專利名稱：枯草芽孢桿菌表面展示人血清白蛋白重組芽孢及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表面展示外源蛋白的重組芽孢的制備方法及產(chǎn)品，具體指的是在枯草芽孢桿菌芽孢表面展示人血清白蛋白HSA的重組芽孢，屬于重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是由585個(gè)氨基酸組成的單鏈無糖基化的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量約為 66. 5 kD (Mingetti, et al. 1986. J. Biol. Chem. 261,6757)， 等電點(diǎn)在4.7 4.9之間。HSA是人血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白的60%左右。在體液中人血清白蛋白可以運(yùn)輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和許多治療分子等，同時(shí)能夠維持血液的滲透壓保持在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃?。由于HSA作為血液最重要的運(yùn)載工具和血漿蛋白成份，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能，因而在臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐中具有十分廣泛的用途，被大量用來治療各種休克、燒傷、戰(zhàn)傷、外科手術(shù)和工傷事故等各種病因引起的血容量減少病人，以及慢性腎炎、肝炎、肝硬化和晚期惡性腫瘤病人，營養(yǎng)不良水腫癥、低白蛋白血癥和無白蛋白血癥病人等。HSA對(duì)細(xì)胞具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。HSA由較多的必需氨基酸組成，是均衡、齊全的氨基酸來源。滋養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)約1/3來自肝臟合成的 HSA。肝臟每日合成的HSA幾乎全部被各種組織細(xì)胞消耗，HSA離開血液系統(tǒng)，抵達(dá)細(xì)胞膜， 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，水解后再合成各種蛋白質(zhì)。由于HSA適應(yīng)癥多、用量大(每個(gè)病人每天用HSA的量將近10g)，因此HSA擁有巨大的市場需求量。目前HSA的全球市場年需求量約600t，其中中國對(duì)HSA的年需求量約為70t。臨床上HSA主要是靠收集人的血液通過分級(jí)過濾獲得， 但是人血漿來源有限，價(jià)格昂貴，并且來源復(fù)雜，容易導(dǎo)致血源性污染，如肝炎病毒，艾滋病毒等。目前已有通過基因工程的方法用酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組人血清白蛋白上市，但要實(shí)現(xiàn)藥物級(jí)重組人血清白蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，發(fā)酵法仍然有許多的缺點(diǎn)和不足，因?yàn)橹亟M人血清白蛋白產(chǎn)品對(duì)純度要求極高，純度要求達(dá)到99. 999999%以上，任何微量的雜蛋白都可能造成嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。這使得發(fā)酵法生產(chǎn)重組人血清白蛋白的分離純化方法和步驟復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高?？莶菅挎邨U菌為環(huán)境友好型細(xì)菌，在營養(yǎng)缺乏時(shí)，能形成處于代謝休眠狀態(tài)的芽孢，在適宜條件下芽孢又能萌發(fā)成具有繁殖能力的營養(yǎng)細(xì)胞。芽孢容易培養(yǎng)，比重大易分離、不需要復(fù)雜的分離純化操作。芽孢是生命世界中抗逆性最強(qiáng)的一種結(jié)構(gòu)，其穩(wěn)定性好， 能耐氧化，耐高溫，能長期耐60°C高溫，在120°C的溫度下能存活20分鐘，并且在抗化學(xué)藥物和抗輻射等方面也十分突出，可在惡劣環(huán)境中存活幾年至幾十年。芽孢在酸性胃環(huán)境中能保持活性，可以耐唾液和膽汁的攻擊，可以順利通過動(dòng)物消化道，可作為極端環(huán)境(如胃腸道)下異源蛋白或生物活性分子的載體(Oggioni MR, et al. 2003. Vaccine. 21: 96-101)?？