專(zhuān)利名稱(chēng)：賴(lài)氨酸的反式發(fā)酵制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及L-賴(lài)氨酸的發(fā)酵方法，其包括將以非天然順序編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌，從而使所獲得的菌表達(dá)所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶；和在發(fā)酵條件下培養(yǎng)獲得的菌。另外，本發(fā)明還提供了所述發(fā)酵方法中所用的中間產(chǎn)物，和利用所述發(fā)酵方法進(jìn)一步生產(chǎn)產(chǎn)品等。
背景技術(shù)：
L-賴(lài)氨酸是重要的氨基酸原料，可以作為調(diào)味品、食品、飼料添加劑使用，也可以作為保健品、藥品中的有效或輔料成分，廣泛應(yīng)用于食品業(yè)、飼料業(yè)、制藥業(yè)及其他化學(xué)工業(yè)中。當(dāng)前，L-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)主要是通過(guò)微生物的發(fā)酵生產(chǎn)的，如可以利用棒狀桿菌生產(chǎn)。用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通過(guò)誘變或基因工程獲得的產(chǎn)量更高的營(yíng)養(yǎng)缺陷型、耐藥變異型和代謝變異型微生物。對(duì)于基因工程獲得的性狀改良的微生物來(lái)說(shuō)，其中至關(guān)重要的就是性質(zhì)優(yōu)異的基因。吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶是L-賴(lài)氨酸代謝途徑上重要的酶。盡管野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的亞基已經(jīng)被公開(kāi)(可參見(jiàn)NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih. gov)蛋白和基因登錄號(hào) NP416120. 1和AAC74674. 1 ；也可參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利ZL94194707)，。然而，在天然的微生物基因組中，編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基的多核苷酸位于編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基的多核苷酸的上游。另外，該酶變體的研究卻沒(méi)有報(bào)道。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期艱苦研究，令人意外地發(fā)現(xiàn)了以非天然順序編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，仍舊能夠表達(dá)出具有活性的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了新的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，其顯著提高了相應(yīng)酶的活性，在導(dǎo)入工程菌發(fā)酵的時(shí)候也獲得了更高的賴(lài)氨
酸產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供L-賴(lài)氨酸的發(fā)酵方法，其包括將編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌，從而使所獲得的菌表達(dá)所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，其中所述多核苷酸依次編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基。 另外，本發(fā)明還提供了所述發(fā)酵方法中所用的中間產(chǎn)物，和利用所述發(fā)酵方法進(jìn)一步生產(chǎn)產(chǎn)品等具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了 L-賴(lài)氨酸的發(fā)酵方法，其包括(1)將編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌，從而使所獲得的菌表達(dá)所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，其中所述多核苷酸依次編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基；和(2)在發(fā)酵條件下培養(yǎng)步驟(1)獲得的菌。由于通常認(rèn)為直接順序串聯(lián)的兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)的后一個(gè)表達(dá)量較低，而本發(fā)明中又是以吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基這兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)直接順序串聯(lián)，是非天然的串聯(lián)形式，因此是否能將表達(dá)產(chǎn)物順利組裝成有活性的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，無(wú)法事前預(yù)料。而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，即使使用此非天然的順序，仍舊能夠表達(dá)出有活性的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，用于L-賴(lài)氨酸的發(fā)酵。其中，吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶可以是野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，也可以是其β亞基變體和/或α亞基變體形成的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體。野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的，包括α亞基和β亞基，其中α亞基和β亞基的序列分別如 NCBI(http://www. ncbi.nlm.nih. gov)蛋白和基因登錄號(hào)NP416120. 1 和 AAC74674. 