專利名稱：玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA及其RNAi干擾工程菌的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA及其RNAi干擾工程菌構(gòu)建。
背景技術(shù)：
玉米螟(Ostrinia furnacalis)俗稱鉆心蟲(chóng)，是世界性重大害蟲(chóng)之一，其食性龐雜且分布極廣。我國(guó)的華北、東北、西北是玉米螟嚴(yán)重危害區(qū)，其主要危害玉米、高粱和棉花等，是玉米的專化性害蟲(chóng)，主要以幼蟲(chóng)取食玉米植株和雄穗而造成植株上葉片蟲(chóng)孔、莖桿折斷導(dǎo)致減產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，玉米螟危害造成玉米減產(chǎn)高達(dá)10% 30%。并且，近年來(lái)由于氣候變暖、玉米種植密度等因素的改變，玉米螟的危害日益加重。目前，對(duì)玉米螟的防治措施主要包括物理防治、化學(xué)防治和生物防治三大技術(shù)手段。物理防治主要是利用螟蛾的趨光性，用誘蟲(chóng)燈誘殺玉米螟成蟲(chóng)以達(dá)到殺蟲(chóng)的效果。但它必須保證夜間連續(xù)供電，且需要大面積統(tǒng)一使用，效果才理想；化學(xué)防治主要是通過(guò)噴灑一些化學(xué)顆粒藥劑進(jìn)行防殺玉米螟，已取得了顯著的效果，是目前防治玉米螟主要的技術(shù)手段。但其最大的缺點(diǎn)就是對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了很大的污染，這與建立環(huán)保型生態(tài)環(huán)境的觀念是相背的；生物防治同化學(xué)防治相比具有較強(qiáng)的針對(duì)性和選擇性，生物防治沒(méi)有不良的副作用，可長(zhǎng)期有效地控制危害。生物防治中利用白僵菌和赤眼蜂防治需要充分考慮到不同地區(qū)不同的氣候和其它可能影響防治效果的因素。而對(duì)于目前應(yīng)用效果較好也較普遍的 Bt生物防治手段，其本身也有一定的局限性，它容易被陽(yáng)光中的紫外線失活，而且害蟲(chóng)會(huì)對(duì)它產(chǎn)生抗藥性，從而使它的應(yīng)用受到了限制。因此，尋求新的生物防治方法已成為亟待解決的問(wèn)題。昆蟲(chóng)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase，GST)是一類在生物代謝中承擔(dān)許多重要生理功能的超基因家族，該酶系在生物體對(duì)內(nèi)源性和外源性有毒物質(zhì)(次生代謝物、殺蟲(chóng)劑等)的降解過(guò)程中起著重要作用。其主要功能是催化谷胱甘肽的巰基與一些親電子類有毒物質(zhì)進(jìn)行軛合反應(yīng)，從而保護(hù)一些蛋白質(zhì)免受損傷，達(dá)到解毒目的。迄今為止，已在很多昆蟲(chóng)中克隆到了 GST的全長(zhǎng)cDNA以及cDNA片段，但尚未有玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA及其RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，目的是對(duì)玉米螟生長(zhǎng)發(fā)育起到明顯的抑制作用，從而為農(nóng)業(yè)上防治昆蟲(chóng)提供一條新的途徑。本發(fā)明玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA全長(zhǎng)為886bp，核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示；該基因所編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶RNAi干擾工程菌的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行一、 用Trizol法提取玉米螟三齡幼蟲(chóng)中腸總RNA，利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一
4鏈，根據(jù)特定功能的dsRNA片段，設(shè)計(jì)特異性上游引物0f-GST-RNAi320-Pl和下游引物 0f-GST-RNAi320-P2,然后以上述得到的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段 Of-GST-RNAi320 ；二、目的片段0f-GST_RNAi320 與表達(dá)載體L4440 分別經(jīng)Pst I 禾PHindIII 進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建重組質(zhì)粒L4440-0f-GST ；三、將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒L4440-0f-GST轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HT115(DE;3)中，即完成玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，命名為htL4440-0f-GST ；其中步驟一中特定功能的dsRNA片段的全長(zhǎng)為320bp，核苷酸序列為CGAC