專利名稱：基因GmEXPB2在提高大豆植株磷吸收效率方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)大豆的擴(kuò)張蛋白基因在提高大豆植株磷吸收效率方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆是重要的糧食、油料、飼料和能源兼用作物。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，作為具有生物固氮能力的豆科植物，大豆是一種優(yōu)良的輪作換茬和間套作作物，具有培肥土壤、改良土壤結(jié)構(gòu)、肥地養(yǎng)地，減少水土流失、增加土壤復(fù)種指數(shù)等顯著的生態(tài)效應(yīng)。目前，大豆作為油料作物的需求越來越大，國內(nèi)大豆供求出現(xiàn)嚴(yán)重失衡。2000年中國年進(jìn)口大豆突破1000萬噸，成為世界上最大的大豆進(jìn)口國。入世后，中國大豆的進(jìn)口步伐加快，2003 - 2007年連續(xù)五年大豆進(jìn)口量超過當(dāng)年國內(nèi)生產(chǎn)量，2005年進(jìn)口量2500萬噸，2007年進(jìn)口量3500萬噸。據(jù)預(yù)測我國大豆的需要量還會(huì)不斷增長，在將來的5-10年內(nèi)將達(dá)到每年4000-5000萬噸(http: //www. jyqh. cn/article. php/24167)。因此，在我國發(fā)展大豆生產(chǎn)不僅關(guān)系到國計(jì)民生和糧食安全，還關(guān)系到我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)建設(shè)和農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。然而，大豆生產(chǎn)往往會(huì)受到許多生物和非生物脅迫的影響，產(chǎn)量很不穩(wěn)定。尤其是在我國華南地區(qū)酸性紅壤上，缺磷和鋁毒是限制大豆生產(chǎn)的主要障礙因子(Liao et al, 2006)。磷是植物正常生長和發(fā)育的必需營養(yǎng)元素之一。然而，大部分土壤中植物可以直接吸收的無機(jī)磷有效性較低，并且有限的磷主要集中在耕層土壤中，隨著土壤剖面深度的增加而降低(Lynch和Brown，1999)。植物根構(gòu)型，即根系在三維生長介質(zhì)中的空間分布，決定了植物根系所接觸到的土壤體積的大小，因此與磷吸收效率密切相關(guān)。并且，植物對(duì)于土壤中的磷的吸收主要依靠根系吸收其周圍所接觸到的磷，植物根系在土壤有效磷含量相對(duì)較高的區(qū)域分布越多，根系接觸到的土壤體積越大，越有利于根系對(duì)土壤中磷的吸收(嚴(yán)小龍等，2000)。Zhao等和劉靈等(2004和2008)的研究發(fā)現(xiàn)，淺根型大豆根系具有合理的三維空間分布，在土壤淺層根系分布較多，有利于對(duì)耕層土壤磷的吸收，從而顯著提高了大豆的磷效率和產(chǎn)量。He等(2003)通過分層磷處理水稻根系，發(fā)現(xiàn)局部供磷促進(jìn)了側(cè)根分枝分化， 從而增加了根系接觸土壤的面積，中上層局部供磷的水稻地上部生物量和吸磷量幾乎與全層供磷相當(dāng)。因此，通過轉(zhuǎn)基因方法改變大豆植株根構(gòu)型，讓較多的根系分布在有效磷含量相對(duì)越高的耕層，是有效提高作物吸收利用土壤磷、解決限制大豆生產(chǎn)中缺磷問題的重要途徑。目前的研究已發(fā)現(xiàn)多個(gè)調(diào)控磷高效根構(gòu)型建成的關(guān)鍵新基因。其中，Lee等 (2003)在大豆上發(fā)現(xiàn)一個(gè)根系特異表達(dá)的α-擴(kuò)張蛋白基因(βΒ￡ Ρ7)，在煙草的異源表達(dá)分析表明該基因可能與根的伸長有關(guān)。擬南芥上也報(bào)道了兩個(gè)α-擴(kuò)張蛋白基因
和Ji^TWS的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)它們是根毛特異表達(dá)的(Cho和Cosgrove，2002)。大麥編碼擴(kuò)張蛋白的HvEXPBI基因也是根部特異表達(dá)的，而且與根毛的形成有緊密聯(lián)系 (Kwasniewski 和 Szarejko, 2006)。此外，在水稻(Shin 等，2005)和玉米(Wu 等， 2001)的根部也分別發(fā)現(xiàn)了 α-和β-擴(kuò)張蛋白的特異表達(dá)。最近，Guo等(2011)在大豆上發(fā)現(xiàn)一個(gè)β-擴(kuò)張蛋白基因(6fe￡i7^ )，其屬于分泌蛋白，定位于細(xì)胞壁。