1 所示。然而優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶是吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體，尤其是相對(duì)于野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的活性提高的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體。因此， 優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，所述多核苷酸依次編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體，優(yōu)選其中所述多核苷酸編碼的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體相對(duì)于野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的活性提高，最優(yōu)選其核苷酸序列如SEQ ID Νο:1所示。 酶活性的測(cè)定方法是現(xiàn)有已知的，如可以采用本發(fā)明具體實(shí)施方式
中所述的方法來(lái)測(cè)定酶活性，這樣就可以確認(rèn)吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體的活性是否有提高。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，所述多核苷酸依次編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α 亞基變體和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體，即編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體的多核苷酸位于編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體的多核苷酸的上游。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID Νο:1所示。其中，所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體在Α398或D400的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換選自A398S和D400H，最優(yōu)選其氨基酸序列如SEQID No :2所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體的氨基酸序列推導(dǎo)出其編碼核苷酸序列，優(yōu)選是密碼子優(yōu)化的核苷酸序列，如針對(duì)發(fā)酵所用的菌密碼子使用情況優(yōu)化的。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體由如SEQ ID No :3所示的多核苷酸編碼。另外，其中所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體在Μ102、L127或Q322的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換選自M102L、L127R和Q322K，最優(yōu)選其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體的氨基酸序列推導(dǎo)出其編碼核苷酸序列，優(yōu)選是密碼子優(yōu)化的核苷酸序列，如針對(duì)發(fā)酵所用的菌密碼子使用情況優(yōu)化的。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體由如SEQ ID No :5所示的多核苷酸編碼。所述多核苷酸可以通過(guò)各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式被導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌，只要能夠使產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌表達(dá)所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體即可。所述多核苷酸可以直接被導(dǎo)入，例如利用微粒體、基因槍等導(dǎo)入細(xì)胞；也可以間接被導(dǎo)入，例如可以通過(guò)構(gòu)建在質(zhì)粒載體上導(dǎo)入細(xì)胞。導(dǎo)入的所述多核苷酸可以整合在細(xì)胞的基因組上表達(dá)，也可以游離表達(dá)。通常，由于產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌本身不適于作為克隆宿主菌，因此優(yōu)選所述多核苷酸是通過(guò)穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌的。其中，所述穿梭質(zhì)粒優(yōu)選是大腸桿菌和產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌的穿梭質(zhì)粒。這樣便能夠很方便地在大腸桿菌宿主中進(jìn)行DNA重組操作。產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌有許多種，本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的包括埃希氏桿菌、棒狀桿菌和沙雷氏桿菌，優(yōu)選是棒狀桿菌。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌是Corynebacterium glutamicum。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，所述發(fā)酵條件的發(fā)酵溫度為觀_351，優(yōu)選為 29-33 0C，更優(yōu)選為 30-32 0C，如 30 °C。也優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，所述發(fā)酵條件的培養(yǎng)基包含糖，NH4Cl, CaCl2,KH2PO4，蛋白胨，MgSO4,FeSO4,MnSO4，生物素，和葉酸。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述培養(yǎng)基的配方為:40g蔗糖，20g NH4Cl, 2g CaCl2, IgKH2PO4, Ig蛋白胨，5OOmg MgSO4 ·7Η20， 15mg FeSO4 ·7Η20，IOmgMnSO4 ·7Η20，200 μ g 生物素，和 50 μ g 葉酸，ρΗ7· 3，用水補(bǔ)足至 1 升。