專(zhuān)利名稱：鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是一種鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
鳥(niǎo)苷的用途十分廣泛，是食品和醫(yī)藥產(chǎn)品的重要中間體，可用于合成食品增鮮劑——5’ -鳥(niǎo)苷酸二鈉以及核苷類(lèi)抗病毒藥物如利巴韋林、阿昔洛韋等，也是用于制造無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷(Acyclovir)、三氮唑核苷(ATC)、三磷酸鳥(niǎo)苷鈉(GTP)等藥物的主要原料。現(xiàn)在國(guó)內(nèi)鳥(niǎo)苷生產(chǎn)主要采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵法。鳥(niǎo)苷發(fā)酵可以采用分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵等形式。其中補(bǔ)料分批發(fā)酵由于可以降低發(fā)酵產(chǎn)物中底物濃度以及發(fā)酵粘度，解除底物抑制，提高營(yíng)養(yǎng)成分利用率，從而有利于鳥(niǎo)苷的生成。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中被大多數(shù)廠家所采用?，F(xiàn)有菌種在補(bǔ)料分批發(fā)酵的情況下，產(chǎn)苷量為每升30克左右，產(chǎn)品的收率比較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)中補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)鳥(niǎo)苷的收率低的缺點(diǎn)，提出一種鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法，該方法可以提高產(chǎn)鳥(niǎo)苷的收率，使得產(chǎn)苷量為每升30克左右提升到36克左右。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法，包括配制種子培養(yǎng)基、培養(yǎng)種子、配制發(fā)酵培養(yǎng)基、接種發(fā)酵以及補(bǔ)料發(fā)酵，其具體步驟如下a、配制種子培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖2-4%、味精0.3-1%、蛋白胨 0.5-1.5%、酵母浸出物粉 0.5-1.5%、NaCl 0. 2-0. 3 %、尿素 0. 1-0. 3 %、玉米漿 0. 5-1. 5%，然后用NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)pH7. 0-7. 2，并110°C _120°C滅菌10-20分鐘，得到種子
培養(yǎng)基；b、培養(yǎng)種子，將鳥(niǎo)苷生產(chǎn)菌接入種子培養(yǎng)基中，接種量為8% -15%，然后在 330C _35°C的溫度下，保持pH值在6. 5的條件下在5L的自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；C、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖4. 5-5. 5%、味精0. 8-1. 2%, 硫酸銨0. 7-0. 9%、酵母粉0. 8-1. 2%、硫酸鎂0. 3-0. 45%、磷酸二氫鉀0. 15-0. 25%、氯化鈣 0. 15-0. 25%、豆餅水解液 1. 5-3. 3%、玉米漿 1. 5-1. 9%，消泡劑 0. 03-0. 05%，用 NaOH 和鹽酸調(diào)節(jié)ρΗ7· 0-7. 2，，并110°C _120°C滅菌10-20分鐘，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；d、接種發(fā)酵，將步驟b中培養(yǎng)的種子按8% -15%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的50L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，時(shí)間為他，溫度為0-4h為33. 9-34. l°C，4-8h為 34. 9-35. I0C ；e、補(bǔ)料發(fā)酵，在d步驟中他以后將溫度控制在35. 9-36. 1°C，通過(guò)流加氨水將pH 控制在6. 5，溶解氧控制在40%，開(kāi)始流加葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的重量分別為d步驟中接種發(fā)酵后的總發(fā)酵液重量的10%、0.6%、2%，流加時(shí)間為16h，結(jié)束后開(kāi)始緩慢流加次黃嘌呤促進(jìn)鳥(niǎo)苷生產(chǎn)，再過(guò)M小時(shí)結(jié)束生產(chǎn)。所述的葡萄糖的水溶液的濃度為60% -70%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果是1、通過(guò)降低發(fā)酵初始葡萄糖濃度和發(fā)酵溫度，使從種子培養(yǎng)到發(fā)酵菌體生長(zhǎng)環(huán)境不產(chǎn)生大的變化，有利于菌體生長(zhǎng)；2、通過(guò)前期葡萄糖與酵母粉的連續(xù)流加，在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中維持底物濃度不變的情況下使菌體濃度達(dá)到最大；3、菌體完成之后立即開(kāi)始流加次黃嘌呤，促進(jìn)菌體生產(chǎn)鳥(niǎo)苷，使鳥(niǎo)苷產(chǎn)量得以提高。最終使發(fā)酵液中鳥(niǎo)苷濃度從30g/l提高到36g/l以上，發(fā)酵液中鳥(niǎo)苷濃度提高了 20%。
