專利名稱：腺病毒實時熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應(yīng)) 試劑盒，尤其涉及一種腺病毒實時熒光定量PCR試劑盒。
背景技術(shù)：
腺病毒(Adenovirus，ADV)是導(dǎo)致免疫抑制個體發(fā)病率和死亡率的主要誘因。腺 病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，腺病毒對呼吸道、胃腸道、尿道和膀胱、眼、肝臟等均可 感染，人腺病毒約1/3的已知血清型通常與人類疾病相關(guān)，但一種血清型可引起不同的臨 床疾患；相反，不同血清型也可引起同一種疾患。此前病毒分離與鑒定的方法主要為病毒 的分離培養(yǎng)，標(biāo)本應(yīng)盡早從感染部位采集。采集患者咽喉、眼分泌物，糞便和尿液等，加抗生 素處理過夜，離心取上清接種敏感細(xì)胞093、!fep-2或HeLa細(xì)胞等)，37°C孵育后可觀察到 典型CPE，即細(xì)胞變圓、團聚、有拉絲現(xiàn)象，最突出的表現(xiàn)是許多病變細(xì)胞聚在一起呈葡萄串 狀。病毒抗原抗體鑒定，用熒光標(biāo)記的抗六鄰體抗體與分離培養(yǎng)細(xì)胞作用來鑒定腺病毒， 也可用血凝抑制(hemoagglutination inhibition,HI)試驗或中和試驗(neutralization test, NT)檢測屬和組特異性抗原并鑒定病毒的血清型。上述所述檢測病毒的方法在一定程度上是有效的，但是它們也有不足的地方，如 病毒的分離培養(yǎng)，是需要耗費大量人力、物力和時間的，抗體檢測對一些臨床樣本缺乏足夠 的靈敏度，有時不能判定出一些正常個體中的潛伏感染。一種更有效快速準(zhǔn)確的檢測技術(shù)， 實時熒光定量PCR技術(shù)對ADV進(jìn)行檢測，取病變組織或細(xì)胞，提取病毒DNA，與標(biāo)記的病毒 DNA探針和引物進(jìn)行雜交來判斷是否被感染。這種方法的優(yōu)點體現(xiàn)在高靈敏度、高準(zhǔn)確性和 高速率，在應(yīng)對病毒大爆發(fā)流行時能為醫(yī)院等單位在面臨大堆的臨床樣本時提供更加快速 精確的檢測，及時對疫情的加以控制和對流行病學(xué)調(diào)查作出巨大的貢獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種腺病毒實時熒光 定量PCR試劑盒。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的1、腺病毒實時熒光定量PCR試劑盒(簡稱試劑盒)本試劑盒是在對腺病毒核酸序列分析的基礎(chǔ)上，選取保守基因序列設(shè)計出一對特 異性引物和一條特異性的熒光探針，利用實時熒光定量PCR技術(shù)對腺病毒進(jìn)行檢測。此技 術(shù)不僅縮短了操作時間，減少了污染，也降低了樣品診斷的成本，具有潛在的應(yīng)用價值。在按下述方法設(shè)計的引物和探針存在下，在熒光定量PCR儀中，對病毒核酸進(jìn)行 PCR擴增，來實現(xiàn)對腺病毒的檢測。具體地說，本試劑盒包括腺病毒的一對特異性引物(F和R)、一條特異性熒光探針 (FP)、陽性對照、陰性對照、5XPCR Buffer 和 Enzyme Mix ；①特異性引物
F 5 ’ -AGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTT-3， 25bp，R :5’ -GGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCC-3，27bp ；②熒光探針FP :Cy5-ATGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-BHQ-2 30bp,熒光探針5’端標(biāo)記熒光報告基團Cy5，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團BHQ-2 ；③陽性對照腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品；④陰性對照RNase Free H2O ；⑤5 X PCR Buffer 配制
Tris · Cl20mM
KCl80mM
(NH4) 2S0480mM
DTT1. 5mM
MgCl212mM
dNTPIOmM配置混合后于冰箱-20°C保存；⑥ Enzyme Mix 配制
