專利名稱：轉(zhuǎn)基因玉米mon88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因及其應用。
背景技術(shù)：
近年來，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉(zhuǎn)基因作物已在很多國家獲得批準種植和生產(chǎn)，有的被加工成食品、飼料或用做食物添加劑。由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生態(tài)安全和食用安全一直備受爭議，40多個國家和地區(qū)相繼實施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識制度。各國轉(zhuǎn)基因標識制度的相繼建立，對轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的靈敏度和準確性提出了嚴格的要求，各種轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)也成為研究熱點。常用的轉(zhuǎn)基因檢測方法有聚合酶鏈式反應(PCR)法，外源蛋白檢測法，基因芯片檢測技術(shù)。雖然國外對轉(zhuǎn)基因作物檢測方法研究已有十幾年，但由于轉(zhuǎn)基因作物的種類多、數(shù)量大，一些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品經(jīng)過深加工、各種條件處理與保存后，轉(zhuǎn)基因成分部分或完全降解，所以檢測難度大。因此，需要根據(jù)科學技術(shù)的發(fā)展不斷更新檢測方法。根據(jù)不同轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測目的的不同，鑒定轉(zhuǎn)基因植物主要包括檢測篩選基因、目的基因、不同基因間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)基因、和轉(zhuǎn)入基因與受體植物間的轉(zhuǎn)化體特異結(jié)構(gòu)基因。簡介如下1.篩選型特異性檢測方法篩選檢測通常是檢測轉(zhuǎn)基因植物中CaMV35S啟動子和NOS終止子，因為外源基因在轉(zhuǎn)入作物中為了加強其表達通常會攜帶35S啟動子和NOS終止子。但是35S啟動子存在天然的花椰菜花葉病毒，NOS終止子存在于植物病毒Ti質(zhì)粒中，抗生素類報告基因自然界中也普遍存在，因而僅是檢測轉(zhuǎn)基因植物的篩選基因，極易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，同時也達不到鑒定轉(zhuǎn)基因植物的目的。2.基因特異性檢測方法基因特異性檢測就是檢測轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因植物中的外源目的基因。目前人們檢測的目的基因如CP4-EPSPS，BAR, CrylA(b)基因，但是由于一種作物中可能轉(zhuǎn)入了幾種目的基因或一種目的基因已轉(zhuǎn)入到幾種作物中，在檢測時很容易出現(xiàn)假陰性。3.構(gòu)建特異性檢測方法構(gòu)建特異性檢測芯片是利用基因元件之間的邊界序列特征，能夠有效鑒定使用類似基因元件的不同構(gòu)建體，而且存在序列信息容易獲得的特點，因此被很多研究者所使用。 但是，由同一個構(gòu)建體可能獲得不止一個不同特性的轉(zhuǎn)化株，甚至可能被轉(zhuǎn)化到不同的物種中，而這些轉(zhuǎn)化株未必全部經(jīng)過了安全評估。因此構(gòu)建特異性檢測芯片檢測方法不能識別不同的轉(zhuǎn)基因品系，檢測結(jié)果也很容易出現(xiàn)假陽性，也不能判斷該轉(zhuǎn)基因品系是否經(jīng)過了安全評估。4.轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法轉(zhuǎn)化體特異性檢測芯片的基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體在基因組DNA序列上的整合位點具有高度特異性，即使是相同的載體多次轉(zhuǎn)化，整合的位置和整合位點特征也是不可能重復的。與前三種方法相比，轉(zhuǎn)化體特異性檢測具有最高的特異性，最適合做轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性和定量檢測。經(jīng)對現(xiàn)有專利和其他文獻的檢索，尚未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017外源插入旁側(cè)序列和利用此序列建立轉(zhuǎn)化體特異性定性、定量PCR檢測的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)在檢測轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017 中存在的不足，提供了一種轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017外源插入載體旁側(cè)基因，及其應用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因，其序列如序列表中1所示，總長504bp (順序5' 3')，具體如下:aaattttgtc ctgaacccct aaaatcccaggaccgccacctatcatatacatacatgatc60
ttctaaatac ccgatcagag cgctaagcagcagaatcgtgtgacaacgctagcagctctc120
ctccaacaca tcatcgacaa gcaccttttttgccggagtatgacggtgacgatatattca180
attgtaaatg gcttcatgtc cgggaaatctacatggatcagcaatgagtatggtggtcaa240
tatggagaaa aagaaagagt aattaccaattttttttcaattcaaaaatgtagatgtccg300
cagcgttatt ataaaatgaa agtacattttgataaaacgacaaattacgatccgtcgtat360
