專利名稱：MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及構(gòu)建一種融合DNA疫苗，尤其涉及一種MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，抗腫瘤血管生成成為抗腫瘤治療的一種有效手段，以激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)為主的主動(dòng)免疫治療策略在惡性腫瘤的綜合治療占有重要的地位，以激發(fā)主動(dòng)免疫的DNA疫苗是近年來(lái)成為研究最多的疫苗形式，由于其易于擴(kuò)增和修飾諸多優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到人們的重視。DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA (有時(shí)也可是RNA)，它可經(jīng)一定途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，被宿主細(xì)胞攝取后轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性2種免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到免疫保護(hù)作用。目前，腫瘤DNA疫苗可以采用融合疫苗形式增強(qiáng)抗原呈遞，采用聯(lián)合及靶向疫苗不僅可以增強(qiáng)抗原呈遞，還可以擴(kuò)大免疫效應(yīng)。融合疫苗，通常是利用其中一個(gè)分子與免疫識(shí)別或免疫應(yīng)答密切相關(guān)，使之具有靶向呈遞作用，以促進(jìn)免疫抗原呈遞，融合疫苗在抗原靶向呈遞上具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。腫瘤血管內(nèi)皮標(biāo)志物8(TEM8)因其在腫瘤中特異性表達(dá)，成為抗腫瘤血管生成的新型候選靶標(biāo)之一，過(guò)去的實(shí)驗(yàn)研究表明TEM8所構(gòu)成的單獨(dú)的分子疫苗免疫原性較低，而與其他抗原結(jié)合以后可以有效的激發(fā)免疫反應(yīng)，后來(lái)的學(xué)者在臨床上引入DC疫苗后可以有效的提高TEM8的免疫原性，抗瘤效果明顯。小鼠防御素_beta2 (MBD2)能夠有效趨化iDC， 本研究中我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)MBD2與鼠的TEM8構(gòu)建成融合疫苗pMBD2_mTEM8疫苗，免疫荷有 CT-26的Balb/C小鼠，能夠有效的打破機(jī)體的免疫耐受，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于是提供一種MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗，所述疫苗包含MBD2 基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因連接于pcDNA3. 1載體上。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于是提供一種MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗的制備方法，其包含以下步驟1)獲取 MBD2 基因、mTEM8 基因；2)將步驟1)所述MBD2基因、mTEM8基因通過(guò)SEQ ID NO 5所示的連接肽連接，形成MBD2-mTEM8融合基因；3)將步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因連接到pcDNA3. 1載體上，形成所述DNA融
合疫苗。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于是提供一種MBD2_mTEM8融合蛋白表達(dá)載體，其包含 MBD2基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因連接于pcDNA3. 1載體上。所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表達(dá)載體，MBD2基因的序列如SEQ IDNO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ ID NO 4所示。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種MBD2-mTEM8融合蛋白表達(dá)載體的制備方法，其包含以下步驟1)獲取 MBD2 基因、mTEM8 基因；2)將步驟1)所述MBD2基因、mTEM8基因通過(guò)SEQ ID NO :5所示的連接肽連接，形成MBD2-mTEM8融合基因；3)將步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因連接到pcDNA3. 1載體上，形成所述融合蛋白表達(dá)載體。所述的制備方法中步驟1)所述MBD2基因的序列如SEQ ID NO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ ID NO 4所示。所述的制備方法中所述MBD2基因通過(guò)化學(xué)合成，所述mTEM8基因通過(guò)SEQ ID NO: 2-3所示的引物從murine cDNA library通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得。所述的制備方法中步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因的序列如SEQ IDNO 8所示。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種MBD2-mTEM8融合蛋白表達(dá)載體在制備DNA融合疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種DNA融合疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供所述MBD2-mTEM8融合的DNA融合疫苗，能夠有效的打破機(jī)體對(duì)mTEM8 的免疫耐受，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生免疫記憶。本發(fā)明所述疫苗制備方法簡(jiǎn)單，且該融合DNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗安全，具有明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。本發(fā)明所述疫苗對(duì)研究其抗腫瘤血管生成的作用機(jī)制有著深刻的意義。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例， 并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。