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果顯示GmEXPB2在大豆的根部強(qiáng)表達(dá)，在花器官有低表達(dá)量，葉部則不表達(dá)。在擬南芥中異源表達(dá)GmEXPB2，結(jié)果顯示在缺磷條件下，轉(zhuǎn)基因植株的主根長、側(cè)根長和側(cè)根數(shù)目都顯著增加，葉面積明顯增大，開花期延遲。此外，似參與了根系對(duì)缺磷的適應(yīng)性反應(yīng)，在體內(nèi)供磷不足的條件下，能刺激主根、側(cè)根繼續(xù)生長和側(cè)根原基的形成，維持根系正常生長(Guo等，2011)。在大豆復(fù)合植株中過量表達(dá)和干涉似的結(jié)果表明，低磷條件下，其能顯著促進(jìn)轉(zhuǎn)基因毛狀根的生長(Guo等，2011)。有關(guān)轉(zhuǎn) 化調(diào)控根構(gòu)型建成的關(guān)鍵基因來改變轉(zhuǎn)基因植株自身根系空間分布和構(gòu)型，從而利用介質(zhì)中有限的有效磷的報(bào)道并不多見。而將大豆本身的擴(kuò)張蛋白基因
在大豆中過量表達(dá)從而提高植株的磷吸收效率還未見報(bào)道。MGinEXPB2的研究尚停留在其表達(dá)模式和作用功能理論研究階段，并無關(guān)于GmEXPB2在大豆整株中表達(dá)提高大豆植株對(duì)根際有限的土壤中有效態(tài)無機(jī)磷的吸收的技術(shù)方案的相關(guān)技術(shù)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供基因GmEXPB2在提高大豆植株磷吸收效率方面的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述基因SbETZ^ 在大豆植株中的表達(dá)方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來予以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明提供了基因在提高大豆植株磷吸收效率方面的應(yīng)用。所述應(yīng)用是在大豆中超量表達(dá)編碼大豆β -擴(kuò)張蛋白的新基因GmEXPB20所述β -擴(kuò)張蛋白基因GmEXPB2參看Guo等(2011)的研究技術(shù)文獻(xiàn)中描述。該基因全長cDNA為1048bp (EU362626)，編碼227個(gè)氨基酸，分子量是29. 5KD。本發(fā)明通過 PCR方法，擴(kuò)增出基因的編碼區(qū)，由強(qiáng)啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)，連接到超量表達(dá)載體上；再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在大豆中超量表達(dá)這個(gè)基因，得到超量表達(dá)植株。在轉(zhuǎn)基因T3和T4代植株中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的吸磷量和生物量都顯著高于陰性植株。本發(fā)明同時(shí)提供了實(shí)現(xiàn)所述應(yīng)用的表達(dá)方法，具體包括以下步驟
(1)以GmEXPB2的基因組片段作為應(yīng)用基因，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出基因的編碼區(qū)， 由強(qiáng)啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)，連接到超量表達(dá)載體上；
(2)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在大豆中超量表達(dá)所述基因，得到超量表達(dá)大豆植株。步驟(1)所述引物為 正向(左端)(5，-3，) AAAACCCGGGCTATCAACTACCTATAGGGAAC ； 反向(右端)引物(5’-3’) AAAATCTAGACCACAAGCTGATGATAGATCC。所述大豆品種優(yōu)選粵春03-3。采用根癌農(nóng)桿菌EHAlOl介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化方法，在大豆品種粵春03-3中，超量表達(dá)基因，得到超量表達(dá)的大豆植株。 所述遺傳轉(zhuǎn)化包括以下步驟
(1)種子消毒和種子萌發(fā)；
(2)根癌農(nóng)桿菌EHAlOl菌液制備；(3)外植體制備及轉(zhuǎn)化程序；
(4)侵染與共培養(yǎng)；
(5)幼芽的誘導(dǎo)、伸長
