專利名稱：弓形蟲重組卡介苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種弓形蟲重組卡介苗，用于預(yù)防治療弓形蟲病，本發(fā)明還提供了該疫苗的制備方法，屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
弓形蟲病(Toxoplamasis)是由剛地弓形蟲引起的一種世界范圍內(nèi)廣泛分布的人獸共患病，由于其宿主范圍非常廣，能夠感染人及大多數(shù)動(dòng)物。弓形蟲感染對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重，主要造成流產(chǎn)、畸胎、死產(chǎn)等。弓形蟲的危害巨大，但對(duì)該病的防治至今尚未找到理想的藥物。盡管抗寄生蟲藥物非常有效、廉價(jià)并且易于用藥，但弓形蟲耐藥性的產(chǎn)生以及人們普遍關(guān)注的藥物殘留問(wèn)題日益嚴(yán)重。相比而言，疫苗比較安全，無(wú)化學(xué)殘留且無(wú)污染。有學(xué)者通過(guò)對(duì)弓形蟲抗原及免疫效應(yīng)的深入研究后認(rèn)為有效的疫苗對(duì)該病的防治具有顯著的意義。弓形蟲疫苗的研究經(jīng)歷了滅活疫苗、減毒活疫苗等多種探索，前者刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗感染能力弱，后者雖能較好地產(chǎn)生保護(hù)作用，但由于經(jīng)突變后恢復(fù)毒力，故不適用于人類，因此，采用基因工程方法發(fā)展一種高效，廉價(jià)的新型弓形蟲疫苗是本發(fā)明的任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種弓形蟲重組卡介苗，為穿梭表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗和整合表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗，具有熱穩(wěn)定性好，運(yùn)輸和保存較為容易，易于生產(chǎn)，產(chǎn)品不需純化等特點(diǎn)。本發(fā)明還公開了弓形蟲重組卡介苗的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明弓形蟲重組卡介苗的解決方案如下首先將獲得剛地弓形蟲保護(hù)性抗原基因，進(jìn)行TA克隆，測(cè)序鑒定正確后酶切回收目的片段，再分別與同樣進(jìn)行酶切反應(yīng)的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體PMV261和整合表達(dá)載體pMV361相連，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG， 經(jīng)抗性和PCR篩選得到陽(yáng)性剛地弓形蟲重組卡介苗。本發(fā)明所提供的弓形蟲重組卡介苗疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明以剛地弓形蟲保護(hù)性抗原Cyclophilin (CyP)基因?yàn)槔?，進(jìn)行穿梭表達(dá)載體和整合表達(dá)載體的構(gòu)建，分別制成疫苗。、穿梭表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗的制備
根據(jù)剛地弓形蟲CyP基因序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，TA克隆。測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行雙酶切，切膠回收，與進(jìn)行同樣酶切的PMM61穿梭表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入DH5 α 中，將重組質(zhì)粒CyP161電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，篩選BCG重組子， PCR證實(shí)為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行45°C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及 Western blotting 鑒定，命名為 rBCG pMV261-CyP0檢測(cè)疫苗將制備好的穿梭表達(dá)載體剛地弓形蟲重組卡介苗疫苗rBCG pMV261-CyP以IOOug/只的劑量通過(guò)口服、靜脈注射兩種不同免疫途徑免疫BALB/c雌性小鼠，并同時(shí)設(shè)BCG組和空白對(duì)照組，三免一周后腹腔注射的方式接種弓形蟲RH株速殖子進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)，通過(guò)存活時(shí)間、存活率、腦組織包囊數(shù)、體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平檢測(cè)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。穿梭表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗rBCG pMM61_CyP可對(duì)抗中等劑量剛地弓形蟲的攻擊，靜脈注射試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，特異性抗體滴度隨免疫次數(shù)增加而逐漸升高，且差異極顯著(P<0. 01)；⑶4+與⑶8+T淋巴細(xì)胞數(shù)均明顯升高，且與對(duì)照組相比差異極顯著 (P<0.01);CD4+/CD8+比值，各組差異不顯著(P>0. 05)。經(jīng)腹腔接種弓形蟲1000個(gè)/只，結(jié)果為靜脈注射試驗(yàn)組較對(duì)照組腦組織包囊數(shù)減少可達(dá)45%，小鼠存活時(shí)間與對(duì)照組相比差異顯著(P<0. 05)?？诜囼?yàn)組與對(duì)照組相比，特異性抗體滴度隨免疫次數(shù)增加而逐漸升高， 且差異顯著(P<0.05)；⑶4+與⑶8+T淋巴細(xì)胞數(shù)均明顯升高，且與對(duì)照組相比差異顯著 (P<0. 05);CD4+/CD8+比值，各組差異不顯著(P>0. 05)。經(jīng)腹腔接種弓形蟲1000個(gè)/只，結(jié)果為口服試驗(yàn)組較對(duì)照組腦組織包囊數(shù)減少可達(dá)41. 2%，小鼠存活時(shí)間與對(duì)照組相比均差異顯著(P<0.05)。提示我們單獨(dú)使用BCG對(duì)增強(qiáng)剛地弓形蟲免疫保護(hù)力也有一定的效果， 其中以靜脈注射方式免疫效果更好。、整合表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗的制備
