專利名稱：花生Δ¹²-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計了一種農(nóng)作物基因快速分型方法，尤其涉及一種花生基因的快速分型方法。
背景技術(shù)：
花生是我國重要的油料作物和出口商品，有研究表明，油酸含量高的花生油可以有效降低人體內(nèi)有害膽固醇水平，而不產(chǎn)生副作用。在花生中Δ12-脂肪酸脫氫酶(FAD2)的功能是催化油酸脫氫，使之轉(zhuǎn)化成具有兩個雙鍵的亞油酸。通常情況下，脂肪酸分子上雙鍵越多越易氧化變質(zhì)，食品保質(zhì)期越短。而且亞油酸既能降低人體內(nèi)有害膽固醇的含量，也能降低有益膽固醇含量，因此，培育高油酸/亞油酸比值的花生品種，使FAD2的酶活性降低， 大大提高花生中油酸的含量，成為當前花生育種工作中的重要目標之一。花生是異源四倍體植物，F(xiàn)AD2A基因和FAD2B基因分別來自兩套基因組，兩基因的序列高度相似。目前，國內(nèi)外已報道獲得了油酸/亞油酸比值異常高的高油酸花生突變品系。經(jīng)檢測，其中的FAD2A和FAD2B基因均已發(fā)生突變。FAD2A基因發(fā)生錯義突變，編碼區(qū)第448位堿基由G突變?yōu)锳(即FAD2A 448G > A) ；FAD2B基因突變最常見的一種情況是編碼區(qū)第442位插入一個A，導致移碼突變(即FAD2B 441_442insA)。兩個基因所編碼的酶活性大幅降低，因此表現(xiàn)為高油酸性狀；FAD2A和FAD2B的等位基因中只要有一個是正常的， 便不會出現(xiàn)高油酸性狀。此種花生高油酸突變體在育種工作中可作為親本與具有其他優(yōu)良性狀的材料雜交，以培育同時具有高油酸性狀和高產(chǎn)、抗逆或高油等優(yōu)良性狀的花生品種。從育種應用的角度看，在正常油酸X高油酸(FAD2A 448G > A和 FAD2B441_442insA)花生雜交組合中，需要從F1 (或F。)和F2 (或F1 2)雜交后代中選擇出同時具有FAD2A和FAD2B突變型基因的真實雜種個體。在此將FAD2A野生型基因表示為 A，突變的等位基因表示為a ；將FAD2B野生型基因表示為B，突變等位基因表示為b。具有 Aa/aa/Bb/bb基因型的個體，即為我們所要選擇保留的真實雜種。目前，在花生高油酸育種上應用的選擇技術(shù)主要有SSR標記、qPCR法、CAPS標記法、直接測序法、AS-PCR法以及近紅外光譜掃描法等，前3種方法操作步驟繁瑣或需要特殊的設(shè)備，直接測序雖可以確定基因型但價格不菲，當后代群體數(shù)目龐大時費用之高難以承受。通過等位基因特異PCR(AS-PCR) 的方法來檢測花生FAD2A和FAD2B基因型已有報道，但在應用上具有局限性，難以區(qū)分AaBB 和aaBB、AABb和AAbb基因型。近紅外光譜掃描不能識別F2代同時具備FAD2A、FAD2B突變基因而這兩個基因尚未純合的材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)效果能夠克服上述缺陷，提供一種花生Δ 12-脂肪酸脫氫酶快速分型方法，其可以通過一次實驗過程得出大量雜交后代的基因型。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，其包括如下步驟(1)針對脂肪酸脫氫酶FAD2A、FAD2B的野生型和突變型基因各設(shè)計一套PCR引物組合和檢測體系；( 采用通用的PCR反應程序；(3)瓊脂糖凝膠檢測判讀個體的基因型，每個檢測體系中出現(xiàn)一條1241bp的內(nèi)參帶，標志PCR反應程序成功。根據(jù)FAD2A和FAD2B基因之間的序列差異以及兩基因自身野生型和突變型等位基因之間的序列差異，設(shè)計了專門用來分別檢測這4個等位基因的PCR引物組合。對4個等位基因分別設(shè)置25 μ 1 PCR檢測體系，簡述如下。體系(1)檢測FAD2A野生型等位基因 2XTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1 ；引物 FAD2A-F :1 μ 1 ；引物 FAD2A-G :1 μ 1 ；引物 FAD2-R :0· 1-0. 8μ 1 ；模板 DNA :< Iyg;ddH20 補至 25 μ 1。體系(2)檢測FAD2A 突變型等位基因2XTaq PCR MasterMix 12. 5 μ 1 ；引物 FAD2A-F :1 μ 1 ；引物 FAD2A-A :1 μ 1 ；引物 FAD2-R :0· 1-0. 8μ 1 ；模板 DNA < 1 μ g ；ddH20 補至 25 μ 1。體系(3)檢測FAD2B 野生型等位基因:2XTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1 ；引物 FAD2B-F :1 μ 1 ；引物 FAD2B-C :1 μ 1 ；引物 FAD2-R 0. 1-0. 8 μ 1 ；模板 DNA < 1 μ g ；ddH20 補至 25 μ 1。體系(4)檢測FAD2B 突變型等位基因2XTaq PCR MasterMix 12. 5 μ 1 ；引物 FAD2B-F :1 μ 1 ；引物 FAD2B-A :1 μ 1 ；引物 FAD2-R :0· 1-0. 8μ 1 ；模板 DNA < 1 μ g ；ddH20 補至 25 μ 1。其中所述的引物FAD2A-F 序列(5‘一 3，，下同)為 GATTACTGATTATTGACTTGCTTTG ；