ttataggcga aagcaataaa caaattattctaattcggaaatctttatttcgacgtgtct420
acattcacgt ccaaatgggg gcttagatgagaaacttcacgatttggcgcgccaaagctt480
actcgaggtc attcatatgc ttga504 ο所述轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因具有以下特征(1)從5'端開始前168bp為玉米基因組序列；(2)從第169bp至3'末端為插入到玉米中的載體序列，其中從第169bp 479bp 為間插序列，從第480bp至3'末端為水稻中P-ractl部分序列，P-ractl是actinl基因啟動子，驅(qū)動cp4 epsps基因表達；(3)由來源于玉米基因組的第1至168個堿基和來源于外源插入載體的第169堿基至第504個堿基共同組成轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因序列。所述的轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因的提取方法，步驟如下(1)提取并純化轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017基因組總DNA 采用Dra I,EcoR V,Pvu II、 Stu I四種限制性內(nèi)切酶進行充分酶切，并對酶切產(chǎn)物進行純化；(2)引物設(shè)計利用BD Genomeffalker試劑盒(美國Clontech公司生產(chǎn))提供的接頭引物APl和AP2，其序列分別為APl 5' -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3‘；AP2 5' -ACTATAGGGCACGCGTGGT-3‘；另外，參照Mon88017插入載體結(jié)構(gòu)序列設(shè)計引物如下P-ractgspl 5' -CTTTAGGACTTTAGGGGTTGTT-3‘；P-ractgsp2 5' -GGACTATCCCGACTCTCTTC-3‘；
(3)以轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017基因組酶切產(chǎn)物為模板進行兩輪PCR擴增引物對 APl 和 P-ractgspl 用于第一輪PCR 反應，擴增體系 20 μ L，PCR程序為 94°C 25s，72°C 3min，6 個循環(huán);94°〇258，641308，36個循環(huán)；64°C延伸7min，1個循環(huán)；引物對AP2和P_ractgsp2 用于第二輪PCR，在第二輪PCR中用IyL第一輪擴增產(chǎn)物的50倍稀釋液作為模板，PCR擴增體系和反應程序與第一輪PCR相同；第二輪PCR產(chǎn)物即為轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因；(4)將第二輪PCR產(chǎn)物純化并克隆到TA載體上進行測序，得到轉(zhuǎn)基因玉米 M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因。所述的轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因可以用于特異性定性檢測玉米及相關(guān)產(chǎn)品是否含有M0N88017轉(zhuǎn)化事件，具體應用時，方法如下(1)首先，根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因的序列設(shè)計引物，引物序列如下Mon88017-F 5' -TCCTGAACCCCTAAAATCCC-3‘；Mon88017-R 5' -TTTCTCATCTAAGCCCCCAT-3‘；(2)提取待檢測樣品的基因組DNA，并以此為模板，利用Mon88017-F和Mon88017-R 引物組合進行PCR擴增；(3)上述PCR擴增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產(chǎn)物； 若存在擴增產(chǎn)物，則待檢測樣品為含有M0N88017轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因玉米或其相關(guān)產(chǎn)品；若不存在擴增產(chǎn)物，則待檢測樣品中不含有M0N88017轉(zhuǎn)化事件。所述步驟O)中 PCR 程序為95°C 5min 預變性；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 36 個循環(huán)；72°C延伸7min。所述的轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因可以用于特異性定量檢測玉米及相關(guān)產(chǎn)品是否含有M0N88017轉(zhuǎn)化事件及其含量，具體應用時，方法如下(1)建立M0N88017基因的定量PCR標準曲線和zSSnb基因的定量PCR標準曲線①構(gòu)建M0N88017轉(zhuǎn)化體特異性標準分子將含有M0N88017特異性序列和玉米內(nèi)標準基因zSSnb特異性序列連接到pUC57質(zhì)粒并導入大腸桿菌，制備表達載體；②培養(yǎng)上述大腸桿菌，使用質(zhì)粒提取法試劑盒提取質(zhì)粒DNA，并用紫外分光光度計測定其OD值，計算出質(zhì)量濃度，計算出相應的拷貝數(shù)；③對質(zhì)粒DNA進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入M0N88017轉(zhuǎn)化事件的特異性引物和熒光標記探針，以及zSSnb基因的國家標準引物及探針，進行擴增；④擴增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制M0N88017轉(zhuǎn)化事件的定量PCR標準曲線和zSSnb基因的定量PCR 標準曲線；(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入M0N88017基因的特異性引物和熒光標記探針，以及MSnb基因的國家標準引物及探針，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的M0N88017基因的定量PCR標準曲線和zSSnb基因的定量PCR標準曲線，計算出相對應的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標準基因zSSnb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017的百分含量。