莶菅挎邨U菌以孢子狀態(tài)進(jìn)入消化道后，迅速由休眠狀態(tài)復(fù)活，在短期內(nèi)繁殖成高含菌量的優(yōu)勢種群，消耗掉腸道內(nèi)大量氧氣，并能產(chǎn)生過氧化氫、細(xì)菌素，建立微生態(tài)平衡，促進(jìn)有益厭氧微生物的繁殖，抑制有害細(xì)菌(大腸桿菌、沙門氏桿菌)的生長，因而能預(yù)防腹瀉、下痢等腸胃道疾病。目前市場上已經(jīng)有口服枯草芽孢桿菌活菌膠囊產(chǎn)品，如北京紫竹藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字S20030018，表明枯草芽孢桿菌芽孢可以通過人口服使用而產(chǎn)生藥效性。本發(fā) 明的目的在于利用芽孢獨(dú)特的抗逆性，以益生菌枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白為載體，通過芽孢表面展示技術(shù)將人血清白蛋白展示在芽孢表面，使人血清白蛋白獲得快速大量表達(dá)的同時(shí)具有良好的抗逆性，適用于快速大量制備具有藥效性的重組人血清白蛋白的口服營養(yǎng)品。該產(chǎn)品在保持了枯草芽孢桿菌芽孢生理特性的基礎(chǔ)上同時(shí)具有人血清白蛋白的藥效性和營養(yǎng)功能，迄今尚未見類似的報(bào)道和發(fā)明專利。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種表面展示人血清白蛋白HSA的重組芽孢的制備方法和產(chǎn)品。本發(fā)明以枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotC為載體，通過芽孢表面展示技術(shù)將人血清白蛋白展示在枯草芽孢桿菌的芽孢表面，可用于動(dòng)物直接口服，成為一種新型的人血清白蛋白藥物營養(yǎng)品或者動(dòng)物營養(yǎng)品，其在安全性、耐受性、藥效學(xué)以及藥代動(dòng)力學(xué)等方面與人源HSA具有類似的功效。相對(duì)于其它注射型人血清白蛋白產(chǎn)品，本發(fā)明表面展示人血清白蛋白的制備方法和分離過程簡單快速，具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。這種產(chǎn)品的發(fā)明克服了當(dāng)前人血清白蛋白來源于血液制品的限制，同時(shí)也克服了重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)的人血清白蛋白分離純化過程復(fù)雜的缺點(diǎn)，在藥學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為
一種表面展示人血清白蛋白HSA的重組芽孢的制備方法及其產(chǎn)品，利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因?yàn)榉肿虞d體，與人血清白蛋白基因重組，構(gòu)建融合表達(dá)的整合型重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌獲得枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生芽孢，在芽孢表面展示有人血清白蛋白。本發(fā)明的一個(gè)具體操作是通過RT/PCR的方法從人體肝臟組織的cDNA文庫中擴(kuò)增獲得人血清白蛋白HSA的cDNA，將獲得的基因插入到克隆載體pMDIS-T中保存。然后將人血清白蛋白基因Asa插入到融合表達(dá)的質(zhì)粒PJS700的^和酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建好整合型重組質(zhì)粒PJS700-HSA，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，采用耗竭法誘導(dǎo)宿主菌產(chǎn)生芽孢，在芽孢表面展示有融合蛋白CotC-HSA。本發(fā)明選擇具有良好的轉(zhuǎn)化能力并且可以產(chǎn)生芽孢的枯草芽孢桿菌菌株為重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株，例如feciB^s subtilis 168及其衍生的一系列菌株(Bacillus Genetic Stock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University, West 12th Avenue, Columbus, Ohio, 43210，USA)；選擇芽孢衣殼蛋白基因coiC(Gene Bank序列號(hào) NP_389653)作為表面展示蛋白的分子載體，選擇人血清白蛋白基因Asa為重組基因。