(6)幼芽生根，得到轉(zhuǎn)基因單株Ttl代植株。選擇超表達(dá)的植株，進(jìn)行繁種，得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因后代株系。本發(fā)明構(gòu)建 了過量表達(dá)載體，在大豆中超量表達(dá)了編碼擴(kuò)張蛋白的 GmEXPB2基因，轉(zhuǎn)GmEXPB2基因植株顯著提高了對(duì)土壤磷的吸收和利用，研究結(jié)果對(duì)培育磷高效大豆新品種具有重要的意義，在生產(chǎn)上具有較大的應(yīng)用前景。本發(fā)明的有益效果概括如下
(1)本發(fā)明提供了一種大豆的β-擴(kuò)張蛋白基因^BfiiPi泛的新應(yīng)用。本發(fā)明成功在大豆品種粵春03-3中超量表達(dá)編碼β-擴(kuò)張蛋白的基因后，試驗(yàn)證明，在低磷土壤中，兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系的地上部和根部生物量較對(duì)照大豆分別增加了 47. 3%,30. 5% 和29.9,26.8%% ；總根長和根表面積提高了 39. 2%、24. 8%和40. 8%,32. 2% ；磷吸收量提高了 54. O0AAl. 3%。(2)通過本發(fā)明方法過量表達(dá)SbETZ^ 可以改變轉(zhuǎn)基因大豆根系形態(tài)構(gòu)型，在有效磷分布相對(duì)越多的耕層土壤中吸收更多的磷，提高磷的吸收效率，從而促進(jìn)大豆的生長。 這是一項(xiàng)能有助于減少磷肥的大量使用對(duì)環(huán)境構(gòu)成威脅的，并對(duì)國家未來可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展提供有利支持的新技術(shù)。(3)本發(fā)明首次在大豆中超量表達(dá)一個(gè)影響大豆磷吸收效率的基因GmEXPB2,為培育大豆磷高效品種提供了新的思路，也為其它作物利用轉(zhuǎn)基因方法提高養(yǎng)分效率提供了技術(shù)支持。(4)本發(fā)明中應(yīng)用的基因可以為大豆等豆科作物以及其它作物的養(yǎng)分高效研究提供理論支持。


圖1超表達(dá)轉(zhuǎn)化元件的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明在實(shí)施例中描述了分離基因、遺傳轉(zhuǎn)化以及總根長、根表面積、吸磷量和生物量的測定方法和所述基因在大豆中的表達(dá)模式，但并不因此將本發(fā)明精神和范圍限定于具體的實(shí)施例中。實(shí)施例1超量表達(dá)轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建
從《Guo W, Zhao J, Li X, Qin L, Yan Χ, Liao H. A soybean β -expansin gene GwEXPB2 intrinsically involved in root system architecture responses to abiotic stresses, doi: 10. 1111/j. 1365-313X. 2011. 04511. x》的研究文獻(xiàn)中描述了 GmEXPB2 基因全長cDNA序列(EU362626)，該基因全長cDNA為1048bp，編碼227個(gè)氨基酸，分子量是 29.5KD。本發(fā)明根據(jù)基因GmEXPB2的已知全長cDNA序列設(shè)計(jì)正向引物(5’ _3’)和反向引物(5’-3’)，以大豆cDNA為模板，擴(kuò)增出基因的編碼區(qū)，擴(kuò)增條件為95°C30秒，55°C 30秒，72°C 60秒，30個(gè)循環(huán)；由強(qiáng)啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)，連接到超量表達(dá)載體 pTFlOl. 1 (美國依阿華州立大學(xué)轉(zhuǎn)基因中心王凱博士惠贈(zèng)，Paz et al, 2004)上，然后再用設(shè)計(jì)的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)對(duì)得到的克隆進(jìn)行測序，確定基因按正確的方向連接到PTF101. 1載體上。pTFlOl. 1載體包含除草劑的篩選基因，見附圖1，附圖1中， 1表示左邊界，2表示右邊界，3表示S終止子，4表示fer基因，5表示fis^ffi似基因；由附圖1可見GmEXPB2基因被35S啟動(dòng)子超表達(dá)。 所述正向(左端)引物(5’ -3’ )序列為 AAAACCCGGGCTATCAACTACCTATAGGGAAC ；
所述反向(右端)引物(5’ -3’ )序列為 AAAATCTAGACCACAAGCTGATGATAGATCC。實(shí)施例2超量表達(dá)GmEXPB2的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)