圖1是MBD2_mTEM8融合疫苗的陽(yáng)性克隆的PCR鑒定示意圖；圖2是圖1的陽(yáng)性克隆的正向測(cè)序和MTF序列比對(duì)結(jié)果；圖3是圖1的陽(yáng)性克隆的反向測(cè)序結(jié)果和MTF序列的比對(duì)結(jié)果；圖4是MBD2-TEM8融合基因PCR產(chǎn)物的電泳圖；圖5是Western blot檢測(cè)融合基因的蛋白表達(dá)；圖6是DNA融合疫苗抗腫瘤效果，其中的A為皮下接種CT-26后小鼠的腫瘤體積的變化，B為皮下接種CT-26后的小鼠生存時(shí)間統(tǒng)計(jì)圖；C為皮下接種CT-26后腫瘤的示意圖；圖7是腫瘤組織內(nèi)血管密度檢測(cè)結(jié)果；圖8是51Cr釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖9是IFN- y ELISpot檢測(cè)CTL活性結(jié)果；圖10是去除⑶8+T淋巴細(xì)胞亞群后對(duì)pMBD2-mTEM8疫苗抗腫 瘤作用的影響。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料
7-8周齡雌性Balb/C小鼠，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，RPMI1640，購(gòu)自 Gibco-Invitrogen 公司。紅細(xì)胞裂解液(用KHCO3 1. 0g, NH4CL 8. 3g，EDTA :37mg，加雙蒸餾水至IL配置而成)。小鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)。51Cr (Chromium-51，51Cr)試劑(北京同位素公司)。 Triton X-100 (FARCO CHEMICAL Supplies 公司)。Y 干擾素(interferon-γ，IFN- γ )酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)檢測(cè)試劑(荷蘭U-CyTech生物科技公司)?？耿?單克隆抗體購(gòu)自Santa公司。mTEM8單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。凈化工作臺(tái)SW-CJ_IF(蘇州集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。二氧化碳孵箱(美國(guó)Thermo Forma公司)。FT-603型、閃爍探頭和FH-461自動(dòng)定標(biāo)器(北京核儀器廠)。倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。SDS-PAGE電泳裝置和電轉(zhuǎn)儀器(BI0-RAD公司)。pCDNA3. 1 載體購(gòu)自 Invitrogen 公司。實(shí)施例1目的基因片段的獲取1. MBD2基因通過(guò)化學(xué)合成(合成自Invitrogen公司):SEQ ID NO 1GAACTTGACCACTGCCACACCAATGGAGGGTACTGTGTCAGAGCCATTTGTCCTCCTTCTGCCAGGCGT CCTGGGAGCTGTTTCCCAGAGAAGAACCCCTGTTGCAAGTACATGAAA2. mTEM8 (AF378762)-SEQ ID NO :4 從 murine cDNA library 通過(guò) PCR 擴(kuò)增獲得，引物如下SEQID NO 2-3mTEM8 正向引物 5，-GGCCGCCGCGAGGATGGG-3，； (SEQ ID NO 2)mTEM8 反向引物 5，-GCACAGCAAATAAGTGTCTTCCAC-3，. (SEQ IDNO 3)PCR反應(yīng)體系采用KODplus (Toyobo)擴(kuò)增體系(50 μ 1)如下
權(quán)利要求
1.一種MBD2-mTEM8融合的DNA融合疫苗，其特征在于，包含MBD2基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因連接于pcDNA3. 1載體上。
2.權(quán)利要求1所述的合疫苗的制備方法，其特征在于，包含步驟1)獲取MBD2基因、mTEM8基因；2)將步驟1)所述MBD2基因、mTEM8基因通過(guò)SEQID NO 5所示的連接肽連接，形成 MBD2-mTEM8融合基因；3)將步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因連接到pcDNA3.1載體上，形成所述DNA融合疫田ο
3.權(quán)利要求1所述的MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
4.一種MBD2-mTEM8融合蛋白表達(dá)載體，其特征在于，包含MBD2基因、mTEM8基因，所述 MBD2基因和mTEM8基因連接于pcDNA3. 1載體上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表達(dá)載體，其特征在于，所述MBD2基因的序列如SEQ ID NO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ IDNO 4所示。
6.權(quán)利要求4所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，包含步驟1)獲取MBD2基因、mTEM8基因；2)將步驟1)所述MBD2基因、mTEM8基因通過(guò)SEQID NO 5所示的連接肽連接，形成 MBD2-mTEM8融合基因；3)將步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因連接到pcDNA3.1載體上，形成所述融合蛋白表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述MBD2基因的序列如SEQ ID NO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ ID NO 4所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述MBD2基因通過(guò)化學(xué)合成，所述 mTEM8基因通過(guò)SEQ ID NO :2_3所示的引物從murine cDNAlibrary通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因的序列如SEQ ID NO 8所示。
10.權(quán)利要求4所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表達(dá)載體在制備DNA融合疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種MBD2-mTEM8融合的DNA融合疫苗，其包含MBD2基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因連接于pcDNA3.1載體上。本發(fā)明提供，MBD2與mTEM的融合疫苗pMBD2-mTEM8，能夠有效的打破機(jī)體對(duì)mTEM8的免疫耐受，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生免疫記憶。本發(fā)明所述疫苗制備方法簡(jiǎn)單，并且比傳統(tǒng)疫苗更安全。本發(fā)明所述疫苗對(duì)研究其抗腫瘤血管生成的作用機(jī)制有著深刻的意義。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102178958SQ201110056429
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者劉平, 梁后杰, 潘鳳, 阮志華 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院