枯草芽孢桿菌為環(huán)境友好型細(xì)菌，其在營養(yǎng)缺乏時(shí)會(huì)分化形成休眠體芽孢，芽孢具有極強(qiáng)的抗逆性，可以耐酸和堿，存活能力較強(qiáng)，并且其比重大，容易進(jìn)行分離純化?？莶菅挎邨U菌的培養(yǎng)方法簡單方便，生長迅速，營養(yǎng)要求簡單，容易進(jìn)行工業(yè)放大培養(yǎng)。在枯草芽孢桿菌的芽孢表面展示人血清白蛋白，使人血清白蛋白獲得快速大量表達(dá)的同時(shí)具有良好的抗逆性和穩(wěn)定性，并且分離純化簡便快捷。本發(fā)明涉及發(fā)明所選擇的芽孢衣殼蛋白基因⑶M與Asa基因編碼序列重組后構(gòu)建的重組質(zhì)粒，在此重組質(zhì)粒中含有芽孢衣殼蛋白基因的啟動(dòng)子、不含終止密碼子的編碼序列與Asa基因的編碼序列重組后的基因，可在枯草芽孢桿菌分化形成芽孢時(shí)融合表達(dá) CotC-HSA0通過構(gòu)建整合型重組質(zhì)粒，使得融合基因⑶i^-Asa整合于枯草芽孢桿菌染色體上的特定位點(diǎn)并穩(wěn)定的進(jìn)行遺傳，避免了質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌細(xì)胞中容易丟失的缺點(diǎn)。帶有融合表達(dá)CotC-HSA的表達(dá)載體可以通過熱擊法或電穿孔法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。 成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，通過進(jìn)一步篩選帶有本發(fā)明構(gòu)建的融合基因的細(xì)胞，可以通過本領(lǐng)域熟知的方法加以鑒定，如收集細(xì)胞，裂解后提取DNA，然后進(jìn)行PCR鑒定等，也可以在誘導(dǎo)表達(dá)后用HSA抗體進(jìn)行western blot檢測。本發(fā)明還涉及本發(fā)明構(gòu)建的融合表達(dá)CotC-HSA的重組整合型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌篩選所得到的重組菌株，這些重組菌株誘導(dǎo)形成的芽孢表面展示有重組人血清白蛋白，并可以通過Western blot檢測其芽孢表面展示的重組蛋白HSA。本發(fā)明涉及基因Asa編碼序列片段克隆的引物序列 hsa-F :ATGGTACCATGAAGTGGGTAACCTTT (SEQ ID NO. 1) hsa-R :GCGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCT (SEQ ID NO. 2)
本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌淀粉酶基因a 對(duì)(Gene Bank序列號(hào)NP_388186)片段擴(kuò)增的引物序列
amyE-F :ATTGCTCGGGCTGTATGACTGG (SEQ ID NO. 3) amyE-R :GTTACACCATCACTGTTCGTTCCTT (SEQ ID NO. 4)
本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為本發(fā)明將人血清白蛋白HSA展示在枯草芽孢桿菌表面，利用芽孢所具有的獨(dú)特抗逆性，使得人血清白蛋白順利通過動(dòng)物體消化屏障。本發(fā)明構(gòu)建的表面展示人血清白蛋白HSA的枯草芽孢桿菌重組芽孢，可用于動(dòng)物直接口服，成為一種新型的人血清白蛋白營養(yǎng)品或者動(dòng)物營養(yǎng)品，相對(duì)于其它注射型人血清白蛋白樣品，制備方法和分離過程簡單快速，并且具有更好的穩(wěn)定性和更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。這種產(chǎn)品的發(fā)明克服了當(dāng)前人血清白蛋白來源于血制品的限制，同時(shí)也克服了重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)的人血白蛋白分離純化過程復(fù)雜的缺點(diǎn)。


圖1發(fā)明人克隆的人血清白蛋白Asa基因編碼序列在Gene Bank中搜索比對(duì)結(jié)^ ο圖2融合表達(dá)CotC-HSA整合型重組質(zhì)粒pJS700_HSA的構(gòu)建方法及其結(jié)構(gòu)圖譜。 amyE 5’ -end和a 對(duì)3’ -end分別表示淀粉酶基因編碼序列的5’端和3’端，通過同源重組整合在feciBm subtilis 168 (ir/7_)染色體的淀粉酶基因中。J //， 分別表示氨芐青霉素抗性基因和紅霉素抗性基因，在大腸桿菌和feciBm subtilis 168 {trpl中作為篩選標(biāo)記。