GTACTTTTATCCCCAAGTCCTCGCTGGTGCTCCTGCTGACGAAGCCTTGTTGAAGATGCTGGAAGAGGCTCT CAAGTTCCTGGACACCTTCCTCGAAGGTCAGAAGTATGCTGCGGGCTCAGAACTGACCTTGGCTGACCTGTC GCTCGTGGCTACTGTGTCTACTATTGACGCTGCTGGCATATCCATCGAATCCTACCAGAGTGTCAACAAGTG GTTCACGCTGGTCAAATCTACCGCCCCCAAATACGACGAAGCGAACGGCCAAGGCGTAGAAATGTTTAGAGC CTTCGTGGCACAGCTCAAAGCCAAGACG ；步驟一中上游引物 Of-GST-RNAi320-P1 的核苷酸序列為T(mén)CGCTGCAGCGACGTACTTTTATCCCCAA (下劃線表示Pst I酶切位點(diǎn))，下游弓丨物 Of-GST-RNAi320-P2 的核苷酸序列為GACAAGCTTCGTCTTGGCTTTGAGCTGTG (下劃線表示 HindIII酶切位點(diǎn))。本發(fā)明提供玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA及其RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，對(duì)玉米螟生長(zhǎng)發(fā)育起到明顯的抑制作用，為農(nóng)業(yè)上防治昆蟲(chóng)提供一條新的途徑，從而拓展該解毒酶在農(nóng)業(yè)上防治昆蟲(chóng)方面的應(yīng)用。本發(fā)明克隆了玉米螟GST基因cDNA全長(zhǎng)，并利用操作簡(jiǎn)單、成本低且更利于研究昆蟲(chóng)基因功能的自然飼喂法RNAi干擾技術(shù)通過(guò)沉默GST基因而達(dá)到殺蟲(chóng)目的，可以在分子水平上研究玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因，更好地探討該基因與玉米螟抗性的關(guān)系，以及為進(jìn)一步采用RNAi干擾技術(shù)來(lái)沉默玉米螟GST基因以減弱玉米螟對(duì)植物次生物質(zhì)的耐受性，通過(guò)此方法有效抑制了玉米螟生長(zhǎng)發(fā)育，為防治有害昆蟲(chóng)提供了新的途徑。本發(fā)明的生物學(xué)原理就是首先通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物獲得目的基因的保守片段，然后利用RACE技術(shù)獲得全長(zhǎng)序列，進(jìn)而通過(guò)沉默昆蟲(chóng)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的mRNA，抑制此解毒酶的活性，使昆蟲(chóng)喪失解毒功能或解毒能力下降，從而來(lái)達(dá)到調(diào)控昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的目的。本發(fā)明中RNAi干擾工程菌對(duì)玉米螟生長(zhǎng)發(fā)育方面的研究做出了重大的鋪墊，目前，在昆蟲(chóng)中現(xiàn)在用RNAi研究基因功能的方法主要是注射法，雖然注射法在昆蟲(chóng)基因功能的研究方面取得了很大的研究成果，但它具有很多缺點(diǎn)，如對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員有較高的技術(shù)要求且勞動(dòng)強(qiáng)度大，實(shí)驗(yàn)成本高等。近幾年來(lái)，人們開(kāi)始嘗試通過(guò)昆蟲(chóng)飼喂取食dsRNA來(lái)降低靶基因的表達(dá)，可以消除注射法所帶來(lái)的大部分缺點(diǎn)。但從某種程度上來(lái)講這仍舊只是另一種意義上的注射，操作復(fù)雜，工作量大，無(wú)法大規(guī)模進(jìn)行基因功能研究。在本發(fā)明的基礎(chǔ)上采用一種通過(guò)自然飼喂含有特定基因dsRNA飼料來(lái)有效抑制昆蟲(chóng)靶基因mRNA表達(dá)，以抑制昆蟲(chóng)的正常生長(zhǎng)發(fā)育，該方法不僅操作簡(jiǎn)單，且不需要對(duì)特定dsRNA高度純化，研究應(yīng)用成本低，可以廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)中。


圖1為具體實(shí)施方式
二中構(gòu)建重組質(zhì)粒L4440-0f_GST進(jìn)行雙酶切鑒定的凝膠電泳圖，其中Ml泳道為DL5000 Marker, M2泳道為DL1000 Marker, 1泳道為重組質(zhì)粒 L4440-0f-GST ；圖2為具體實(shí)施方式