Tris · Cl20mMKCl80mMDTTImMEDTA0. ImMNonidet P-400. 5%Tween 200. 5%甘油50%iTaq 酶2. 5U/配置混合后于冰箱_20°C保存。2、試劑盒的使用方法①病毒核酸的提取A、首先在緩沖液1、2中加入無水乙醇，分別加入25ml和30ml無水乙醇；在漂洗液 中力口入 30 μ g/ml carrier RNA ；B、取30 μ 1蛋白酶放入1. 5ml離心管中；C、將標(biāo)本(如咽拭子等)取200 μ 1加入此管中，充分混勻；D、再在每管分別加入200 μ 1漂洗液(含30 μ g/ml carrier RNA)，混勻振蕩30s，70°C溫育 IOmin ；E、加入250 μ 1無水乙醇，充分混勻振蕩30s，室溫裂解5min ；F、將上述裂解液加入離心柱中，SOOOrpm，離心lmin，棄收集管中的離心液。濾柱仍 放回收集管上，將步驟③剩余的混合液全部吸入濾柱中，離心后棄離心液；G、濾柱中加入500 μ 1緩沖液1，12000rpm，離心lmin，棄收集管中的離心液；H、另取一支干凈的2ml收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加 Λ 500 μ 1緩沖液2，12000rpm,離心lmin,重復(fù)步驟⑧一次；I、將濾柱移到一個干凈的收集管中，12000rpm,離心!Bmin，后將濾柱放在 370C 15min以干燥濾膜；J、將濾柱放在1. 5ml Eppendorf管上，向濾柱中加入50ulRNase_free H2O,室溫靜 置anin。12000rpm，離心2min，收集離心液即為提取的核酸。②實時熒光定量PCR擴增(每份25ul體系)取5ul病毒核酸作為模板，同時加入20ul實時熒光定量PCR反應(yīng)液至八聯(lián)管中進(jìn) 行熒光定量PCR擴增。A、實時熒光定量PCR反應(yīng)液(mix)的配制
權(quán)利要求
1. 一種腺病毒實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于本試劑盒包括腺病毒的一對特異性引物、一條特異性熒光探針、陽性對照、陰性對照、 5 X PCR Buffer 禾口 Enzyme Mix ；①特異性引物F :5’ -AGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTT-3，， R 5' -GGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCC-3，；②熒光探針FP Cy5-ATGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-BHQ-2， 熒光探針5’端標(biāo)記熒光報告基團Cy5，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團BHQ-2 ；③陽性對照 腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品；④陰性對照 RNase Free H2O ；⑤5XPCR Buffer 配制Tris · Cl KCl(NH4) 2S04 DTT MgCl2 dNTP配置混合后于冰箱-20°C保存；⑥EnzymeMix配制Tris · ClKClDTTEDTA Nonidet P-40Tween 20 甘油 iTaq 酶配置混合后于冰箱-20°C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腺病毒實時熒光定量PCR試劑盒，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的PCR試劑盒。本試劑盒包括腺病毒的一對特異性引物、一條特異性熒光探針、陽性對照、陰性對照、5xPCRBuffer和EnzymeMix；設(shè)計特異性引物F和R5'-AGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTT-3'，5'-GGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCC-3'；設(shè)計探針FPCy5-ATGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-BHQ-2。本發(fā)明檢測時間周期短、檢測效率高；檢測病毒特異性高，準(zhǔn)確率高；在進(jìn)行病毒定性分析的同時還能進(jìn)行病毒定量分析；檢測靈敏度比普通PCR和免疫學(xué)檢測方法靈敏度高；操作簡單、易于推廣；實驗結(jié)果重復(fù)性好。
文檔編號C12Q1/68GK102140549SQ20111006783
公開日2011年8月3日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者劉為勇, 劉映樂, 吳建國, 李彤亞, 湯行春, 王妍, 王珊, 石康, 程議鋒, 章琪, 胡曉靜, 艾洪武, 項榮 申請人:武漢大學(xué)