cotC-hsa %^tBacillus subtilis 168 {trpl 的芽孢中融合表達(dá) CotC-HSA 重組蛋白的基因片段，該片段含有⑶M基因的啟動(dòng)子序列、不含有⑶M終止密碼子的CotC 編碼序列，以及HSA的全部編碼序列。oriC為大腸桿菌復(fù)制子片段。圖 3 重組菌株feci/^As subtilis 168 (ir/O/pJS700-HSA 的淀粉酶活性分析。A 野生型菌株feci/^As subtilis 168 (ir/O 和重組菌株feci"^ subtilis 168 (ir/7-)/pJS700-HSA于淀粉平板上培養(yǎng)；B 在淀粉平板上野生型菌株和重組菌株的碘液染色。 U~Emr-cotC-hsal~^}^^^Bacillussubtilis 168染色體中的整合示意圖。圖 5 PCR 檢測重組菌株中的 ^/-COiC-Asa 片段。M :250bp DNA Ladder Marker ； ζ六·XBaci Ilus subtil is 168 {trpl (Wild-type, WT) ^WBacillus subtil is 168 {trpl /pJS700-HSA (Transgenic, TG)的染色體為模板，以 amyE-F/amyE-R、hsa_F/hsa-R、 hsa-F/ amyE-R和amyE-F/hsa-R為四組引物對(duì)(弓|物對(duì)的在染色體中的位置見附圖4)進(jìn)行 PCR鑒定重組基因。圖6轉(zhuǎn)基因重組菌株表面展示HSA重組芽孢的western blot鑒定。M為 prestained protein MW marker，1 為野生型菌株 feci/A/s subtil is 168 (ir/O 培養(yǎng) 48h 后的提取物作為對(duì)照，2和3分別為重組菌株feciBm subtilis 168 (ir/7_)/pJS700_HSA 培養(yǎng)8h和48h后的提取物。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料
各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA ligase, Γ叫、Γ叫酶，pMD18_T載體均購至寶生物工程 (大連)有限公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，測序由百奧邁科(Biomics) 生物技術(shù)有限公司完成，用于本發(fā)明的所有DNA片段的回收均采用Omega Bio-Tek Gel Extraction Kit分離純化，大腸桿菌菌株DH5 α來源于中科院微生物研究所，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，非特別說明的情況下，一般為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的含義。以下實(shí)施例中未作具體說明的實(shí)驗(yàn)操作方法均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 (Sambrook等編著，科學(xué)出版社，1992年版)、試劑盒說明書、及產(chǎn)品說明書進(jìn)行。以下的實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，并非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的一些過程和方法都為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉和了解的常規(guī)方法。所用試劑的來源、 商品名，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標(biāo)明的相同。本發(fā)明實(shí)施例中涉及的由發(fā)明人保存的生物材料，均可向公眾提供20年。實(shí)施例1 人血清白蛋白Asa基因的克隆、測序及鑒定
人體肝臟組織樣品由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉繼兵博士提供。取人體肝臟組織，放入用液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨，用RNA提取試劑盒分離信使RNA (mRNA)，通過RT/PCR技術(shù)獲得人血清白蛋白基因的cDNA序列。人血清白蛋白Asa基因片段的PCR擴(kuò)增引物為 hsa-F :ATGGTACCATGAAGTGGGTAACCTTT
hsa-R :GCGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCT
PCR反應(yīng)體系按TaKaRa LA Taq使用說明書嚴(yán)格進(jìn)行，20 μ L反應(yīng)體系中含TaKaRa LA Taq 0. 2 μ L，10 X LA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) 2 μ L, dNTP Mixture (各 2· 5 mM) 3. 2 μ L, 模板DNA lOOng，上下游引物(20 μ Μ)各0. 4 μ L，最后加滅菌超純水補(bǔ)齊到20 μ L。PCR條件為94°C變性 5min，94°C lmin，56°C 40 s，72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物大小為 1845bp， 包括人血清白蛋白Asa基因的編碼序列。為了便于克隆，上游引物hsa-F中添加了幻Ml限制性酶切位點(diǎn)，下游引物hsa-R中添加了 EcoRY位點(diǎn)。擴(kuò)增片段按TaKaRa pMD18_T Simple Vector (TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司)說明書的方法，克隆于pMDIS-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，篩選克隆菌株，提取質(zhì)粒，通過PCR及命/ 1和EcoKI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，克隆片段的測序由百奧邁科(Biomics)生物技術(shù)有限公司完成?？寺〉闹亟M質(zhì)粒命名為PMD18-T-HSA，重組子菌株命名為DH5ci/ PMD18-T-HSA。陽性重組菌株保存在含有15%甘油的LB培養(yǎng)基中，凍存于_80°C。 測序結(jié)果在 GenBank 中(http //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)進(jìn)行搜索比對(duì)，結(jié)果見圖1。實(shí)施例2 以CotC為載體表面展示HSA的枯草芽孢桿菌重組芽孢的制備
1.重組整合型質(zhì)粒PJS700-HSA的構(gòu)建
質(zhì)粒PJS700 (李倩.以CotX為分子載體表面展示W(wǎng)SSV囊膜蛋白Vpl9和Vp28的枯草芽孢桿菌重組芽孢的研究[D].江蘇鎮(zhèn)江江蘇大學(xué)，2010:36-38)由江蘇大學(xué)環(huán)境學(xué)院寧德剛副教授惠贈(zèng)(江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與分子生物學(xué)403實(shí)驗(yàn)室保存)， 該質(zhì)粒大小約為5. 5kb。在pJS700質(zhì)粒中，amyE 5’ -end和a 對(duì)3’ -end分別表示淀粉酶基因a 對(duì)(Gene Bank序列號(hào)NP_388186)編碼序列的5’端和3’端，通過同源重組整合 ^Bacillus subtilis 168 (ir/7_)染色體的淀粉酶基因中。^？//，^分別表示氨芐青霉素抗性基因和紅霉素抗性基因，在大腸桿菌和feciBm subtilis 168 {trpl中作為篩選標(biāo)記。coM為枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotC基因，該基因片段含有coM基因(Gene Bank 序列號(hào)NP_389653)的啟動(dòng)子序列、不含有coM終止密碼子的CotC編碼序列。oriC為大腸桿菌復(fù)制子片段。分別用幻7/ 1和酶切質(zhì)粒pMD18-T-HSA和pJS700，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收Asa片段和？幾700，用T4 DNA Iigase連接兩雙酶切后純化好的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板中37°C培養(yǎng)過夜，次日挑選陽性單克隆菌株于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12至16h，提取質(zhì)粒，通過PCR及^和雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，鑒定正確后將重組整合型質(zhì)粒命名為PJS700-HSA，陽性重組菌株命名為DH5 α / PJS700-HSA。該重組整合型質(zhì)粒PJS700-HSA中含有重組基因coM-Asa，該質(zhì)粒的構(gòu)建過程及其圖譜見圖2。2.融合表達(dá)重組芽孢的枯草芽孢桿菌菌株的篩選與鑒定