包含編碼大豆擴(kuò)張蛋白的似基因片段連接到載體PTFlOl. 1上后，采用轉(zhuǎn)基因的方法，得到轉(zhuǎn)基因的大豆植株，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因方法具體步驟如下
將得到的正確克隆的質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入到大豆品種粵春03-3中，經(jīng)過種子萌發(fā)、子葉節(jié)侵染、共培養(yǎng)、幼芽誘導(dǎo)和幼芽伸長等過程，具有除草劑抗性的幼芽伸長、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。所述農(nóng)桿菌(EHAlOl)介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系主要參考Paz等人(Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explants, 2004，Euphytica, 136: 167-179)技術(shù)報(bào)道和申請?zhí)枮?200910036465. 1的專利申請文獻(xiàn)(王秀榮等)。本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述
(1)試劑
本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的試劑為常規(guī)市購試劑，試劑和溶液及縮寫表示如下6-BA (6-BenzylaminoPurine，6-節(jié)基腺嘌呤)；ZR (Trans-Zeatin Riboside,玉米素核苷)； NAA (Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA (Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；GA3 (Gibberellic acid,赤霉素)；ASCAcetosringone,乙酰丁香酮);DTT(DL_Dithiothreitol， 二硫蘇糖醇);Glufosinate (Glufosinate-ammonium，除草劑);DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞砜);B5maX (B5大量元素成分溶液);B5mix (B5微量元素成分溶液);B5vit (B5維生素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS微量元素成分溶液)
(2)溶液配方
1) B5培養(yǎng)基大量元素母液(按照20倍濃縮液(20X)配制) 硝酸鉀(KNO3)50. 00克
磷酸二氫鈉(NaH2PO4 · 2H20)3. 00 克
硫酸銨((NH4)2SO4)2. 68 克
硫酸鎂(MgSO4 · 7H20)5. 00 克
氯化鈣(CaCl2 · 2H20)3. 00 克
將上述試劑逐一用適量蒸餾水溶解，然后用蒸餾水定容至1000毫升。2) B5培養(yǎng)基微量元素母液(按照200倍濃縮液(200X)配制碘化鉀(KI)0.15克硼酸(H3BO3)0.60 克
硫酸錳(MnSO4 · 4H20)2. 00 克
硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20)0. 40 克
鉬酸鈉(Na2MoO4 · 2H20)0. 05 克
硫酸銅(CuSO4 · 5H20)0. 005 克
氯化鈷(CoCl2 6H20)0.005 克
將上述試劑在20 25°C下用適量蒸餾水溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)
將3. 73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA · 2H20)和2. 78克FeSO4 7H20分別用蒸餾水溶解，混合并用蒸餾水定容至1000毫升，置70°C溫水浴2小時(shí)，4°C保存?zhèn)溆谩?) B5維生素貯存液(按照100X濃縮液配制) 煙酸(Nicotinic acid)0. 01 克維生素 Bl (Thiamine HCl) 0. 10 克維生素 B6 (Pyridoxine HCl) 0. 01 克
肌醇(Inositol)1.00 克
適量蒸餾水溶解上述試劑，然后用蒸餾水定容至1000毫升，4°C保存?zhèn)溆谩?) MS培養(yǎng)基大量元素母液(MSmax母液)(按照20X濃縮液配制) 硝酸銨(NH4NO3)33. 0克
硝酸鉀(KNO3)38. 0克
