專利名稱:一對(duì)基于gyrB基因的沙門氏菌PCR快速檢測(cè)引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于致病菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一對(duì)基于gyrB基因,能夠快速檢測(cè)沙門氏菌的PCR引物。
背景技術(shù):
沙門氏菌是導(dǎo)致食物中毒和食源性疾病的主要病原菌之一,由于沙門氏菌導(dǎo)致的疾病發(fā)病率正在逐年上升。2008年美國圣保羅沙門氏菌感染疫情爆發(fā),沙門氏菌蔓延至23 個(gè) 州,228人感染,其中造成一人死亡。我國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局明確規(guī)定沙門氏菌為必檢項(xiàng)目。因此準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)食物及環(huán)境中的沙門氏菌,對(duì)于沙門氏菌防治具有十分重要的意義?,F(xiàn)有技術(shù)中,運(yùn)用PCR方法已經(jīng)成為快速檢測(cè)沙門氏菌的方法之一,但是由于所選用引物的基因通常是功能基因,因此并不能把沙門氏菌屬的所有沙門氏菌均檢測(cè)出來, 因此有一定的局限性?;没蚣创傩?gyrase)的B亞單位基因,屬于信息通路中與DNA復(fù)制、限制、 修飾或修復(fù)有關(guān)的蛋白編碼基因。WTi 基因序列全場(chǎng)約1.2 1.4kb,平均堿基替換率為每 100萬年變化0. 79Π). 8%,比16S rDNA的每5000萬年變化1%的速度快。另外,由于其作為蛋白編碼蛋白,其所固有的遺傳密碼子的兼并性使得DNA序列可以發(fā)生較多的變異而不改變氨基酸序列,尤其是密碼子的第三位堿基,這就使得^jri 基因序列在鑒定細(xì)菌近緣種方面,具有較高的分辨率。1995年,Yamamoto等根據(jù)大腸桿菌、惡臭假單胞菌和枯草芽孢桿菌的GyrB亞蛋白兩端的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物,并對(duì)不同的種群的細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增, 研究結(jié)果表明這組引物可以擴(kuò)增(G+C)含量低的革蘭氏陽性菌、大部分革蘭氏陰性菌。 Lzumi等通過分析9株變形假單胞菌的^jri 基因序列,設(shè)計(jì)出特異性引物,并對(duì)腸道和腎臟樣品進(jìn)行PCR分析,結(jié)果表明,此種方法可以快速檢測(cè)由變形假單胞菌引起的疾病。目前, ^jri 基因序列分析在蛭弧菌屬、芽孢桿菌屬、巴氏肺炎球菌屬和苯酚分解菌等相近菌株的快速檢測(cè)中效果顯著。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明提供了一對(duì)基于WTi 基因,能夠快速檢測(cè)沙門氏菌的PCR引物, 此對(duì)引物能夠高效、快速地檢測(cè)出試樣中含有的各種沙門氏菌。技術(shù)方案提供了一對(duì)WTi 基因,能夠快速檢測(cè)沙門氏菌的PCR引物,該引物包括如下基因序列
S-P-for :5’ -GGTGGTTTCCGTAAAAGTA-3‘S-P-rev :5, -GAATCGCCTGGTTCTTGC-3,
有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的引物具有檢測(cè)周期短、操作簡單、結(jié)果可靠及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),有助于對(duì)人和動(dòng)物常見所有沙門氏菌病的早期臨床診斷,并對(duì)于公共衛(wèi)生, 畜牧獸醫(yī)和口岸檢疫中的致病性沙門氏菌的檢出具有重要意義。
圖1是應(yīng)用本發(fā)明沙門氏菌PCR快速檢測(cè)引物的檢測(cè)準(zhǔn)確性結(jié)果圖。
圖2是應(yīng)用本發(fā)明沙門氏菌PCR快速檢測(cè)引物的檢測(cè)靈敏度結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例
1、引物的設(shè)計(jì)通過分別對(duì)所有已知的沙門氏菌基因組序列進(jìn)行比較分析,選擇無二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段(沙門氏菌^jri 基因),設(shè)計(jì)多對(duì)引物,引物長度一般為20個(gè)堿基左右,引物間和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列。最優(yōu)引物組合如下
S-P-for :5’ -GGTGGTTTCCGTAAAAGTA-3‘ S-P-rev :5, -GAATCGCCTGGTTCTTGC-3,
2、現(xiàn)采用該引物,對(duì)7株常見沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)以6株糞便中常見的其它致病菌株做為對(duì)照,來驗(yàn)證本發(fā)明快速檢測(cè)弓I物的準(zhǔn)確性及靈敏度。菌株沙門氏菌第II 亞屬 Salmonella sub-genus II (CMCC50215)、沙門氏菌第 III HSalmoimlla sub-genus III b (CMCC50381 )、腸炎沙門氏菌 fehfweWa en teri tidis (CMCC50335 )、腸炎沙門氏菌 danysz 變種 Salmonella en teri tidis var. danysz (CMCC50100 )、雞沙門氏菌 Salmonella gallinarum (CMCC50770 )、山夫登堡沙門氏 1 Salmonella senftenberg (CMCC 50210)和曼徹斯特沙門氏菌manchester (CMCC50380)。大腸桿i Escherichia coli (ATCC 25922)、糞鏈球 M Streptococcus faecal is (CMCC 32223)、陰溝腸桿菌你iero 力 acier cloacae (CMCC 45301)、產(chǎn)氣腸桿 1 Enterobacter aerogenes (CMCC 45103)、弗勞地枸櫞酸桿菌 CYiro Bacter freumdii (CMCC48001)和弗氏志賀菌flexneri (CMCC 51229)。以上標(biāo)準(zhǔn)菌株均采購于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心。培養(yǎng)條件37°C培養(yǎng)24h。PCR具體實(shí)施步驟如下
1) PCR反應(yīng)體系(25 μΡ_
_名稱I體積—
無菌水_20. ^L
10X Buffer (IOOmMTris - HCl, 15mMMgCl2, 500mMKCl)2. 5μΙ
IOmMdNTP0.2μΙ
S-P-for0. 5μ
S-P-rev0. 5μΙ
2. 5UTaqPolymerase|θ. 2μΙ
權(quán)利要求
1. 一對(duì)基于沙門氏菌^Fri 基因?qū)R恍蛄械腜CR快速檢測(cè)引物,其特征在于在引物包括如下基因序列S-P-for :5’ -GGTGGTTTCCGTAAAAGTA-3‘ S-P-rev :5, -GAATCGCCTGGTTCTTGC—3,。
全文摘要
本發(fā)明公開了一對(duì)基于gyrB基因的沙門氏菌PCR快速檢測(cè)引物,該引物包括如下基因序列S-P-for5’-GGTGGTTTCCGTAAAAGTA-3’;S-P-rev5’-GAATCGCCTGGTTCTTGC-3’。本發(fā)明的引物具有檢測(cè)周期短、操作簡單、結(jié)果可靠及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),有助于對(duì)人和動(dòng)物常見所有沙門氏菌病的早期臨床診斷,并對(duì)于公共衛(wèi)生,畜牧獸醫(yī)和口岸檢疫中的致病性沙門氏菌的檢出具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102154493SQ20111005881
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月11日
發(fā)明者葉旭紅, 林先貴, 王一明 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南京土壤研究所