將整合型重組質(zhì)粒 PJS700-HSA 轉(zhuǎn)化 feci/A/s subtilis 168 {trpl (Bacillus Genetic Stock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University, West 12th Avenue, Columbus, Ohio, 43210，USA)，用含有 0. 4 μ g/mL紅霉素(購自 SIGMA 公司)的LB平板篩選重組子，從平板上挑選單菌落接種于含1%淀粉的LB平板中，37°C過夜培養(yǎng)，次日用碘-碘化鉀溶液對(duì)淀粉平板染色來鑒定重組菌株。1%淀粉平板的制備方法100mL LB固體培養(yǎng)基中加可溶性淀粉O.lg，高壓蒸汽滅菌后倒制平板。碘-碘化鉀溶液的配制碘化鉀2g，碘lg，蒸餾水300mL，先將碘化鉀溶于少量去離子水中，待全部溶解后再加入碘，振蕩溶解后稀釋至300mL，避光保存在棕色玻璃瓶中，用時(shí)可稀釋2 10倍。取適量碘-碘化鉀溶液滴于淀粉平板上，菌落周圍產(chǎn)生透明圈表明重組基因沒有插入淀粉酶基因a 對(duì)中，菌落及其周圍顏色變藍(lán)表明重組基因成功的插入到了徹subtilis 168 {trp)染色體上的淀粉酶基因a 對(duì)中，因而導(dǎo)致淀粉酶基因a 對(duì)沒有活性，見圖3。
為了進(jìn)一步證明重組菌株中淀粉酶基因的失活是由于^/-coiC-Asa的插入所致，分另U 以 amyE-F/amyE-R、hsa-F/hsa-R、hsa-F/amyE-R、amyE-F/hsa-R 為弓丨物對(duì)，以枯草芽孢桿菌的染色體為模板，PCR擴(kuò)增鑒定重組菌株中是否含有Ai-coiC-Asa基因片段。 Emr-cotC-hsa 六 ^HBaci Ilus subtil is 168 {trpl 染色體中的整合示意圖見圖 4。PCR 反應(yīng)體系按TM^fe LA h《使用說明書嚴(yán)格進(jìn)行，20 μ L反應(yīng)體系中含TM^fe LA Taq 0. 2 μ L，10 X LA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) 2 μ L, dNTP Mixture (各 2.5 mM) 3. 2 μ L,模板 DNA lOOng，上下游引物(20 μ Μ)各0.4 μ L，最后加滅菌超純水補(bǔ)齊到20 μ L。PCR反應(yīng)條件根據(jù)各個(gè)引物對(duì)的特征分別設(shè)置。在重組菌株中分別檢測到約5.0 kb、1.8 kb、4.3 kb 和2.3 kb的擴(kuò)增片段，而野生型菌株中只檢測到約1.1 kp的淀粉酶基因，鑒定結(jié)果見圖5。 這表明重組菌株染色體上含有^Z-coiC-Asa重組基因，并且^/-coiC-Asa重組片段成功的插入到了淀粉酶基因中。將鑒定后的重組菌株命名為feciBm subtilis 168 {trpl/ PJS700-HSA?？莶菅挎邨U菌染色體的提取 方法為挑單菌落接于LB加相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中， 在37°C搖床中培養(yǎng)至OD6tltl為1.0 2. O。取1.5mL菌液于Eppendorf管中，8000rpm離心 lOmin，棄上清，加 ΙΟΟμ L pH8. O 的 TE 緩沖液(IOmM Tris-HCl, 1 mM EDTA)洗沉淀，離心去上清，再加100 μ L TE懸浮沉淀；向懸浮液中加30 μ L 100mg/ml溶菌酶溶液，不要搖晃， 在37°C培養(yǎng)箱中放lh，加50 μ L 10%SDS和20 μ L 20mg/mL蛋白酶K，37°C繼續(xù)培養(yǎng)Ih ；補(bǔ) TE至300 μ L，分別加150 μ L苯酚和氯仿抽提，12000rpm離心IOmin,取上清；再加300 μ 1 氯仿，12000rpm離心5min，取上清，加1/4體積5M的NaCl，2倍體積的無水乙醇，室溫下沉淀DNA 2h，12000rpm離心lOmin，收集沉淀，用500 μ L 70%的乙醇洗沉淀，待揮發(fā)干后，力口 10 μ L TE緩沖液溶解沉淀，取1 μ L用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度，剩余的可放于-20°C 中保存?zhèn)溆谩?.表面展示人血清白蛋白重組芽孢的誘導(dǎo)及鑒定
用DSM培養(yǎng)基誘導(dǎo)重組菌株Bacillus subtilis 168 {trpl /pJS700_HSA形成芽孢。DSM 培養(yǎng)基的配方為0. 8% nutrient broth (營養(yǎng)肉湯 Difo)，0. 1% KC1，0.025% MgSO4 · 7H20,1. OmM Ca (NO3) 2 · 4H20,10μΜ MnCl2,1. ΟμΜ FeS04。將野生型菌株 Bacillus subtilis 168 (trpl和重組菌株分別接種于DSM培養(yǎng)基中，重組菌株分別取8h和 48h培養(yǎng)物進(jìn)行處理，野生型菌株取48 h的培養(yǎng)物進(jìn)行處理。