磷酸二氫鉀(KH2PO4)3. 4克
硫酸鎂(MgSO4 · 7H20)7. 4 克
氯化鈣(CaCl2 · 2Η20)8. 8 克
將上述試劑在20 25°C溫度下用適量蒸餾水溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。6) MS培養(yǎng)基微量元素母液(MSmin母液)(按照200X濃縮液配制) 硫酸錳(MnSO4 · 4H20)4. 46 克
硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20)1.72 克
硼酸(H3BO3)1.24 克
碘化鉀(KI)0.166克
鉬酸鈉(Na2MoO4 · 2H20)0. 05 克
硫酸銅(CuSO4 · 5H20)0. 005 克
氯化鈷(CoCl2 6H20)0.005 克
將上述試劑在20 25°C溫度下用適量蒸餾水溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。)主要抗生素配方
100 mg/mL氨芐青霉素貯備液1克氨芐青霉素+10 mL雙蒸水，過濾滅菌，-20°C保存； 50 mg/mL卡那霉素貯備液0. 5克卡那霉素+ 10 mL雙蒸水，過濾滅菌，_20°C保存； 50 mg/mL氯霉素貯備液0. 5克氯霉素+ 10 mL 80%乙醇，過濾滅菌，_20°C保存； 100 mg/mL壯觀霉素貯備液1克壯觀霉素+ 10 mL雙蒸水，過濾滅菌，_20°C保存； 200 mg/mL特美汀貯備液1. 6克特美汀+ 8 mL雙蒸水，過濾滅菌，4°C保存； 250 mg/mL頭孢霉素貯備液0. 5克頭孢霉素+ 2 mL雙蒸水，過濾滅菌，-20°C保存。
8)主要激素、氨基酸和篩選劑配方
1 mg/mL GA3 貯備液0. 0125 克 GA3 + 0. 25 mL IN NaOH + 12. 25 mL 雙蒸水，過濾滅菌，4°C保存；
1 mg/mL 6-BA 貯備液0. 0125 克 6-BA + 0. 25 mL IN NaOH + 12. 25 mL 雙蒸水，過濾
滅菌，4°C保存；
1 mg/mL 吲哚乙酸 IAA 貯備液0. 0125 克 IAA + 0. 25 mL IN NaOH + 12. 25 mL 雙蒸水，過濾滅菌，4 °C保存；
0. 5 mg/mL NAA 貯備液0. 005 克 NAA + 0. 2 mLNaOH + 9. 8mL 雙蒸水，過濾滅菌，4°C 保
存；
1 mg/mL玉米素核苷貯備液10毫克玉米素+ 10 mL雙蒸水，過濾滅菌，一 20°C保存； 10 mg/mL天門冬酰胺貯備液0. 5克天門冬酰胺+ 50 mL雙蒸水，過濾滅菌，4°C保存； 10 mg/mL谷氨酰胺貯備液0. 5克谷氨酰胺+ 50 mL雙蒸水，過濾滅菌，4°C保存； 1 mg/mL除草劑貯備液0. 025克Glufosinate + 25 mL雙蒸水，過濾滅菌，4°C保存。(3)用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方 1)種子萌發(fā)培養(yǎng)基
B5max母液(取已經(jīng)制備好的20X濃縮液，下同) 50毫升 B5mix母液(取已經(jīng)制備好的200X濃縮液，下同) 5毫升 Fe2+EDTA貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)10毫升維生素貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)10毫升蔗糖
20克
Phytagel3
克
加蒸餾水至1000毫升，IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到5. 8，高壓滅菌，121°C下滅菌20 分鐘，下述的培養(yǎng)基滅菌方法與本實(shí)施例相同。2)共培養(yǎng)基
B5max母液(20X)5毫升
B5mix 母液(200X)0. 5 毫升
Fe2+EDTA貯存液(100X)1毫升
蔗糖30克
MES3. 9 克
BBL Agar5 克
加蒸餾水至985毫升，IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到5. 4，高壓滅菌培養(yǎng)基降溫至50°C 時(shí)加入已過濾滅菌的10毫升維生素貯存液(100X)，0. 25毫升GA3 (1毫克/毫升)，1. 67毫升6-BA( 1毫克/毫升)，400毫克半胱氨酸胺，154. 2毫克二硫蘇糖醇和40毫克AS，混勻后分裝倒入培養(yǎng)皿中。3)幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基
B5max母液(20X)50毫升
B5mix母液(200X)5毫升Fe2+EDTA C存液(IOOX)10 毫升
蔗糖30克
MES0. 59 克
Phytagel3 克