在第二方面，本發(fā)明提供了 L-賴(lài)氨酸飼料添加劑的制備方法，其包括(1)實(shí)施本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中的步驟O)；和(2)收集發(fā)酵液依次進(jìn)行膜分離并對(duì)濾液進(jìn)行噴霧干燥；(3)對(duì)步驟(2)噴霧干燥獲得的顆粒進(jìn)行篩分；(4)將篩分得到的粒徑大于等于1. 5mm的顆粒破碎，并將其與篩分得到的粒徑小于1. 5mm的顆?；旌希俅芜M(jìn)行噴霧干燥；和(5)對(duì)步驟(4)噴霧干燥獲得的顆粒進(jìn)行篩分，收集粒徑小于1. 5mm的顆粒。其中，為了使最終顆粒飼料添加劑的形狀更為均勻，流化床干燥機(jī)內(nèi)尾氣溫度不宜過(guò)高，通常不應(yīng)高于85 °C，優(yōu)選保持在80 士 3°C。本發(fā)明第二方面的制備方法還可以在實(shí)施本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中的步驟 (2)之前，包括實(shí)施本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中的步驟(1)。但是，這通常不是優(yōu)選的，因此本發(fā)明第二方面的制備方法不包括實(shí)施本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中的步驟(1)，而包括在發(fā)酵條件下培養(yǎng)產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌(尤其是高產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌)的步驟，這也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。由于本發(fā)明第二方面的制備方法已經(jīng)能夠生產(chǎn)出符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的顆粒飼料添加劑，因此優(yōu)選其中不包括包衣的過(guò)程，相應(yīng)可以降低成本，更便于商業(yè)推廣。在第三方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明得到的產(chǎn)品以及本發(fā)明中使用的中間產(chǎn)物。具體而言，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明第二方面的制備方法得到的L-賴(lài)氨酸飼料添加劑，優(yōu)選其中不含包衣劑(如，環(huán)糊精等)。另外，本發(fā)明提供了吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體，其包括吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體。優(yōu)選所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體在Α398或 D400的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換選自A398S和D400H，最優(yōu)選其氨基酸序列如SEQ ID Νο:2所示。另外，也優(yōu)選所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體在Μ102、L127或 Q322的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換選自M102L、L127R和Q322K，最優(yōu)選其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。本發(fā)明還分別提供了上述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體的多核苷酸，即順序編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體的多核苷酸，優(yōu)選其核苷酸序列如SEQ ID Νο:1所示。本發(fā)明還分別提供了編碼上述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體的多核苷酸，優(yōu)選它們的核苷酸序列分別如SEQ ID No :3和 5所示。
本發(fā)明具有以下有益效果賴(lài)氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量得到有效提高；發(fā)酵液質(zhì)量穩(wěn)定； 變體酶與野生型酶結(jié)構(gòu)差異不大，都可以順利降解，無(wú)安全隱患；發(fā)酵液可以直接用于生產(chǎn)顆粒飼料添加劑；生產(chǎn)顆粒飼料添加劑的步驟簡(jiǎn)便，無(wú)需引入包衣劑即可達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求。為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說(shuō)明書(shū)的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的。另外，本發(fā)明引用了公開(kāi)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過(guò)一樣。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說(shuō)明書(shū)等參考。實(shí)施例1吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體基因構(gòu)建體的制備根據(jù)我們?cè)O(shè)計(jì)的序列，通過(guò)商業(yè)途徑委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成編碼兩個(gè)吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶亞基變體的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體基因構(gòu)建體并構(gòu)建入大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒pMS2(可購(gòu)自美國(guó)典型微生物保藏中心(ATCC)，商品編號(hào)ATCC 67189)中。