具體實(shí)施例方式實(shí)施事例1，鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法，包括配制種子培養(yǎng)基、培養(yǎng)種子、配制發(fā)酵培養(yǎng)基、 接種發(fā)酵以及補(bǔ)料發(fā)酵，其具體步驟如下a、配制種子培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖2%、味精0. 3-0. 6%、蛋白胨0. 5 %、酵母浸出物粉0. 5 % ,NaCl 0. 2 %、尿素0. 1 %、玉米漿0.5%，然后用NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)PH7.0，并110°C滅菌10分鐘，得到種子培養(yǎng)基；b、培養(yǎng)種子，將鳥(niǎo)苷生產(chǎn)菌接入種子培養(yǎng)基中，接種量為8% -10%，然后在33°C 的溫度下，保持PH值在6. 5的條件下在5L的自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；C、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖4. 5%、味精0. 8%、硫酸銨
0.7%、酵母粉0. 8%、硫酸鎂0. 3%、磷酸二氫鉀0. 15%、氯化鈣0. 15%、豆餅水解液1. 5%, 玉米漿1.5%,消泡劑0. 03%,ffi NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)ρΗ7· 0-7. 2，，并110°C滅菌10分鐘，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；d、接種發(fā)酵，將步驟b中培養(yǎng)的種子按8%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的50L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，時(shí)間為他，溫度為0-4h為33. 9°C，4-8h為34. 9°C ；e、補(bǔ)料發(fā)酵，在d步驟中他以后將溫度控制在35. 9°C，通過(guò)流加氨水將pH控制在 6. 5，溶解氧控制在40%，開(kāi)始流加葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的重量分別為d步驟中接種發(fā)酵后的總發(fā)酵液重量的10^^0.6^^2%,流加時(shí)間為16h，結(jié)束后開(kāi)始緩慢流加次黃嘌呤促進(jìn)鳥(niǎo)苷生產(chǎn)，再過(guò)M小時(shí)結(jié)束生產(chǎn)。實(shí)施事例2，鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法，包括配制種子培養(yǎng)基、培養(yǎng)種子、配制發(fā)酵培養(yǎng)基、 接種發(fā)酵以及補(bǔ)料發(fā)酵，其具體步驟如下a、配制種子培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖4%、味精0.6%、蛋白胨
1.5%、酵母浸出物粉1. 5%,NaCl 0. 3%、尿素0. 3%、玉米漿1. 5%，然后用NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)pH7. 2，并120°C滅菌20分鐘，得到種子培養(yǎng)基；b、培養(yǎng)種子，將鳥(niǎo)苷生產(chǎn)菌接入種子培養(yǎng)基中，接種量為15 %，然后在35°C的溫度下，保持PH值在6. 5的條件下在5L的自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；C、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5.5%、味精1.2%、硫酸銨0. 9 %、酵母粉1. 2 %、硫酸鎂0. 45 %、磷酸二氫鉀0. 25 %、氯化鈣0. 25 %、豆餅水解液 3. 3%、玉米漿1.9%,消泡劑0. 05%,ffi NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)ρΗ7· 2，，并120°C滅菌20分鐘，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；d、接種發(fā)酵，將步驟b中培養(yǎng)的種子按15%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的50L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，時(shí)間為他，溫度為0-4h為34. l°C,4-8h為35. 1°C ；e、補(bǔ)料發(fā)酵，在d步驟中他以后將溫度控制在36. 1°C，通過(guò)流加氨水將pH控制在 6. 5，溶解氧控制在40%，開(kāi)始流加葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的重量分別為d步驟中接種發(fā)酵后的總發(fā)酵液重量的10^^0.6^^2%,流加時(shí)間為16h，結(jié)束后開(kāi)始緩慢流加次黃嘌呤促進(jìn)鳥(niǎo)苷生產(chǎn)，再過(guò)M小時(shí)結(jié)束生產(chǎn)。實(shí)施事例3，鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法，包括配制種子培養(yǎng)基、培養(yǎng)種子、配制發(fā)酵培養(yǎng)基、 接種發(fā)酵以及補(bǔ)料發(fā)酵，其具體步驟如下a、配制種子培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖2 %、味精0.5%、蛋白胨 1%、酵母浸出物粉1%、NaCl 0.25%、尿素0.2%、玉米漿1%，然后用NaOH和鹽酸調(diào)節(jié) ρΗ7· 0-7. 2之間，并115°C滅菌15分鐘，得到種子培養(yǎng)基； b、培養(yǎng)種子，將鳥(niǎo)苷生產(chǎn)菌接入種子培養(yǎng)基中，接種量為8%，然后在34°C的溫度下，保持PH值在6. 