芽孢蛋白的處理方法 12000rpmX IOmin離心收集菌體，重懸于相同體積的GTE Buffer (50mM葡萄糖，20mM pH7. 5 Tris-HCl, IOmM EDTA，2mg/mL溶菌酶)中，37 °C處理30分鐘用以破壞營養(yǎng)細(xì)胞， 12000rpmX IOmin沉淀芽孢，用pH7. 4的PBS洗3次后重懸于相同體積的SDS-DTT緩沖液 (0. ImM pH 7. 4 PBS,50mM DTT, 1. 5%SDS)中，65°C水浴處理 lOmin，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以兔抗HSA血清為一抗，Western blot檢測重組菌株和野生型菌株的芽孢蛋白。結(jié)果顯示野生型菌株48h和重組菌株8h的培養(yǎng)物中都沒有檢測到HSA，而重組菌株培養(yǎng)48h后，由于營養(yǎng)耗盡，細(xì)胞分化形成芽孢，在芽孢形成的過程中，HSA隨著芽孢衣殼蛋白CotC —同得到表達(dá)，因而能檢測到HSA，見圖6。這表明重組芽孢中人血清白蛋白HSA 通過衣殼蛋白載體CotC將其展示在了重組芽孢的表面。
權(quán)利要求
1.一種表面展示人血清白蛋白重組芽孢的制備方法，其特征在于利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因?yàn)榉肿虞d體，與人血清白蛋白基因重組，構(gòu)建融合表達(dá)的整合型重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生的芽孢表面展示人血清白蛋白的重組芽孢。
2.按照權(quán)利要求1所述的表面展示人血清白蛋白重組芽孢的制備方法，其特征在于 所述的枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因?yàn)棰荿。
3.按照權(quán)利要求2所述的表面展示人血清白蛋白的重組芽孢的制備方法，其特征在于所述的融合表達(dá)的整合型重組質(zhì)粒是將枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因⑶M與人血清白蛋白基因重組構(gòu)建的質(zhì)粒。
4.按照權(quán)利要求3所述的表面展示人血清白蛋白的重組芽孢的制備方法，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌重組菌株是整合型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌所得到的菌株，該菌株染色體上含有適用于枯草芽孢桿菌的選擇標(biāo)記基因、以及芽孢衣殼蛋白基因與人血清白蛋白基因的編碼序列重組后的基因，這些基因插入淀粉酶基因中導(dǎo)致重組菌株的淀粉酶基因失活。
5.按照權(quán)利要求4所述的表面展示人血清白蛋白的重組芽孢，其特征在于，重組芽孢是枯草芽孢桿菌重組菌株誘導(dǎo)形成的枯草芽孢桿菌的芽孢，芽孢表面展示有人血清白蛋白 HSA。
6.一種表面展示人血清白蛋白重組芽孢，其特征在于是通過以下方法制備利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因?yàn)榉肿虞d體，與人血清白蛋白的基因重組，構(gòu)建融合表達(dá)的整合型重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生的芽孢表面展示人血清白蛋白的重組芽孢。
全文摘要
本發(fā)明屬于重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因cotC為分子載體，與人血清白蛋白基因hsa重組，構(gòu)建融合表達(dá)的整合型重組質(zhì)粒，將融合表達(dá)人血清白蛋白HSA的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌后，通過同源重組使外源基因整合于染色體上特定位點(diǎn)的淀粉酶基因amyE中，并使淀粉酶基因插入失活而導(dǎo)致重組菌株無淀粉酶活性，成功的篩選出含有融合表達(dá)CotC-HSA的重組枯草芽孢桿菌菌株，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生的芽孢表面展示有人血清白蛋白。本發(fā)明的重組芽孢可用于動(dòng)物直接口服，在保持了芽孢生理特性的基礎(chǔ)上同時(shí)具有人血清白蛋白的部分藥效性和營養(yǎng)功能。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102181469SQ20111006737
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者姚勤, 寧德剛, 李國輝, 毛浪勇, 陳克平 申請人:江蘇大學(xué)