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所述步驟(1)③中，M0N88017基因的特異性引物和熒光標記探針是根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因的序列設(shè)計的，具體如下Mon88017-Fl 5' -GGACATGAAGCCATTTACAATTGA-3‘；Mon88017-Rl 5' -GCTCTCCTCCAACACATCAT-3‘；Mon88017-Probe 5' -FAM-ATATCGTCACCGTCATACTCCGGCAA-TAMRA-3‘。zSSIIb引物和探針序列(國家標準)如下zSSIIb-Fl 5' -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3‘；zSSIIb-Rl 5' -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3‘；zSSIIb-Prohe 5' -FAM-TA AGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA-3‘。所述步驟(1)③中，擴增的參數(shù)如下擴增反應體積為50 μ 1,2XPremix Ex Taq25 μ 1，濃度 10ymol/L 的 Forward Primer2 μ 1，濃度 10ymol/L 的 Reverse Primer2 μ 1,濃度 10ymol/L 的 TaqMan Probe2 μ 1，50 X ROX Reference Dye 1 μ 1, DNA 模板2. 0μ l，ddH2016y 1 ；擴增反應條件:95°C預變性30S，95°C變性5S，60°C退火/延伸31S， 共計40個循環(huán)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下1.本發(fā)明首次測序公布了轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)序列。2.本發(fā)明首次分析并確認了轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017外源插入載體旁側(cè)序列中不同堿基的來源，并確定外源插入載體序列和玉米基因組序列的接合位點。3.利用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的序列特征，建立了轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017轉(zhuǎn)化體特異性定性、 定量PCR檢測方法，該檢測方法靈敏，準確，簡單，可靠，具有廣闊的市場前景。


圖1為轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017轉(zhuǎn)化體定性PCR擴增結(jié)果電泳示意圖；其中M-分子量Marker，l_轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017基因組DNA模板，2-轉(zhuǎn)基因玉米Btl76基因組DNA模板，3-轉(zhuǎn)基因玉米Btll基因組DNA模板，4-轉(zhuǎn)基因玉米Mon810基因組DNA模板，5-轉(zhuǎn)基因玉米Μοη863基因組DNA模板，6-轉(zhuǎn)基因玉米GA21基因組DNA模板，7-轉(zhuǎn)基因玉米ΝΚ603基因組DNA模板，8-轉(zhuǎn)基因玉米TC1507基因組DNA模板，9-轉(zhuǎn)基因玉米Τ25基因組DNA模板，10-非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958基因組DNA模板，11-轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2基因組DNA模板，12-轉(zhuǎn)基因棉花Μοη531基因組DNA模板，13-非轉(zhuǎn)基因大豆 1138-2基因組DNA模板，14-非轉(zhuǎn)基因棉花中49基因組DNA模板，15-空白對照。圖2為實施例2中內(nèi)標準(zSSIIb基因)定量PCR標準曲線。圖3為實施例2中轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017轉(zhuǎn)化體定量PCR標準曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017轉(zhuǎn)化體外源插入載體旁側(cè)序列的PCR擴增提取轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017基因組DNA，利用美國Clontech公司的BD Genomeffalker試劑盒，根據(jù)試劑盒提供的方法對Mon88017基因組DNA進行酶切。
合成引物序列如下P-ractgspl 5' -CTTTAGGACTTTAGGGGTTGTT-3‘；P-ractgsp2 5' -GGACTATCCCGACTCTCTTC-3‘。以轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017為模板進行兩輪PCR擴增，引物對APl和P-ractgspl用于第一輪PCR反應，擴增體系20 μ L0 PCR程序為94°C 25s，72°C 3min, 6個循環(huán)；94°C 25s， 64°C 30s，36個循環(huán)；64°C延伸7min，l個循環(huán)。引物對AP2和P_ractgsp2用于第二輪PCR， 在第二輪PCR中用1 μ L第一輪擴增產(chǎn)物的50倍稀釋液作為模板，PCR擴增體系和反應程序與第一輪PCR相同。用瓊脂糖凝膠電泳檢測第二輪PCR產(chǎn)物，將擴增出的清晰條帶進行切割、純化，克隆到TA載體上測序，利用NCBI提供的BLASTN軟件，分析不同部分序列的來源，從而判斷基因組和載體的結(jié)合位點。