加蒸餾水至985毫升，IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到5. 7，高壓滅菌。培養(yǎng)基降溫至 500C時(shí)加入已過濾滅菌的10毫升維生素貯存液(100X)，1. 67毫升6-BA貯存液(1毫克/毫升)，0. 5毫升特美汀貯存液(200毫克/毫升)，0. 8毫升頭孢霉素貯存液(250毫克/毫升) 和5. 0毫升除草劑貯存液(1毫克/毫升)，混勻后分裝倒入培養(yǎng)皿中。4)幼芽伸長培養(yǎng)基
MSmax母液(20X)50毫升
MSmix母液(200X)5毫升
Fe2+EDTA 貯存液(100X)10 毫升
蔗糖30克
MES0. 59 克
Phytagel3 克
加蒸餾水至975毫升，IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到5. 7，高壓滅菌。培養(yǎng)基降溫至 50°C時(shí)加入已過濾滅菌的10毫升維生素貯存液(100X)，5毫升天門冬酰胺貯存液(10毫克 /毫升)，5毫升谷氨酰胺貯存液(10毫克/毫升)，0. 1毫升IAA貯存液(1毫克/毫升)，0. 5 毫升GA3貯存液(1毫克/毫升)，1毫升玉米素核苷貯存液(1毫克/毫升)，0. 5毫升特美汀貯存液(200毫克/毫升)，0. 8毫升頭孢霉素貯存液(250毫克/毫升)和2. 5毫升除草劑貯存液(1毫克/毫升)，混勻后分裝倒入培養(yǎng)皿中。5)生根培養(yǎng)基
B5max母液(20X)25毫升
B5mix 母液(200X)2. 5 毫升
Fe2+EDTA貯存液(100X)5毫升
B5維生素貯存液(100X)10毫升
NAA貯存液(0. 5毫克/毫升)0. 4毫升
蔗糖10克
Phytagel6 克
加蒸餾水至1000毫升，用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到5. 8。高壓滅菌后分裝倒入培
養(yǎng)瓶中。(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化步驟
試驗(yàn)方法等參考美國依阿華州立大學(xué)轉(zhuǎn)基因中心的轉(zhuǎn)化程序(Paz et al,2004)和申請?zhí)枮?00910036465. 1的專利申請文獻(xiàn)(王秀榮等)。 1)種子消毒
種子采用干燥表面消毒。將成熟的大豆種子單層排列在培養(yǎng)皿中，將裝有3 4個(gè)培養(yǎng)皿的干燥器放到通風(fēng)櫥中，并將所有的培養(yǎng)皿打開，蓋子緊挨著培養(yǎng)皿，以保證在中間有足夠的空間放置一個(gè)250mL的燒杯。在250mL燒杯中加入100 mL的次氯酸鈉(活性氯彡7.5%)，然后沿著杯壁緩緩加入4. 2 mL 12N HC1，立即蓋上干燥器的蓋子，靜置過夜(約靜置13. 5小時(shí))。在氯氣體中暴露整夜后，蓋上培養(yǎng)皿并將其放到層流凈化罩中，再將培養(yǎng)皿打開大約30 min以便除去過多的氯氣。 2)種子萌發(fā)
將10 12顆消毒后的種子種臍朝下放置在裝有種子萌發(fā)培養(yǎng)基的120X25mm培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天(24°C，18hr光照，光強(qiáng)140 m moles/m2/sec)03)菌液制備
從新鮮的YEP培養(yǎng)基上挑取含pTFlOl. \~GmEXPB2的根癌農(nóng)桿菌菌株EHAlOl的數(shù)個(gè)單克隆放入2mL添加了 100mg/L壯觀霉素、25 mg/L氯霉素和50 mg/L卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中。在搖床上(250 rpm，28°C)培養(yǎng)菌落，生長至飽和(大約12小時(shí))。取0. 3 mL飽和菌液加至裝有已加相應(yīng)抗生素的200 mL YEP培養(yǎng)基的1 L三角瓶中。培養(yǎng)菌落，過夜(250 rpm，28°C)，生長至對(duì)數(shù)生長末期(OD65tl = 1. 0 1. 2)，離心(3，500 rpm, 10 min，室溫)，收集菌落。用液體的共培養(yǎng)基(CM)懸浮農(nóng)桿菌沉淀。使用時(shí)OD65tl為1.0。4)外植體制備及轉(zhuǎn)化程序
種子在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，檢查萌發(fā)培養(yǎng)盒，舍棄污染的。用解剖刀刀片從根系上切下發(fā)芽的種子，切口在離子葉節(jié)區(qū)域大約0.5 cm的下胚軸區(qū)域。沿著子葉下胚軸垂直剖開種子，并去除子葉上胚軸(幼芽)和軸上的莖/芽。在子葉和子葉下胚軸一子葉節(jié)區(qū)域垂直于軸切出7 8個(gè)切口(約0. 5 mm深，3 4 mm長)。切好的外植體放入培養(yǎng)皿中，備用。5)侵染與共培養(yǎng)