克隆過(guò)程參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》以及所用商品化試劑的操作指南進(jìn)行，簡(jiǎn)要過(guò)程如下通過(guò)DNA自動(dòng)合成儀，合成非天然順序的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體基因構(gòu)建體的核酸片段，用T4多核苷酸激酶(購(gòu)自TaKaRa公司)將這些核酸片段的5’端進(jìn)行磷酸化，然后等摩爾比混合這5個(gè)核酸片段后于65°C變性5分鐘，退火降溫至16°C，加入T4 DNA連接酶(購(gòu)自TaKaRa公司)連接12小時(shí)。然后，取1 μ L上述連接產(chǎn)物在50 μ L反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中正向引物如序列表的SEQ ID No :6所示(引入了 EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn))、 反向引物如序列表的SEQ IDNo 7所示(引入了 )(ba I內(nèi)切酶位點(diǎn))，反應(yīng)條件為以94°C 變性4分鐘，然后以94°C變性30秒、63°C退火60秒并72°C延伸30秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72°C延伸4分鐘并降溫至4°C。瓊脂糖凝膠電泳上述PCR產(chǎn)物，回收約2. 91Λ大小的片段，用EcoR I和)(ba I雙酶切該片段，并與經(jīng)這兩個(gè)內(nèi)切酶酶切的PMS2質(zhì)粒用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ToplOF’中。挑出陽(yáng)性克隆，抽提出其中的質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，相應(yīng)核苷酸序列如序列表的SEQ ID No :1所示，順序編碼了如SEQ ID No 2和SEQ ID No 4所示的兩個(gè)吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶亞基變體的完整0RF，由公司將構(gòu)建好的質(zhì)粒(命名為pMS2-tanspnt)以及相應(yīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化株(命名為E.coli-transpnt)寄回。實(shí)施例2大腸桿菌的活性測(cè)定及棒狀桿菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)根據(jù)現(xiàn)有的轉(zhuǎn)氫酶活性測(cè)定方法(可參見(jiàn)Clarke DM等.Cloning andexpression of the transhydrogenase gene of Escherichia coli. J. Bacteriol. ,162 :367-373),對(duì)轉(zhuǎn)化有pMS2-CiSpnt質(zhì)粒的Ε. coli-tanspnt菌株與作為對(duì)照的陰性ToplOF’菌株分別測(cè)定轉(zhuǎn)氫酶活性，發(fā)現(xiàn)的E. coli-tanspnt菌株的酶比活性比陰性ToplOF’菌株的酶比活性提高了 138%，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)中用野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶表達(dá)的酶比活性提高比率。通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將pMS2-tanSpnt質(zhì)粒轉(zhuǎn)入L-賴(lài)氨酸發(fā)酵的棒狀桿菌工程菌(可購(gòu)自美國(guó)典型微生物保藏中心(ATCC)，商品編號(hào)ATCC 31269)中，其簡(jiǎn)要過(guò)程是將棒狀桿菌在50mL LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D500達(dá)到0. 7，離心收集菌體，用0°C預(yù)冷的 10% (V/V)甘油溶液洗滌后將菌體重懸于200yL預(yù)冷的10% (V/V)甘油溶液中，加入 pMS2-tanspnt質(zhì)粒，混合均勻后轉(zhuǎn)移入0. Icm電擊杯中，于2kV持續(xù)5ms的條件進(jìn)行電擊， 然后立即加入ImL含0. 5% (M/M)葡萄糖的液體LB培養(yǎng)基，于42°C溫浴5分鐘，然后涂布在含100 μ g/mL氨芐青霉素和35 μ g/mL卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上于30°C培養(yǎng)36小時(shí)。 生長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化菌株提取總DNA后，用上述正向引物和反向引物PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)有約2. 9kb大小的片段，表明已經(jīng)將如序列表的SEQ ID No 1所示的基因構(gòu)建體導(dǎo)入了棒狀桿菌工程菌中。同時(shí)將PMS2質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入L-賴(lài)氨酸發(fā)酵的棒狀桿菌工程菌，形成陰性對(duì)照菌。將上述電轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性棒狀桿菌工程菌和陰性對(duì)照菌分別在液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D500達(dá)到0. 5，以5%的接種量接入賴(lài)氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基配方為 40g 蔗糖，20g NH4Cl, 2g CaCl2, Ig KH2PO4, Ig 蛋白胨，500mgMgS04 · 7H20，15mg FeSO4 · 7H20， IOmg MnSO4 · 7H20, 200 μ g 生物素，和 50 μ g 葉酸，用 Tris-HCl 調(diào)節(jié)至 ρΗ7· 3)中以 30°C振蕩(150rpm)培養(yǎng)72小時(shí)。離心收集培養(yǎng)基上清液(即，發(fā)酵液)，用紙層析法分離并定量培養(yǎng)基中的L-賴(lài)氨酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性棒狀桿菌工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中L-賴(lài)氨酸的含量達(dá)到了 14. 