結(jié)果如下以引物對APl和P-ractgspl用于第一輪PCR反應，引物對AP2和 P-ractgsp2用于第二輪PCR后，成功擴增獲得504bp擴增產(chǎn)物。對PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)BLASTN 軟件分析不同部分序列的來源發(fā)現(xiàn)從5'端開始前168bp為玉米基因組序列，從第169bp 至3'末端為插入到玉米中的載體序列，其中從第169bp 479bp為間插序列，從第480bp 至3'末端為水稻中P-ractl部分序列，P-ractl是actinl基因啟動子，驅(qū)動cp4印sps基因表達。由來源于玉米基因組的第1至168個堿基和來源于外源插入載體的第169堿基至至504個堿基共同組成轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)序列，其序列如序列表中1所示。實施例2轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因的應用1)利用本發(fā)明中所提供序列設(shè)計轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017轉(zhuǎn)化事件轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法引物由上海博亞生物公司合成，引物稀釋成ΙΟμπιοΙ/L備用。合成的引物序列如下Mon88017-F 5' -TCCTGAACCCCTAAAATCCC-3‘；Mon88017-R 5' -TTTCTCATCTAAGCCCCCAT-3‘。分別提取轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017、M0N810、M0N863、NK603、T25、TC1507、Btll、Btl76、 GA21等9種，非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958，轉(zhuǎn)基因棉花M0N531，非轉(zhuǎn)基因棉花中49，轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2,非轉(zhuǎn)基因大豆1138-2基因DNA為模板，分別利用Mon88017_F和Mon88017_R引物組合進行 PCR 擴增。。PCR 程序為95°C 5min 預變性；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，36 個循環(huán)；72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產(chǎn)物。結(jié)果利用所設(shè)計的引物以提取的基因組為模板進行PCR擴增，結(jié)果如圖1所示， 由圖可見，只有轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017基因組成功擴增出特異性446bp PCR產(chǎn)物，而其他轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因樣品做模板時都沒有可觀察到的擴增產(chǎn)物。這表明，該引物具有良好的特異性，適合用于轉(zhuǎn)化體特異性的檢測。2)利用本發(fā)明中所提供序列設(shè)計轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017轉(zhuǎn)化事件轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR檢測方法將含有M0N88017特異性序列和玉米內(nèi)標準基因zSSUb特異性序列的pUC57質(zhì)粒導入大腸桿菌，涂抹到含有Amp的固體LB培養(yǎng)基上，等到長出菌斑以后，挑取白色單菌落， 并培養(yǎng)菌液。離心收集細菌，使用質(zhì)粒小量提取試劑盒(天根生物有限公司)提取質(zhì)粒DNA，
8用紫外分光光度計測定其OD值，計算出質(zhì)量濃度。根據(jù)每個陽性質(zhì)粒含2950bp，計算出MW =1.947X 106g/mol，濃度達到7. OX IO11拷貝/ μ 1，制備成含有1. 0 X 101°拷貝/ μ 1質(zhì)粒 DNA分子溶液。把含有1.0Χ 101°拷貝/ μ 1質(zhì)粒DNA稀釋成1. 0 X 106、1. 0 X 105、1. 0 X 104、 1. 0X103、1. OX IO2 拷貝 / μ 1 的質(zhì)粒 DNA 溶液，在 1. 0X106、1. OX IO4 和 1. OX IO2 拷貝 / μ 1
這3個濃度分別設(shè)置2個重復，檢測擴增的重復性。通過I^rimer Express軟件設(shè)計適合M0N88017的定量PCR檢測用的特異性引物和 Taqman探針。玉米內(nèi)標引物及探針(zSSIIb)采用國家標準引物及探針。Mon88017引物和探針序列如下(序列5' 3')Mon88017-Fl 5' -GGACATGAAGCCATTTACAATTGA-3‘；Mon88017-Rl 5' -GCTCTCCTCCAACACATCAT-3‘；Mon88017-Probe :FAM-5' -ATATCGTCACCGTCATACTCCGGCAA-3‘ -TAMRA。zSSIIb引物和探針序列如下zSSIIb-Fl 5' -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3‘；zSSIIb-Rl 5' -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3‘；zSSIIb-Probe 5' -FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA-3‘。50 μ 1,2 X Premix Ex Taq25 μ 1, Forward Primer (^cjf 10 μ mol/ L)2y 1，Reverse Primer (濃度 10ymol/L)2y 1，TaqMan Probe (濃度 10ymol/L)2y 1， 50 X ROXReference Dye 1 μ 1，DNA 模板 2. 0 μ 1，ddH2016 μ 1。