專(zhuān)利名稱(chēng)：非變性Ⅱ型膠原蛋白生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膠原蛋白技術(shù)，具體說(shuō)，涉及一種非變性Ii型膠原蛋白生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是細(xì)胞外間質(zhì)，最早人們關(guān)注的是細(xì)胞對(duì)生命活動(dòng)的影響，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外間質(zhì)對(duì)生命的意義亦非常重要，近十年來(lái)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外間質(zhì)，特別是膠原蛋白、蛋白多糖等對(duì)人類(lèi)健康和某些疾病的發(fā)生等起到關(guān)鍵的作用。醫(yī)療、保健品市場(chǎng)也越來(lái)越多的開(kāi)發(fā)關(guān)于膠原蛋白相關(guān)的產(chǎn)品。膠原是一個(gè)大家族，它僅存在于動(dòng)物體內(nèi)，植物中是沒(méi)有膠原蛋白的。這是一個(gè)重要的原則。在動(dòng)物體內(nèi)膠原分布于骨骼、軟骨、皮膚、筋膜等，膠原蛋白不同于其它蛋白質(zhì)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，而是三螺旋結(jié)構(gòu)，即由三條氨基酸長(zhǎng)鏈旋轉(zhuǎn)組成。因其氨基酸長(zhǎng)鏈的氨基酸序列不同，通過(guò)不同組合，又形成了不同類(lèi)型的膠原，有I、II、III、IV、V等型膠原，它們分別分布于不同的組織中。而II型膠原多分布于軟骨中，所以我們提取II型膠原應(yīng)該選動(dòng)物的透明軟骨為最好的材料。在膠原這個(gè)大家族中，如果我們分分類(lèi)，可以更清楚的看明白它們各自的位置，目前比較典型和容易理解的分類(lèi)方式是按分子量分類(lèi)。膠原蛋白的“母親”是成纖維細(xì)胞，是由成纖維細(xì)胞分泌產(chǎn)生膠原蛋白的。那么什么情況下成纖維細(xì)胞分泌產(chǎn)生膠原蛋白呢？這是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)，它的機(jī)理尚未完全清楚，也就是說(shuō)它的“父親”是誰(shuí)還不太確定。按分子量分，膠原有四個(gè)兄弟“老大”是大分子膠原，即近乎完整的膠原分子，或只去掉兩個(gè)肽端(N、c端)和三螺旋結(jié)構(gòu)完整的膠原分子。分子量在20 30萬(wàn)道爾頓(D)左右；它具有生物活性和細(xì)胞吸附活性，通常把它稱(chēng)為“膠原”?！袄隙笔抢盟?、堿、酶或升溫法，將膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)打開(kāi)，松解成三條彼此沒(méi)有聯(lián)系的肽鏈，這就是我們通常所說(shuō)的“明膠”，醫(yī)學(xué)界稱(chēng)為“變性膠原”；在動(dòng)物體內(nèi)這個(gè)過(guò)程往往是因?yàn)槟z原分子老化和膠原方面的疾病所致，它的分子量就是單股肽鏈的分子量，一般在10萬(wàn)D左右，生產(chǎn)中，單股肽鏈通常被截成幾段，那么“明膠”的分子量大約在1萬(wàn) 10萬(wàn)道爾頓D?！袄先笔菍⒚髂z化的膠原進(jìn)一步用酸、堿、酶、熱等在溶液里處理，將肽鏈進(jìn)一步切小，得到分子量在1千 1萬(wàn)道爾頓D之間的膠原，通常稱(chēng)之為“水解膠原蛋白”，因?yàn)榉肿恿孔冃?，所以“水解膠原蛋白”可溶于冷水，而明膠只能溶于熱水，膠原則不溶于水?！袄纤摹笔窃谒饽z原蛋白的基礎(chǔ)上再進(jìn)一步“水解”，即用酸、堿、酶、熱等打斷氨基酸鏈的生物鍵，得到分子量小于1千的氨基酸片段，通常稱(chēng)其為“肽”，有“寡肽”、“多肽”等，就是由二、三個(gè)氨基酸和十幾個(gè)氨基酸組成的一類(lèi)膠原蛋白。綜上，膠原的弟兄四個(gè)分別是膠原、明膠、水解膠原蛋白、膠原肽。目前市場(chǎng)應(yīng)用的膠原蛋白技術(shù)都是將膠原通過(guò)酸、堿、酶法水解得到膠原蛋白，其實(shí)是一種變性膠原蛋白(明膠)的進(jìn)一步分解的產(chǎn)品。其特點(diǎn)是分子量較小，分布普廣泛， 一般在幾百到幾千甚至一萬(wàn)道爾頓(D)，但不具備細(xì)胞活性。