二中所構(gòu)建的玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因RNAi干擾工程菌htL4440-0f-GST對(duì)玉米螟幼蟲(chóng)進(jìn)行干擾檢測(cè)的對(duì)比結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA全長(zhǎng)為 886bp，核苷酸序列為T(mén)CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATGGAAAAGTCTTACTGTGGAGTTCTGAAGCGGTGCA CGCGAGTTTCAAAGCTACA^TG]rTCGATCGACCTTTACTACACGGCCGGGTCAGCGCCCTGTCGCCTGGTGTTACT GGTGGCTGCCGCTCTGAACCTCGAACTCAACCTTAAGCCTCTAGACTTAAGGGCTGGAGAACAGCTCACACCAGAAT TTTTACAGCTGAACCCACAACACACAGTTCCCACGATCATAGACGACGGCTTTTCGCTAAATCCTCCACACACAGTT CCCACGATCGTAGACGACGGCTTTTCGCTATGGGAATCGCGCGCCATCAGCCGATACCTGGTCAACAAGTACGGAGG GGCAGCCCTGTACCCTGAGGACCCGAAGGCGAGGGCTTTGGTGGACCAGAGACTGGACTTCGACTTGGGTACACTGT ACCCCAGATTTGCGACGTACTTTTATCCCCAAGTCCTCGCTGGTGCTCCTGCTGACGAAGCCTTGTTGAAGATGCTG GAAGAGGCTCTCAAGTTCCTGGACACCTTCCTCGAAGGTCAGAAGTATGCTGCGGGCTCAGAACTGACCTTGGCTGA CCTGTCGCTCGTGGCTACTGTGTCTACTATTGACGCTGCTGGCATATCCATCGAATCCTACCAGAGTGTCAACAAGT GGTTCACGCTGGTCAAATCTACCGCCCCCAAATACGACGAAGCGAACGGCCAAGGCGTAGAAATGTTTAGAGCCTTC GTGGCACAGCTCAAAGCCAAGACGGAGCTGfTAA]rTCGTGAGACTGGTATAGTGCATAGTTTTGTATTAAGTAAATG TTTGATACATAAGTGAAT ΙαΑ ΚααΙTTGAAATTTAAAAGTAAMAAAAAAAA ；該基因所編碼的氨基酸序列為:MetSerIleAspLeuTyrTyrThrAlaGlySerAlaProCysArgLeuValLeuLeuValAlaAlaAlaLeu AsnLeuGluLeuAsnLeuLysProLeuAspLeuArgAlaGlyGluGlnLeuThrProGluPheLeuGlnLeuAsnPr oGlnHisThrValProThrIIeIleAspAspGlyPheSerLeuAsnProProHisThrValProThrIIeValAspA spGlyPheSerLeuTrpGluSerArgAlalIeSerArgTyrLeuValAsnLysTyrGlyGlyAlaAlaLeuTyrPro GluAspProLysAlaArgAlaLeuValAspGlnArgLeuAspPheAspLeuGlyThrLeuTyrProArgPheAlaTh rTyrPheTyrProGlnValLeuAlaGlyAlaProAlaAspGluAlaLeuLeuLysMetLeuGluGluAlaLeuLysP heLeuAspThrPheLeuGluGlyGlnLysTyrAlaAlaGlySerGluLeuThrLeuAlaAspLeuSerLeuValAla ThrValSerThrIIeAspAlaAlaGlyIIeSerIleGluSerTyrGlnSerValAsnLysTrpPheThrLeuValLy sSerThrAlaProLysTyrAspGluAlaAsnGly GlnGlyVal GluMetPheArgAlaPheValAlaGlnLeuLy sAlaLysThrGluLeu。本實(shí)施方式中ATG為翻譯起始密碼子；TAA為翻譯終止密碼子。本實(shí)施方式中玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的全長(zhǎng)序列是按照以下方法得到的一、采用iTrizol法提取玉米螟三齡幼蟲(chóng)中腸總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA ；二、 通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的基因的保守片段根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)道的棉鈴蟲(chóng)、大蠟螟、家蠶和云杉色卷蛾的GST氨基酸序列，通過(guò)DNAMAN生物軟件比對(duì)后找到各物種GST基因的高度保守區(qū)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，即Of-GST-JB-Pl :5，-CC(C/T)CA(A/G)CACACAGT(C/G)CC(C/T)AC-3，；
0f-GST-JB-P2 5，-TA (T/C) TTCTG (G/A) CC (C/T) TCNAGGAA-3，；以上一步獲得的 cDNA 為模板，通過(guò) PCR(94°C 3min,94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin, 35cycles, 72 °C IOmin, 4°C-)擴(kuò)增出目的基因的保守片段，擴(kuò)增出的片段送上海英俊生物技術(shù)公司測(cè)序；三、利用RACE技術(shù)獲得目的基因的cDNA全長(zhǎng)根據(jù)測(cè)序正確的保守片段分別設(shè)計(jì)5’ RACE和 3，RACE特異性引物GSPl和GSP2，參考TaKaRa公司的RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行從而獲得 GSTs全長(zhǎng)序列。