擴增反應條件95°C預變性 30S，95°C變性5S，60°C退火/延伸31S，共計40個循環(huán)。每個試樣重復3次，同時設(shè)立無菌雙蒸水(空白)和非轉(zhuǎn)基因樣品(陰性)對照。結(jié)果通過對不同質(zhì)粒拷貝數(shù)為1.0X IO6、1.0X ΙΟ5、1.0X IO4、1.0X ΙΟ3、1.0X IO2 拷貝/ μ 1的質(zhì)粒DNA進行實時熒光定量PCR擴增，計算機軟件自動生成標準曲線，縱坐標為Ct，橫坐標為起始拷貝數(shù)的自然對數(shù)。根據(jù)標準曲線所得的線性計算公式，通過對不同轉(zhuǎn)基因含量的轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017標準品(1%、0.5%、0.1%、0.05%、0%)、陽性樣品、陰性樣品及空白對照的測定，將樣品的Ct值代入公式，即可得到待測樣品的轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。對玉米內(nèi)標準基因zSSnb和轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017的轉(zhuǎn)化體特異性引物對同一組質(zhì)粒DNA和不同百分含量的轉(zhuǎn)基因玉米DNA進行實時熒光定量PCR擴增，分別得到PCR擴增曲線，并由系統(tǒng)軟件自動生成標準曲線。玉米內(nèi)標準基因zSSnb的標準曲線如圖2所示， 該曲線的斜率為-3. 150386，相關(guān)系數(shù)R2值為0. 997565。轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017的轉(zhuǎn)化體特異性引物的標準曲線如圖3所示，該曲線的斜率為-3. 149857，相關(guān)系數(shù)R2值為0. 999056。 因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。然后用轉(zhuǎn)基因玉米的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標準基因的拷貝數(shù)之比，就可以得到該樣品中轉(zhuǎn)基因玉米 M0N88017的百分含量。以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因玉米ΜΟΠ88017的定性和定量PCR檢測提供了簡單、可靠的測定方法，可以用于轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017的檢測。本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因標識提供了一種有用的參考，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的控制提供了必要的手段。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因，其特征在于其序列如序列表中1所示，具體如下aaattttgtcctgaacccctaaaatcccaggaccgccacctatcatatacatacatgatc60ttctaaatacccgatcagagcgctaagcagcagaatcgtgtgacaacgctagcagctctc120ctccaacacatcatcgacaagcaccttttttgccggagtatgacggtgacgatatattca180attgtaaatggcttcatgtccgggaaatctacatggatcagcaatgagtatggtggtcaa240tatggagaaaaagaaagagtaattaccaattttttttcaattcaaaaatgtagatgtccg300cagcgttattataaaatgaaagtacattttgataaaacgacaaattacgatccgtcgtat360ttataggcgaaagcaataaacaaattattctaattcggaaatctttatttcgacgtgtct420acattcacgtccaaatgggggcttagatgagaaacttcacgatttggcgcgccaaagctt480actcgaggtcattcatatgcttga504。
2.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因的提取方法，其特征在于，步驟如下(1)提取轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017基因組DNA采用Dra I,EcoR V,Pvu II,Stu I四種限制性內(nèi)切酶進行充分酶切，并對酶切產(chǎn)物進行純化；(2)引物設(shè)計利用BDGenomeWalker試劑盒提供的接頭引物APl和AP2，其序列分別為APl 5' -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3‘；AP2 5' -ACTATAGGGCACGCGTGGT-3‘；另外，參照Mon88017插入載體結(jié)構(gòu)序列設(shè)計引物序列如下P-ractgspl 5' -CTTTAGGACTTTAGGGGTTGTT-3‘；P-ractgsp2 5' -GGACTATCCCGACTCTCTTC-3‘；(3)以轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017基因組酶切產(chǎn)物為模板進行兩輪PCR擴增引物對APl和 P-ractgspl用于第一輪PCR反應，擴增體系20 μ L，PCR程序為94°C 25s，72°C :3min，6個循環(huán)；94°C 25s, 640C 30s，36 個循環(huán)；64°C延伸 7min，1 個循環(huán)；引物對 AP2 和 P_ractgsp2 用于第二輪PCR，在第二輪PCR中用IyL第一輪擴增產(chǎn)物的50倍稀釋液作為模板，PCR擴增體系和反應程序與第一輪PCR相同；第二輪PCR產(chǎn)物即為轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因。