5的條件下在5L的自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；C、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5 %、味精1%、硫酸銨 0. 8 %、酵母粉1 %、硫酸鎂0. 3 %、磷酸二氫鉀0.15%、氯化鈣0. 15 %、豆餅水解液1. 5 %、玉米漿1.7%,消泡劑0. 04%,ffi NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)ρΗ7· 0-7. 2，，并115°C滅菌15分鐘，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；d、接種發(fā)酵，將步驟b中培養(yǎng)的種子按10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的50L 自動(dòng)控制發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，時(shí)間為他，溫度為0-4h為34°C，4- !為35°C ；e、補(bǔ)料發(fā)酵，在d步驟中他以后將溫度控制在36°C，通過(guò)流加氨水將pH控制在 6. 5，溶解氧控制在40%，開(kāi)始流加葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的重量分別為d步驟中接種發(fā)酵后的總發(fā)酵液重量的10^^0.6^^2%,流加時(shí)間為16h，結(jié)束后開(kāi)始緩慢流加次黃嘌呤促進(jìn)鳥(niǎo)苷生產(chǎn)，再過(guò)M小時(shí)結(jié)束生產(chǎn)。實(shí)施事例4，鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法，包括配制種子培養(yǎng)基、培養(yǎng)種子、配制發(fā)酵培養(yǎng)基、 接種發(fā)酵以及補(bǔ)料發(fā)酵，其具體步驟如下a、配制種子培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5 %、味精1%、蛋白胨 1%、酵母浸出物粉1%、NaCl 0.25%、尿素0.2%、玉米漿1%，然后用NaOH和鹽酸調(diào)節(jié) ρΗ7· 0-7. 2之間，并115°C滅菌15分鐘，得到種子培養(yǎng)基；b、培養(yǎng)種子，將鳥(niǎo)苷生產(chǎn)菌接入種子培養(yǎng)基中，接種量為10 %，然后在34°C的溫度下，保持PH值在6. 5的條件下在5L的自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；C、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5 %、味精1%、硫酸銨 0. 8%、酵母粉1 %、硫酸鎂0. 4%、磷酸二氫鉀0. 2%、氯化鈣0. 2%、豆餅水解液1. 5%、玉米漿1. 7%，消泡劑0. 04%，用NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)pH7. 0-7. 2，，并115°C滅菌15分鐘，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；d、接種發(fā)酵，將步驟b中培養(yǎng)的種子按12%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的50L 自動(dòng)控制發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，時(shí)間為他，溫度為0-4h為34°C，4- !為35°C ；e、補(bǔ)料發(fā)酵，在d步驟中他以后將溫度控制在36°C，通過(guò)流加氨水將pH控制在 6. 5，溶解氧控制在40%，開(kāi)始流加葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的重量分別為d步驟中接種發(fā)酵后的總發(fā)酵液重量的10^^0.6^^2%,流加時(shí)間為16h，結(jié)束后開(kāi)始緩慢流加次黃嘌呤促進(jìn)鳥(niǎo)苷生產(chǎn)，再過(guò)M小時(shí)結(jié)束生產(chǎn)。
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實(shí)施事例5，鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法，包括配制種子培養(yǎng)基、培養(yǎng)種子、配制發(fā)酵培養(yǎng)基、 接種發(fā)酵以及補(bǔ)料發(fā)酵，其具體步驟如下a、配制種子培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5 %、味精1%、蛋白胨 1%、酵母浸出物粉1%、NaCl 0.25%、尿素0.2%、玉米漿1%，然后用NaOH和鹽酸調(diào)節(jié) ρΗ7· 0-7. 2之間，并115°C滅菌15分鐘，得到種子培養(yǎng)基；b、培養(yǎng)種子，將鳥(niǎo)苷生產(chǎn)菌接入種子培養(yǎng)基中，接種量為15 %，然后在34°C的溫度下，保持PH值在6. 5的條件下在5L的自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；C、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5 %、味精1%、硫酸銨 0. 8 %、酵母粉1 %、硫酸鎂0. 4 %、磷酸二氫鉀0. 2 %、氯化鈣0. 2 %、豆餅水解液1. 5 %、玉米 ^ 1.7%,消泡劑0. 04%,ffi NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)ρΗ7· 0-7. 