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因RNAi干擾工程菌的構(gòu)建按以下步驟進(jìn)行一、用Trizol法提取玉米螟三齡幼蟲(chóng)中腸總RNA，利用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，根據(jù)特定功能的dsRNA片段，設(shè)計(jì)特異性上游引物 Of-GST-RNAi320-P1和下游引物0f-GST-RNAi320_P2，然后以上述得到的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段Of-GST-RNAi320 ；二、目的片段Of-GST-RNAi320與表達(dá)載體L4440分別經(jīng)I^t I和HindIII進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建重組質(zhì)粒 L4440-0f-GST ；三、將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒L4440_0f_GST轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HTl 15 (DE3)中，即完成玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，命名為htL4440-0f-GST ；其中步驟一中特定功能的dsRNA片段的全長(zhǎng)為320bp，核苷酸序列為CGAC GTACTTTTATCCCCAAGTCCTCGCTGGTGCTCCTGCTGACGAAGCCTTGTTGAAGATGCTGGAAGAGGCTCT CAAGTTCCTGGACACCTTCCTCGAAGGTCAGAAGTATGCTGCGGGCTCAGAACTGACCTTGGCTGACCTGTC GCTCGTGGCTACTGTGTCTACTATTGACGCTGCTGGCATATCCATCGAATCCTACCAGAGTGTCAACAAGTG GTTCACGCTGGTCAAATCTACCGCCCCCAAATACGACGAAGCGAACGGCCAAGGCGTAGAAATGTTTAGAGC CTTCGTGGCACAGCTCAAAGCCAAGACG ；步驟一中上游引物 Of-GST-RNAi320-P1 的核苷酸序列為T(mén)CGCTGCAGCGACGTACTTTTATCCCCAA (下劃線表示Pst I酶切位點(diǎn))，下游弓丨物 Of-GST-RNAi320-P2 的核苷酸序列為:GACAAGCTTCGTCTTGGCTTTGAGCTGTG (下劃線表示 HindIII酶切位點(diǎn))。本實(shí)施方式中表達(dá)載體L4440質(zhì)粒與大腸桿菌HT115(DE;3)源自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所。本實(shí)施方式步驟一中獲得目的片段0f-GST_RNAi320，是需要經(jīng)過(guò)膠回收純化所得的。本實(shí)施方式步驟二中連接并構(gòu)建重組質(zhì)粒L4440-0f_GST的驗(yàn)證過(guò)程為構(gòu)建重組質(zhì)粒L4440-0f-GST和空載體L4440分別用HindIII單酶切，用Apal I進(jìn)行雙酶切鑒定以驗(yàn)證是否成功構(gòu)建，結(jié)果如圖1所示，重組質(zhì)粒L4440-0f-GST構(gòu)建成功。本實(shí)施方式所構(gòu)建的玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因RNAi干擾工程菌 htL4440-0f-GST,在室溫條件下12000rpm離心^iin富集菌體，按照200 1的體積比用 ddH20溶解富集的菌體，并充分混勻；將人工飼料(周大榮開(kāi)發(fā)的玉米螟專業(yè)飼料，可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)得到)切成碎片或顆粒，將上述離心富集的新鮮菌液按濃度為lmL/mg (菌液/飼料) 加到人工飼料中進(jìn)行玉米螟飼喂取食，經(jīng)觀察計(jì)算后，結(jié)果如圖2所示，ddH20空白組玉米螟幼蟲(chóng)的死亡率為O %，表達(dá)載體L4440對(duì)照組玉米螟幼蟲(chóng)的死亡率為3. 33 %，丁布〔D 是指DIMBOA，它是禾本科植物體內(nèi)一種特有的防御性化合物，它對(duì)害蟲(chóng)有拒食、毒殺等作用，可以增強(qiáng)植物抵御害蟲(chóng)攻擊的能力(Sicker et al.，2000)〕對(duì)照組玉米螟幼蟲(chóng)的死亡率為13. 37%，丁布+表達(dá)載體L4440(D+L)對(duì)照組玉米螟幼蟲(chóng)的死亡率為18%，丁布+htL4440-0f-GST(D+RL)組玉米螟幼蟲(chóng)的死亡率為52%，由此可見(jiàn)本實(shí)施方式所構(gòu)建的玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因RNAi干擾工程菌對(duì)玉米螟生長(zhǎng)發(fā)育起到了明顯的抑制作用。
具體實(shí)施方式
=Ξ:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二不同的是步驟二中Of-GST-RNAi320雙酶切的體系如下