3.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因應用于特異性定性檢測玉米及相關(guān)產(chǎn)品是否含有M0N88017轉(zhuǎn)化事件。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于定性檢測時，方法如下(1)首先，根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因的序列設(shè)計引物，引物序列如下Mon88017-F 5' -TCCTGAACCCCTAAAATCCC-3‘； Mon88017-R 5' -TTTCTCATCTAAGCCCCCAT—3‘；(2)提取待檢測樣品的基因組DNA，并以此為模板，利用Mon88017-F和Mon88017-R引物組合進行PCR擴增；(3)上述PCR擴增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產(chǎn)物；若存在擴增產(chǎn)物，則待檢測樣品含有M0N88017轉(zhuǎn)化事件；若不存在擴增產(chǎn)物，則待檢測樣品中不含有M0N88017轉(zhuǎn)化事件。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述步驟O)中PCR程序為95°C5min 預變性；94°C 30s, 580C 30s, 72°C 30s，36 個循環(huán)；72°C延伸 7min。
6.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因應用于特異性定量檢測玉米及相關(guān)產(chǎn)品是否含有M0N88017轉(zhuǎn)化事件及其含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于定量檢測時，方法如下(1)建立M0N88017轉(zhuǎn)化體特異性引物的定量PCR標準曲線和zSSUb基因的定量PCR 標準曲線①構(gòu)建M0N88017轉(zhuǎn)化體特異性標準分子將含有M0N88017特異性序列和玉米內(nèi)標準基因zSSUb特異性序列連接到pUC57質(zhì)粒并導入大腸桿菌，制備表達載體；②培養(yǎng)上述大腸桿菌，使用質(zhì)粒提取法試劑盒提取質(zhì)粒DNA，并用紫外分光光度計測定其OD值，計算出質(zhì)量濃度，計算出相應的拷貝數(shù)；③對質(zhì)粒DNA進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入M0N88017轉(zhuǎn)化事件的特異性引物和熒光標記探針，以及zSSnb基因的國家標準引物及探針，進行擴增；④擴增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制M0N88017轉(zhuǎn)化事件的定量PCR標準曲線和zSSUb基因的定量PCR標準曲線；(2)提取純化待檢測樣品基因組DNA，然后向基因組DNA提取液中分別加入M0N88017 的特異性引物和熒光標記探針，以及zSSnb基因的國家標準引物及探針，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的M0N88017基因的定量PCR標準曲線和zSSnb基因的定量PCR標準曲線，計算出相對應的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標準基因zSSUb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017的百分含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于所述步驟(1)③中，M0N88017基因的特異性引物和熒光標記探針是根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因序列設(shè)計的，具體如下Mon88017-Fl GGACATGAAGCCATTTACAATTGA ；Mon88017-Rl GCTCTCCTCCAACACATCAT ；Mon88017-Probe :FAM-ATATCGTCACCGTCATACTCCGGCAA_TAMRA。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于所述步驟(1)③中，擴增的參數(shù)如下擴 ±曾反應體禾只為 50 μ 1，2XPremix Ex Taq25 μ 1，濃度 10 μ mol/L 的 Forward Primer2 μ 1, 濃度 10ymol/L 的 Reverse Primer2 μ 1,濃度 10ymol/L 的 TaqMan Probe2 μ 1, 50 X ROXReference Dye 1 μ 1，DNA 模板 2· 0 μ 1，ddH2016 μ 1 ；擴增反應條件95°C 預變性 305，951變性55，601退火/延伸31S，共計40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了轉(zhuǎn)基因玉米MON88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因，其序列如序列表中1所示。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米MON88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因可以用于特異性定性檢測轉(zhuǎn)基因玉米及相關(guān)產(chǎn)品是否含有MON88017轉(zhuǎn)化事件以及其含量，該檢測方法靈敏，準確，簡單，可靠，具有廣闊的市場前景。本發(fā)明首次分析并確認了轉(zhuǎn)基因玉米Mon88017轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)序列中不同堿基的來源，并確定外源插入載體序列和玉米基因組序列的接合位點，為科學研究做出了貢獻。
文檔編號C12Q1/68GK102206632SQ20111005848
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月11日
發(fā)明者孫紅煒, 李凡, 武海斌, 袁磊, 路興波, 韓偉 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所