將30 mL農(nóng)桿菌菌液倒入一個(gè)25X IOOmm的培養(yǎng)皿中。每個(gè)農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)皿準(zhǔn)備 50個(gè)外植體。確保整個(gè)外植體都被菌液懸浮。侵染30 min，期間經(jīng)常攪動(dòng)菌液，以使外植體充分接觸新鮮菌液。之后，將外植體轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上，每皿7個(gè)外植體，切口向下，水平放置。用parafilm封住培養(yǎng)皿，并將它們轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中(24°C )，暗培養(yǎng)3天。6)幼芽的誘導(dǎo)
在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，用液體幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Si)浸洗外植體，之后，將外植體放在加有3. 5mg/L glufosinate (草銨膦)作為篩選劑，100mg/L特美汀和200mg/L頭孢霉素作為抑菌劑的SI培養(yǎng)基上(每皿7個(gè)外植體)。外植體的子葉下胚軸部分須插入培養(yǎng)基中， 而再生組織則須與水平面成30 45°角斜插在表面。培養(yǎng)皿用透氣膠帶封口，5個(gè)培養(yǎng)皿一疊，培養(yǎng)(24°C，18/6hr的光照周期)。外植體組織在SI培養(yǎng)基上生長14天。在第一個(gè)星期末，重新排列每疊的培養(yǎng)皿以使頂部和底部調(diào)換。14天后，在形成中的節(jié)的部位齊平地切去子葉下胚軸。將新鮮的切口表面插入至新的SI培養(yǎng)基中，而分化區(qū)域則與培養(yǎng)基表面齊平；然后讓組織在相同的生長條件下，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)14天。7)幼芽的伸長
將分化的外植體轉(zhuǎn)移到幼芽伸長培養(yǎng)基(SE)上，丟棄其余的未分化的外植體。從外植體上切去子葉，并在正在發(fā)育的節(jié)的基部切一個(gè)新切口。將外植體轉(zhuǎn)移到新鮮的加有 2. 5mg/L glufosinate除草劑作為篩選劑，100mg/L特美汀和200mg/L頭孢霉素作為抑菌劑的SE培養(yǎng)基上，在生長箱中培養(yǎng)2 8周。每隔2周換一次新鮮的SE培養(yǎng)基。每一次換培養(yǎng)基時(shí)在外植體基部切一個(gè)新鮮的水平切口。8)生根在選擇壓力下，幼芽生長到至少3 cm長時(shí)，把它們從組織上切下來。然后將其轉(zhuǎn)移到裝有生根培養(yǎng)基的玻璃瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。兩周后，當(dāng)莖長出多于2條根時(shí)，將植株輕輕地從培養(yǎng)基中取出，用自來水沖洗根部以去除培養(yǎng)基。將苗移植到一個(gè)裝有基質(zhì)的盆(直徑15cm) 中。苗在培養(yǎng)箱中生長4周(24°C，18/6hr光照強(qiáng)度)。每周澆Hoagland營養(yǎng)液一次。然后將苗轉(zhuǎn)移到溫室培養(yǎng)至結(jié)莢。轉(zhuǎn)化大豆品種粵春03-3，得到轉(zhuǎn)基因單株TO代植株。用southern雜交檢測大豆基因組中目的基因的整合，用熒光定量PCR檢測目的基因在植株體內(nèi)的表達(dá)量。得到 超表達(dá)的植株，并且進(jìn)行繁種，得到T3和T4代穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系。實(shí)施例3超表達(dá)GmEXPB2的轉(zhuǎn)基因植株的功能鑒定
測定大豆穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系生物量、磷吸收量以及總根長和根表面積，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照大豆植株相比，表現(xiàn)出期望的表型變化，即總根長和根表面積顯著高于對(duì)照，生物量和磷吸收量也高于對(duì)照。證明了這個(gè)基因可以通過本發(fā)明遺傳轉(zhuǎn)化方法實(shí)現(xiàn)改變根系形態(tài)構(gòu)型來提高大豆植株對(duì)介質(zhì)中磷的吸收效率，這與本申請人在先研究的基因的作用機(jī)理顯著不同，本發(fā)明所述基因是通過促進(jìn)根系生長，增加根系接觸到的土壤面積，從而增加根系吸收的土壤中有效態(tài)無機(jī)磷的量。1、總根長測定