弓 I 物 fad2a-g 序列 Sgttttgggacaaacacttcttc;弓 | 物 fad2-R 序列為 ctctgactatgcatcagaacttgt ；弓丨物 fad2a-a 序列為 gttttgggacaaacacttcttt ；弓丨物 fad2b-f 序列為 cagaaccattagctttgtagtagtg ；引物 fad2b-c 序列為 aacacttcgtcgcggttg ； 引物 fad2b-a 序列為 aacacttcgtcgcggttt。四組PCR反應體系采用共同的反應程序94°C預變性lmin，94°C變性30-4 ，53°C 復性30-45s，72°C延伸90s，進行30個循環(huán)；72°C后延伸5min ；4°C保存。電泳檢測采用瓊脂糖電泳，取6μ 1 PCR產(chǎn)物，以Ιμ DL2000Ma rker (Takara)作為對照。電壓130V，電泳20min，紫外光下觀察。所有體系中都應有1條1241bp的內(nèi)參帶，這是PCR反應成功的標志。體系(1)和體系O)的目的帶為557bp，體系(3)和體系(4)的目的帶為539bp。在內(nèi)參帶存在的前提下，有目的帶就證明基因組中存在此等位基因。應用本發(fā)明的方法來鑒定FAD2A基因的野生型純合體、突變型純合體、野生型突變型雜合體，F(xiàn)AD2B基因的野生型純合體、突變型純合體、野生型突變型雜合體(之前測序已知其基因型)，全部獲得了準確無誤的結(jié)果。


圖1為FAD2A基因野生型純合體和突變型純合體鑒定(圖中左側(cè)為體系1，右側(cè)為體系2)；圖2為FAD2A基因野生型突變型雜合體鑒定(圖中左側(cè)為體系1，右側(cè)為體系2)；圖3為FAD2B基因野生型純合體和突變型純合體鑒定(圖中左側(cè)為體系3，右側(cè)為體系4)；圖4為FAD2B基因野生型突變型雜合體鑒定(圖中左側(cè)為體系3，右側(cè)為體系4)。
具體實施例方式本發(fā)明的具體應用方法包括如下步驟(1)采用“花生健康組織和病組織簡便快速DNA提取方法”(專利申請?zhí)?200910255786. 0)中所述花生子葉組織薄片快速提取待測樣品DNA作為PCR模板。(2)配制前述四種PCR檢測體系，分別加入待測模板。(3)將配好的檢測體系放在同一臺PCR儀中，同時執(zhí)行前述共同反應程序。(4)反應結(jié)束后，取樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果，判讀所測樣品的基因型。判讀依據(jù)為，在擴增得到內(nèi)參帶的前提下，每個體系中擴增得到了目的帶，即證明存在該等位基因，反之即不存在該等位基因。例如，體系(1)和(3)有目的帶，被測樣品的基因型即為AABB ；體系⑵和(4)有目的帶，被測樣品的基因型即為aabb;體系(1)、(2)和 (3)有目的帶，被測樣品的基因型即為AaBB ；體系(1)、⑵和(4)有目的帶，被測樣品的基因型即為Aabb ；體系(1),(3)和(4)有目的帶，被測樣品的基因型即為AABb ；體系(2)、(3) 和⑷有目的帶，被測樣品的基因型即為aaBb;體系(1)“2)、(3)和⑷都有目的帶，被測樣品的基因型即為AaBb。花生高油酸雜交育種可行的方案是正常油酸花生與高油酸花生(FAD2A448G > A 和FAD2B441_442insA)雜交，采用本方法鑒定Ftl 工真雜種，收獲F1 2種子，進行近紅外掃描。獲得的高油酸材料繼續(xù)就其他農(nóng)藝性狀進行選擇；獲得的中油酸材料進一步采用本法進行基因分型，獲得同時具有FAD2A、FAD2B突變型基因的花生材料(這樣的材料后代還有可能分離出高油酸材料)，在F2代結(jié)合田間表現(xiàn)進行選擇；收獲F2 3種子，進行近紅外掃描，獲得高油酸材料。對F3代及后期世代其他農(nóng)藝性狀繼續(xù)選擇，直至育成兼具高油酸和其他優(yōu)良特性的花生品種。這種方法對于育成高油酸高產(chǎn)型花生品種是極為有利的。
權(quán)利要求
1.一種花生Δ 12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法，其特征在于，包括如下步驟(1)針對脂肪酸脫氫酶基因FAD2A、FAD2B的野生型和突變型基因各設(shè)計一套PCR引物組合和檢測體系；(2)采用通用的PCR反應程序；(3)瓊脂糖凝膠檢測判讀個體的基因型，每個檢測體系中出現(xiàn)一條1241bp的內(nèi)參帶， 標志PCR反應程序成功。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生Δ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法，其特征在于，對 FAD2A和FAD2B的野生型和突變型基因各設(shè)置25 μ 1 PCR檢測體系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的花生Δ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法，其特征在于， FAD2A野生型基因的檢測體系為2XTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1 ； 引物 FAD2A-F :1μ 1 ； 引物 FAD2A-G :1μ 1 ； 引物 FAD2-R 0. 1-0. 8 μ 1 ； 模板 DNA < 1μ g ； ddH20 補至 25 μ 1。