成分用量Of-GST-RNAi32010 μ LPst I1 μ LHindIII1 μ LIOXM Buffer2μ L(MH2O20 μ Lo其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二不同的是步驟二中表達(dá)載體
L4440質(zhì)粒雙酶切的體系如下成分用量表達(dá)載體L4440質(zhì)粒10 μ LPst I1 μ LHindIII1 μ LIOXM Buffer2μ L(MH2O20 μ Lo其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二不同的是步驟二中連接的體系如下
成分用量10 X T4DNA連接酶緩沖液1 μ L酶切后的 Of-GST-RNAi3206 μ L酶切后的表達(dá)載體L4440質(zhì)粒2μ LT4DNA連接酶 1 μ L。
其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二二相同。
權(quán)利要求
1.玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA，其特征在于玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA全長(zhǎng)為886bp，核苷酸序列為T(mén)CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATGGAAAAGTCTTACTGTGGAGTTCTGAAGCGGTGCACGCG AGTTTCAAAGCTACA^tgl'TCGATCGACCTTTACTACACGGCCGGGTCAGCGCCCTGTCGCCTGGTGTTACTGGTGG CTGCCGCTCTGAACCTCGAACTCAACCTTAAGCCTCTAGACTTAAGGGCTGGAGAACAGCTCACACCAGAATTTTTA CAGCTGAACCCACAACACACAGTTCCCACGATCATAGACGACGGCTTTTCGCTAAATCCTCCACACACAGTTCCCAC GATCGTAGACGACGGCTTTTCGCTATGGGAATCGCGCGCCATCAGCCGATACCTGGTCAACAAGTACGGAGGGGCAG CCCTGTACCCTGAGGACCCGAAGGCGAGGGCTTTGGTGGACCAGAGACTGGACTTCGACTTGGGTACACTGTACCCC AGATTTGCGACGTACTTTTATCCCCAAGTCCTCGCTGGTGCTCCTGCTGACGAAGCCTTGTTGAAGATGCTGGAAGA GGCTCTCAAGTTCCTGGACACCTTCCTCGAAGGTCAGAAGTATGCTGCGGGCTCAGAACTGACCTTGGCTGACCTGT CGCTCGTGGCTACTGTGTCTACTATTGACGCTGCTGGCATATCCATCGAATCCTACCAGAGTGTCAACAAGTGGTTC acgctggtcaaatctaccgcccccamtacgacgaagcgmcggccmggcgtagaaatgtttagagccttcgtggcacagctcamgccaagacggagctg|taa|'tcgtgagactggtatagtgcatagttttgtattaagtaaatgtttgataCATAAGTGAAT Κα ΚΑΑΙ TTGAAATTTAAAAGTAAAAAAAAAAAA ；該基因所編碼的氨基酸序列為M etSerlleAspLeuTyrTyrThrAlaGlySerAlaProCysArgLeuValLeuLeuValAlaAlaAlaLeuAsnLeu GluLeuAsnLeuLysProLeuAspLeuArgAlaGlyGluGlnLeuThrProGluPheLeuGlnLeuAsnProGlnHi sThrValProThrllelleAspAspGlyPheSerLeuAsnProProHisThrValProThrlleValAspAspGlyP heSerLeuTrpGluSerArgAlaIleSerArgTyrLeuValAsnLysTyrGlyGlyAlaAlaLeuTyrProGluAsp ProLysAlaArgAlaLeuValAspGlnArgLeuAspPheAspLeuGlyThrLeuTyrProArgPheAlaThrTyrPh eTyrProGlnValLeuAlaGlyAlaProAlaAspGluAlaLeuLeuLysMetLeuGluGluAlaLeuLysPheLeuA SpThrPheLeuGluGlyGlnLysTyrAlaAlaGlySerGluLeuThrLeuAlaAspLeuSerLeuValAlaThrVal SerThrIIeAspAlaAlaGlyIIeSerIleGluSerTyrGlnSerValAsnLysTrpPheThrLeuValLysSerTh rAlaProLysTyrAspGluAlaAsnGly GlnGlyVal GluMetPheArgAlaPheValAlaGlnLeuLysAlaLy sThrGluLeu。
