā)酵罐內(nèi)接入凝結(jié)芽孢桿菌，厭氧條件下進(jìn)行殘?jiān)麵I同步糖化發(fā)酵48～96h生產(chǎn)L-乳酸，同時流加液體I維持發(fā)酵液pH值為5.2～5.8。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，不但可以提高纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化為乳酸的綜合效率，而且在發(fā)酵過程中和采用堿廢液中和乳酸，可以降低乳酸生產(chǎn)工業(yè)中的堿耗和廢水排放。
文檔編號C12P7/56GK102174602SQ20111005353
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月7日
發(fā)明者勇強(qiáng), 朱均均, 李鑫, 歐陽嘉, 蔡聰 申請人:南京林業(yè)大學(xué)