整個(gè)根系從營養(yǎng)液中取出，洗凈后，用臺(tái)式掃描儀掃描二維根系，經(jīng)WinRhizo軟件分別計(jì)算總根長、根表面積等形態(tài)參數(shù)。、植株全磷含量測定
地上部、根部樣品用樣品磨粉碎，采用干灰化，鉬藍(lán)比色法測定植株全磷含量(Murphy 和Riley，1963)，測量波長為700 nm。表1 本發(fā)明獲得的GmEXPB2 T4代穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因大豆株系在低磷土壤中的生長表現(xiàn)結(jié)果 ___
權(quán)利要求
1.基因在提高大豆植株磷吸收效率方面的應(yīng)用，其特征在于是在大豆中超量表達(dá)編碼大豆β -擴(kuò)張蛋白的基因?qū)崿F(xiàn)；所述基因GmEXPB2鋃號(hào)為，基因全長cDNA為1048bp，編碼227個(gè)氨基酸；所述超量表達(dá)是通過PCR方法，以GmEXPB2的基因組片段作為應(yīng)用基因，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出6 /基因的全長編碼區(qū)，由強(qiáng)啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)，連接到超量表達(dá)載體上，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化；所述引物為正向引物(5，-3，)AAAACCCGGGCTATCAACTACCTATAGGGAAC ；反向引物(5’-3’)AAAATCTAGACCACAAGCTGATGATAGATCC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于是在大豆中超量表達(dá)基因6 /促進(jìn)植物根系生長，增加根系吸收的土壤中有效態(tài)無機(jī)磷的量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述PCR方法的擴(kuò)增條件為95°C30秒， 55 0C 30 秒，72 °C 60 秒，30 個(gè)循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述大豆品種為粵春03-3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述遺傳轉(zhuǎn)化包括以下步驟(1)種子消毒和種子萌發(fā)；(2)根癌農(nóng)桿菌EHAlOl菌液制備；(3)外植體制備及轉(zhuǎn)化程序；(4)侵染與共培養(yǎng)；(5)幼芽的誘導(dǎo)、伸長；(6)生根，得到轉(zhuǎn)基因單株Ttl代植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了基因GmEXPB2在提高大豆植株磷吸收效率方面的應(yīng)用。本發(fā)明通過PCR方法，擴(kuò)增出GmEXPB2基因的全長編碼區(qū)，由強(qiáng)啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)，連接到超量表達(dá)載體上，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，使其在轉(zhuǎn)基因大豆中超量表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因大豆T3代和T4代植株中發(fā)現(xiàn)，GmEXPB2的過量表達(dá)提高了大豆獲取低磷生長介質(zhì)中磷的能力，進(jìn)而增加了轉(zhuǎn)基因大豆的生物量和磷吸收量。在低磷土壤中，兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系的地上部和根部生物量較對(duì)照大豆分別增加了47.3％、30.5％和29.9、26.8％％；總根長和根表面積提高了39.2％、24.8％和40.8％、32.2％；磷吸收量提高了54.0％、41.3％。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102154322SQ201110060369
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月14日
發(fā)明者嚴(yán)小龍, 廖紅, 王秀榮, 謝建娜 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)