2.如權(quán)利要求1所述玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的RNAi干擾工程菌的構(gòu)建， 其特征在于玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因RNAi干擾工程菌的構(gòu)建按以下步驟進(jìn)行 一、用Trizol法提取玉米螟三齡幼蟲(chóng)中腸總RNA，利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，根據(jù)特定功能的dsRNA片段，設(shè)計(jì)特異性上游引物0f-GST-RNAi320-Pl和下游引物 0f-GST-RNAi320-P2,然后以上述得到的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段 Of-GST-RNAi320 ；二、目的片段 0f-GST_RNAi320 與表達(dá)載體 L4440 分別經(jīng)Pst I 和 HindIII 進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建重組質(zhì)粒L4440-0f-GST ；三、將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒L4440-0f-GST轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HT115(DE;3)中，即完成玉米螟谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶 RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，命名為htL4440-0f-GST ；其中步驟一中特定功能的dsRNA片段的全長(zhǎng)為320bp，核苷酸序列為CGACGTAC TTTTATCCCCAAGTCCTCGCTGGTGCTCCTGCTGACGAAGCCTTGTTGAAGATGCTGGAAGAGGCTCTCAAG TTCCTGGACACCTTCCTCGAAGGTCAGAAGTATGCTGCGGGCTCAGAACTGACCTTGGCTGACCTGTCGCT CGTGGCTACTGTGTCTACTATTGACGCTGCTGGCATATCCATCGAATCCTACCAGAGTGTCAACAAGTGGTT CACGCTGGTCAAATCTACCGCCCCCAAATACGACGAAGCGAACGGCCAAGGCGTAGAAATGTTTAGAGCCTTCGTGGCACAGCTCAAAGCCAAGACG ；步驟一中上游引物 Of-GST-RNAi320-P1 的核苷酸序列為T(mén)CGCTGCAGCGACGTACTTTTATCCCCAA,下游引物 Of-GST-RNAi320-P2 的核苷酸序列為 GACAAGCTTCGTCTTGGCTTTGAGCTGTG。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，其特征在于步驟二中Of-GST-RNAi320雙酶切的體系如下成分用量Of-GST-RNAi32010 μ LPst I1 μ LHindIII1 μ LIOXM Buffer2μ LddH2020 μ L0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，其特征在于步驟二中表達(dá)載體L4440質(zhì)粒雙酶切的體系如下成分用量表達(dá)載體L4440質(zhì)粒IOyLPst I1 μ LHindIII1 μ LIOXM Buffer2μ LddH2020 μ L0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，其特征在于步驟二中連接的體系如下成分用量10 X T4DNA連接酶緩沖液1 μ L酶切后的 Of-GST-RNAi320 6 μ L 酶切后的表達(dá)載體L4440質(zhì)粒 2 μ L T4DNA連接酶lyL。
全文摘要
玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA及其RNAi干擾工程菌的構(gòu)建，它涉及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA及其RNAi干擾工程菌構(gòu)建。玉米螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列見(jiàn)SEQ ID No.1，氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID No.2。構(gòu)建一、提取玉米螟總RNA，合成cDNA第一鏈，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得Of-GST-RNAi320；二、Of-GST-RNAi320與L4440進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建L4440-Of-GST；三、將L4440-Of-GST轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HT115(DE3)中即完成。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、成本低，對(duì)玉米螟生長(zhǎng)發(fā)育起到明顯的抑制作用。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102181460SQ201110056310
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者劉麗萍, 劉春光, 張一桐, 楊峰山, 陳思學(xué) 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)