3g/L，而陰性對(duì)照菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中L-賴(lài)氨酸的含量?jī)H為12. Og/L，表明導(dǎo)入了如序列表的SEQ ID No :1所示的基因構(gòu)建體，產(chǎn)量提高了 19.2%，也高于現(xiàn)有技術(shù)中導(dǎo)入野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的工程菌的產(chǎn)量提高比率。實(shí)施例3L-賴(lài)氨酸飼料添加劑的制備用實(shí)施例2制備的發(fā)酵液通過(guò)Simtar-III型超濾膜(可購(gòu)自三達(dá)膜科技有限公司)進(jìn)行膜分離。然后，將濾液直接以霧狀噴入流化床干燥機(jī)內(nèi)并保持尾氣溫度在80士3°C 不變，收集出料的顆粒。對(duì)出料的顆粒進(jìn)行篩分，對(duì)于粒徑大于等于1. 5mm的顆粒送入破碎機(jī)破碎，然后將破碎后的顆粒與篩分得到的粒徑小于1. 5mm的顆粒混合并再次噴入流化床干燥機(jī)內(nèi)并保持尾氣溫度在80士3°C不變，收集出料的顆粒并篩分出粒徑小于1. 5mm的顆粒，即為L(zhǎng)-賴(lài)氨酸飼料添加劑。粒徑大于1. 5mm的顆粒再次破碎后，與下一批次的濾液干燥得到的出料的顆?；旌?。以上制備的L-賴(lài)氨酸飼料添加劑經(jīng)檢測(cè)，含水量< 1 % ；顆粒粒徑小于1. 5mm,無(wú)明顯可見(jiàn)粉塵；混合變異系數(shù)為7 9 ；堆積密度為550 630g/L ；不含其他添加劑，完全達(dá)到了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.L-賴(lài)氨酸的發(fā)酵方法，其包括(1)將編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌，從而使所獲得的菌表達(dá)所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，其中所述多核苷酸依次編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基；和(2)在發(fā)酵條件下培養(yǎng)步驟(1)獲得的菌。
2.權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其中所述多核苷酸依次編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體，優(yōu)選其中所述多核苷酸編碼的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體相對(duì)于野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的活性提高，最優(yōu)選其核苷酸序列如SEQ ID Νο:1所
3.權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其中所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶β亞基變體在Α398或 D400的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換選自A398S和D400H，最優(yōu)選其氨基酸序列如SEQ ID No 2所示；和，所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶α亞基變體在Μ102、L127或Q322的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換選自M102L、L127R和Q322K，最優(yōu)選其氨基酸序列如 SEQ ID No 4 所示。
4.權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其中所述多核苷酸是通過(guò)穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌的。
5.權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其中所述菌是棒狀桿菌。
6.權(quán)利要求5所述的發(fā)酵方法，其中所述發(fā)酵條件的發(fā)酵溫度為觀-351，優(yōu)選為 29-33 0C，更優(yōu)選為 30-32 0C，如 30 °C。
7.權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其中所述發(fā)酵條件的培養(yǎng)基包含糖，NH4Cl,CaCl2, KH2PO4,蛋白胨，MgSO4, FeSO4, MnSO4,生物素，和葉酸。
8.L-賴(lài)氨酸飼料添加劑的制備方法，其包括(1)實(shí)施權(quán)利要求1-7之任一所述的發(fā)酵方法的步驟O)；和(2)收集發(fā)酵液依次進(jìn)行膜分離并對(duì)濾液進(jìn)行噴霧干燥；(3)對(duì)步驟( 噴霧干燥獲得的顆粒進(jìn)行篩分；(4)將篩分得到的粒徑大于等于1.5mm的顆粒破碎，并將其與篩分得到的粒徑小于 1. 5mm的顆?；旌?，再次進(jìn)行噴霧干燥；和(5)對(duì)步驟(4)噴霧干燥獲得的顆粒進(jìn)行篩分，收集粒徑小于1.5mm的顆粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法得到的L-賴(lài)氨酸飼料添加劑。
10.吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體及其編碼基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了L-賴(lài)氨酸的發(fā)酵方法，其包括將以非天然順序編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌，從而使所獲得的菌表達(dá)所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶；和在發(fā)酵條件下培養(yǎng)獲得的菌。另外，本發(fā)明還提供了所述發(fā)酵方法中所用的中間產(chǎn)物，和利用所述發(fā)酵方法進(jìn)一步生產(chǎn)產(chǎn)品等。
文檔編號(hào)C12R1/15GK102191288SQ20111006569
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者劉鑫, 孟剛, 曹洪, 程耀東, 陳崇安, 馬吉銀 申請(qǐng)人:寧夏伊品生物科技股份有限公司