而具備膠原完整結(jié)構(gòu)的大分子膠原，其技術(shù)又多限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室規(guī)模可以滿足繁瑣的和較苛刻的工藝條件， 但不利于大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種非變性II型膠原蛋白生產(chǎn)方法，膠原蛋白的提取過(guò)程較簡(jiǎn)便，有利于在規(guī)模生產(chǎn)。 本發(fā)明技術(shù)方案如下一種非變性II型膠原蛋白生產(chǎn)方法，包括獲取軟骨材料，將得到的軟骨材料粉碎成粉沫；提取膠原，得到非變性II型膠原蛋白。進(jìn)一步還包括對(duì)得到的非變性II型膠原蛋白進(jìn)行純化的步驟。進(jìn)一步在所述純化過(guò)程中，利用膠原蛋白不溶于水的性質(zhì)，用去離子水洗滌膠原，攪拌均勻后，用12000轉(zhuǎn)/分離心，重復(fù)洗滌、攪拌和離心，得到的沉淀即為所述非變性 II型膠原蛋白。進(jìn)一步獲取軟骨材料的過(guò)程包括去除雜質(zhì)的步驟，在去除雜質(zhì)時(shí)，利用1 16w/ w的胃蛋白酶，分別于PH6. 5和PH2. 5的環(huán)境下，于26 28°C攪拌水解24小時(shí)，得到去除雜質(zhì)后的軟骨材料。進(jìn)一步在將所述將軟骨材料粉碎成細(xì)微粉沫時(shí)，采用深冷研磨機(jī)對(duì)所述軟骨材料進(jìn)行粉碎。進(jìn)一步提取膠原時(shí)，將軟骨粉沫置于反應(yīng)罐中，于16 18度環(huán)境下，加0. 5mol/ L的乙酸，加入1 % W/W濃度的胃蛋白酶，攪拌24小時(shí)，10000轉(zhuǎn)/分離心，得上清液；取上清液，逐漸滴加入9mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)PH到6. 5 7. 2 ；鹽析，加入NaCl至4. Omol/ L，攪拌溶解后用12000轉(zhuǎn)/分離心，沉淀后得到所述非變性II型膠原蛋白。進(jìn)一步所述粉沫的細(xì)度為150 200目。1、目前使用軟骨材料作原料多數(shù)是人工加工，既耗時(shí)費(fèi)力又不標(biāo)準(zhǔn)；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是節(jié)約人力成本、原料處理的一致性好。2、本發(fā)明對(duì)原料進(jìn)行低溫超微粉碎，一次性粉碎軟骨材料，使粉碎后的軟骨材料低于變性溫度。3、本發(fā)明使非變性膠原的提取由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模擴(kuò)展到生產(chǎn)規(guī)模，基本滿足了生產(chǎn)要求。4、本發(fā)明技術(shù)方案簡(jiǎn)便易行、標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)、人為因素少、節(jié)省成本、產(chǎn)量高。
5、本發(fā)明中，膠原蛋白的提取過(guò)程較簡(jiǎn)便，更有利于在規(guī)模生產(chǎn)。6、本發(fā)明中，純化過(guò)程更有獨(dú)創(chuàng)性，且簡(jiǎn)便易行，得率高。


圖1是本發(fā)明的生產(chǎn)流程圖。
具體實(shí)施例方式如圖1所示，是本發(fā)明的生產(chǎn)流程圖，下面參考附圖和優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細(xì)描述。1、獲取符合需要的軟骨材料。
原料取自動(dòng)物的軟骨，如豬關(guān)節(jié)軟骨、雞關(guān)節(jié)軟骨、雞胸軟骨。取得原料后，原料通常不能直接使用，上邊往往有殘存的殘余肉、軟骨膜、鈣化塊等雜質(zhì)，人工去除費(fèi)時(shí)費(fèi)力增加很大成本。本發(fā)明以ProteaseN:胃蛋白酶=1 16 (w/w)的比例，分別于PH6. 5和PH2. 5 的環(huán)境下，于26°C 28°C攪拌水解24小時(shí)，結(jié)果得到雜質(zhì)基本去除，形態(tài)完整，符合提取要求的軟骨材料。2、將軟骨材料粉碎成細(xì)微粉沫。將軟骨材料放入深冷研磨機(jī)，可以一次性粉碎成細(xì)微粉沫，其細(xì)度可到150 200 目。