2，，并115°C滅菌15分鐘，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；d、接種發(fā)酵，將步驟b中培養(yǎng)的種子按8%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的50L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，時(shí)間為他，溫度為0-4h為34°C，4-8h為35°C ；e、補(bǔ)料發(fā)酵，在d步驟中他以后將溫度控制在36°C，通過(guò)流加氨水將pH控制在 6. 5，溶解氧控制在40%，開(kāi)始流加葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的重量分別為d步驟中接種發(fā)酵后的總發(fā)酵液重量的10^^0.6^^2%,流加時(shí)間為16h，結(jié)束后開(kāi)始緩慢流加次黃嘌呤促進(jìn)鳥(niǎo)苷生產(chǎn)，再過(guò)M小時(shí)結(jié)束生產(chǎn)。在上述各個(gè)實(shí)施事例中葡萄糖的水溶液的濃度為60% -70%，通常采用55%、 60^^65^^67%,70%或75%的葡萄糖水溶，但其中葡萄糖的總重量為接種發(fā)酵后的發(fā)酵液的總重量的10%。
權(quán)利要求
1.鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法，包括配制種子培養(yǎng)基、培養(yǎng)種子、配制發(fā)酵培養(yǎng)基、接種發(fā)酵以及補(bǔ)料發(fā)酵，其具體步驟如下a、配制種子培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖2-4%、味精0.3-1%、蛋白胨 0. 5-1. 5 %、酵母浸出物粉 0. 5-1. 5 %、NaCl 0. 2-0. 3 %、尿素 0. 1-0. 3 %、玉米漿 0. 5-1. 5%，然后用NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)pH7. 0-7. 2，并110°C _120°C滅菌10-20分鐘，得到種子培養(yǎng)基；b、培養(yǎng)種子，將鳥(niǎo)苷生產(chǎn)菌接入種子培養(yǎng)基中，接種量為8%-15%，然后在33°C-35°C 的溫度下，保持PH值在6. 5的條件下在5L的自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；c、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在水中按重量百分比加入葡萄糖4.5-5. 5%、味精0. 8-1. 2%、硫酸銨0. 7-0. 9%、酵母粉0. 8-1. 2%、硫酸鎂0. 3-0. 45%、磷酸二氫鉀0. 15-0. 25%、氯化鈣 0. 15-0. 25%、豆餅水解液 1. 5-3. 3%、玉米漿 1. 5-1. 9%，消泡劑0. 03-0. 05%，用 NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)ρΗ7· 0-7. 2，，并110°C _120°C滅菌10-20分鐘，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；d、接種發(fā)酵，將步驟b中培養(yǎng)的種子按8%-15%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的50L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，時(shí)間為8h，溫度為0-4h為33. 9-34. 1 °C，4-8h為 34. 9-35. I0C ；e、補(bǔ)料發(fā)酵，在d步驟中他以后將溫度控制在35.9-36. TC，通過(guò)流加氨水將pH控制在6. 5，溶解氧控制在40%，開(kāi)始流加葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液的重量分別為d步驟中接種發(fā)酵后的總發(fā)酵液重量的10%、0.6%、 2%，流加時(shí)間為16h，結(jié)束后開(kāi)始緩慢流加次黃嘌呤促進(jìn)鳥(niǎo)苷生產(chǎn)，再過(guò)M小時(shí)結(jié)束生產(chǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的葡萄糖的水溶液的濃度為 60% -70%。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是一種鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法。鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法，包括配制種子培養(yǎng)基、培養(yǎng)種子、配制發(fā)酵培養(yǎng)基、接種發(fā)酵以及補(bǔ)料發(fā)酵后本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果通過(guò)降低發(fā)酵初始葡萄糖濃度和發(fā)酵溫度，使從種子培養(yǎng)到發(fā)酵菌體生長(zhǎng)環(huán)境不產(chǎn)生大的變化，有利于菌體生長(zhǎng)；通過(guò)前期葡萄糖與酵母粉的連續(xù)流加，在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中維持底物濃度不變的情況下使菌體濃度達(dá)到最大；菌體完成之后立即開(kāi)始流加次黃嘌呤，促進(jìn)菌體生產(chǎn)鳥(niǎo)苷，使鳥(niǎo)苷產(chǎn)量得以提高。最終使發(fā)酵液中鳥(niǎo)苷濃度從30g/l提高到36g/l以上，發(fā)酵液中鳥(niǎo)苷濃度提高了20％。
文檔編號(hào)C12P19/40GK102181509SQ201110068039
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者肖杰, 陳芳 申請(qǐng)人:江蘇康力生物科技發(fā)展有限公司