4 根據(jù)權(quán)利要求3所述的花生Δ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法，其特征在于，所述的引物FAD2A-F序列為GATTACTGATTATTGACTTGCTTTG ；引物FAD2A-G序列為 GTTTTGGGACAAACACTTCTTC ；引物 FAD2-R 序列為 CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的花生Δ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法，其特征在于， FAD2A突變型基因的檢測體系為2XTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1 ； 引物 FAD2A-F :1μ 1 ； 引物 FAD2A-A :1μ 1 ； 引物 FAD2-R 0. 1-0. 8 μ 1 ； 模板 DNA < 1μ g ； ddH20 補至 25 μ 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的花生Δ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法，其特征在于，所述的引物FAD2A-F序列為GATTACTGATTATTGACTTGCTTTG ；引物FAD2A-A序列為 GTTTTGGGACAAACACTTCTTT ；引物 FAD2-R 序列為 CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的花生Δ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法，其特征在于，F(xiàn)AD2B野生型基因的檢測體系為2XTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1 ； 引物 FAD2B-F :1μ 1 ； 引物 FAD2B-C :1μ 1 ； 引物 FAD2-R 0. 1-0. 8 μ 1 ； 模板 DNA < 1μ g ； ddH20 補至 25 μ 1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的花生Δ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法，其特征在于，所述的引物FAD2B-F序列為CAGAACCATTAGCTTTGTAGTAGTG ；引物FAD2B-C序列為 AACACTTCGTCGCGGTTG ；引物 FAD2-R 序列為 CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的花生Δ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法，其特征在于， FAD2B突變型基因的檢測體系為2XTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1 ； 引物 FAD2B-F :1μ 1 ； 引物 FAD2B-A :1μ 1 ； 引物 FAD2-R 0. 1-0. 8 μ 1 ； 模板 DNA < 1μ g ； ddH20 補至 25 μ 1。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的花生Δ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法，其特征在于，所述的引物FAD2B-F序列為CAGAACCATTAGCTTTGTAGTAGTG ；引物FAD2B-A序列為 AACACTTCGTCGCGGTTT ；引物 FAD2-R 序列為 CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT。
全文摘要
本發(fā)明設(shè)計了一種農(nóng)作物基因快速分型方法，尤其涉及一種花生基因的快速分型方法。本發(fā)明的花生Δ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法，包括如下步驟(1)針對脂肪酸脫氫酶基因FAD2A、FAD2B的野生型和突變型基因各設(shè)計一套PCR引物組合和檢測體系；(2)采用通用的PCR反應程序；(3)瓊脂糖凝膠檢測判讀個體的基因型，每個檢測體系中出現(xiàn)一條1241 bp的內(nèi)參帶，標志PCR反應程序成功。應用本發(fā)明的方法來鑒定FAD2A基因的野生型純合體、突變型純合體、野生型突變型雜合體，F(xiàn)AD2B基因的野生型純合體、突變型純合體、野生型突變型雜合體(之前測序已知其基因型)，全部獲得了準確無誤的結(jié)果。
文檔編號C12Q1/68GK102199661SQ20111005856
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月11日
發(fā)明者于洪濤, 唐月異, 張建成, 張樹偉, 李貴杰, 楊偉強, 王傳堂, 王秀貞, 禹山林, 髙華援 申請人:山東省花生研究所