因?yàn)檐浌遣牧咸崛》亲冃訧I型膠原蛋白，目前市售設(shè)備均存在研磨升熱問(wèn)題，而提取目標(biāo) 的變性溫度為39°c 41°C，所以普通設(shè)備無(wú)法解決這一問(wèn)題。3、提取膠原。將軟骨粉沫置于反應(yīng)罐中，于16°C 18°C環(huán)境下，加0.5mol/L的乙酸，加入 (W/W)濃度的胃蛋白酶，攪拌24小時(shí)后，10000轉(zhuǎn)/分離心，得上清液；取上清液，逐漸滴加入9mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)PH到6. 5 7. 2 ；鹽析，加入NaCl至4. Omo 1/L,攪拌溶解后， 用12000轉(zhuǎn)/分離心，沉淀，得到的沉淀物即為非變性II型膠原蛋白的粗制品。4、對(duì)得到的膠原進(jìn)行純化。利用膠原蛋白不溶于水的性質(zhì)，用去離子水洗滌膠原，攪拌均勻后，用12000轉(zhuǎn)/ 分離心，重復(fù)洗滌、攪拌和離心兩次，得到的沉淀即為純度超過(guò)95%的非變性II型膠原蛋白。
權(quán)利要求
1.一種非變性II型膠原蛋白生產(chǎn)方法，包括獲取軟骨材料，將得到的軟骨材料粉碎成粉沫；提取膠原，得到非變性II型膠原蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的非變性II型膠原蛋白生產(chǎn)方法，其特征在于還包括對(duì)得到的非變性II型膠原蛋白進(jìn)行純化的步驟。
3.如權(quán)利要求2所述的非變性II型膠原蛋白生產(chǎn)方法，其特征在于在所述純化過(guò)程中，利用膠原蛋白不溶于水的性質(zhì)，用去離子水洗滌膠原，攪拌均勻后，用12000轉(zhuǎn)/分離心，重復(fù)洗滌、攪拌和離心，得到的沉淀即為所述非變性II型膠原蛋白。
4.如權(quán)利要求1或者2所述的非變性II型膠原蛋白生產(chǎn)方法，其特征在于獲取軟骨材料的過(guò)程包括去除雜質(zhì)的步驟，在去除雜質(zhì)時(shí)，利用1 16w/w的胃蛋白酶，分別于PH6.5 和PH2. 5的環(huán)境下，于沈 攪拌水解M小時(shí)，得到去除雜質(zhì)后的軟骨材料。
5.如權(quán)利要求1或者2所述的非變性II型膠原蛋白生產(chǎn)方法，其特征在于在將所述將軟骨材料粉碎成細(xì)微粉沫時(shí)，采用深冷研磨機(jī)對(duì)所述軟骨材料進(jìn)行粉碎。
6.如權(quán)利要求1或者2所述的非變性II型膠原蛋白生產(chǎn)方法，其特征在于提取膠原時(shí)，將軟骨粉沫置于反應(yīng)罐中，于16 18度環(huán)境下，加0. 5mol/L的乙酸，加入1 % W/W濃度的胃蛋白酶，攪拌M小時(shí)，10000轉(zhuǎn)/分離心，得上清液；取上清液，逐漸滴加入9mol/L的 NaOH溶液，調(diào)節(jié)PH到6. 5 7. 2 ；鹽析，加入NaCl至4. Omol/L,攪拌溶解后用12000轉(zhuǎn)/分離心，沉淀后得到所述非變性II型膠原蛋白。
7.如權(quán)利要求1所述的非變性II型膠原蛋白生產(chǎn)方法，其特征在于所述粉沫的細(xì)度為150 200目。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種非變性Ⅱ型膠原蛋白生產(chǎn)方法，步驟包括獲取軟骨材料，將得到的軟骨材料粉碎成粉末；提取膠原，得到非變性Ⅱ型膠原蛋白。本發(fā)明使非變性膠原的提取由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模擴(kuò)展到生產(chǎn)規(guī)模，基本滿足了生產(chǎn)要求；本發(fā)明技術(shù)方案簡(jiǎn)便易行、標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)、人為因素少、節(jié)省成本、產(chǎn)量高；本發(fā)明中，膠原蛋白的提取過(guò)程較簡(jiǎn)便，更有利于在規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102154425SQ20111006573
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者朱大開(kāi), 李潔, 龔輝 申請(qǐng)人:北京華達(dá)杰瑞生物技術(shù)有限公司