根據(jù)已發(fā)表的剛地弓形蟲CyP基因序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，TA克隆。測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行雙酶切，切膠回收，與進(jìn)行同樣酶切的PMV361穿梭表達(dá)載體進(jìn)行連接， 轉(zhuǎn)入DH5ci中，將重組質(zhì)粒CyP-361電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，篩選 BCG重組子，PCR證實(shí)為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行45°C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及 Western blotting 鑒定，命名為 rBCG pMV361-CyP0檢測(cè)疫苗將制備好的穿梭表達(dá)載體剛地弓形蟲重組卡介苗疫苗rBCG pMV361-CyP以IOOug/只的劑量通過(guò)口服、靜脈注射兩種不同免疫途徑免疫BALB/c雌性小鼠，并同時(shí)設(shè)BCG組和空白對(duì)照組，三免一周后腹腔注射的方式接種弓形蟲RH株速殖子進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)，通過(guò)存活時(shí)間、存活率、腦組織包囊數(shù)、體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平檢測(cè)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。兩種免疫途徑使用重組卡介苗疫苗均能不同程度的提高免疫水平，免疫鼠CD4+ 與⑶8+的值和特異性抗體滴度等免疫指標(biāo)均升高，靜脈注射試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0. 05)，口服試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0. 05)，各組之間⑶4+/⑶8+比值差異不顯著(P>0. 05)；攻蟲試驗(yàn)顯示，靜脈注射試驗(yàn)組較對(duì)照組小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)，與PBS對(duì)照組差異顯著(P<0. 05)，腦組織包囊蟲體數(shù)量減少，可減少34%。親環(huán)蛋白(Cyclophilin，CyP)家族是一類廣泛存在于原核和真核生物體內(nèi)，并在結(jié)構(gòu)上高度保守的多功能蛋白質(zhì)。最近幾年，寄生蟲的CyI^s引起人們的極大注意，因?yàn)镃sA 不僅是一種免疫抑制劑，而且它還具有抗寄生蟲活性。環(huán)孢素A的抗寄生蟲活性已經(jīng)在一些原蟲和腸道蠕蟲上得到證明。TgCyP是細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間信息傳遞的介質(zhì)，它能結(jié)合樹狀突細(xì)胞上的CCR5細(xì)胞因子受體，刺激樹狀突細(xì)胞產(chǎn)生IL-12。此外，TgCyP能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮不僅在抑制弓形蟲的繁殖過(guò)程中起到重要的作用，而且在誘導(dǎo)慢殖子的轉(zhuǎn)變過(guò)程中也起著舉足輕重的作用。通過(guò)對(duì)CyP的研究，有人認(rèn)為CyP在宿主細(xì)胞對(duì)剛地弓形蟲的保護(hù)性免疫反應(yīng)中起到重要的作用。因此本發(fā)明選擇使用Cyclophilin基因作為保護(hù)性抗原基因進(jìn)行重組卡介苗的構(gòu)建。這樣的活載體疫苗既能發(fā)揮卡介苗本身較強(qiáng)的細(xì)胞免疫佐劑作用，又能使表達(dá)的蛋白發(fā)揮免疫保護(hù)作用，達(dá)到更好的預(yù)防弓形蟲病的目的。因此這兩種疫苗的研制具有非常廣闊的前景和應(yīng)用價(jià)值。將本發(fā)明提供的兩種弓形蟲重組卡介苗通過(guò)口服、靜脈注射兩種途徑免疫BALB/ c雌性小鼠后，以腹腔注射的方式接種弓形蟲RH株速殖子進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)，通過(guò)存活時(shí)間、存活率、腦組織包囊數(shù)、體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平檢測(cè)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示， 剛地弓形蟲重組卡介苗rBCG pMV261-CyP和rBCG pMV361-CyP組均具有明顯的免疫促進(jìn)作用，各指標(biāo)均強(qiáng)于陰性對(duì)照組，具有很好的抗剛地弓形蟲效果。本發(fā)明的積極效果在于利用卡介苗活載體疫苗本身具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫佐劑作用，而且又能高效表達(dá)剛地弓形蟲蛋白，使表達(dá)的蛋白發(fā)揮很好的免疫保護(hù)作用，兩者優(yōu)勢(shì)組合，達(dá)到更好的預(yù)防弓形蟲病的目的。本發(fā)明疫苗熱穩(wěn)定性好，運(yùn)輸和保存較為容易，易于生產(chǎn)，產(chǎn)品不需純化，可直接用于免疫保護(hù)試驗(yàn)，免去了蛋白質(zhì)后處理的復(fù)雜工序，從而大大降低了成本，適宜于廣大農(nóng)村。


圖1為PMV261-CyP載體構(gòu)建示意圖2為重組質(zhì)粒pMM61-CyP在卡介苗表達(dá)SDA-PAGE結(jié)果； 圖3為PMV361-CyP載體構(gòu)建示意圖； 圖4為重組質(zhì)粒pMV361-CyP在卡介苗表達(dá)SDA-PAGE結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
本發(fā)明弓形蟲重組卡介苗疫苗的制備
以剛地弓形蟲保護(hù)性抗原Cyclophilin基因?yàn)槔M(jìn)行穿梭表達(dá)載體和整合表達(dá)載體的構(gòu)建。一、穿梭表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗的制備步驟
參照Cyclophilin基因DNA序列及穿梭載體pMV261物理圖譜設(shè)計(jì)兩對(duì)引物并引入酶切位點(diǎn)。上游引物QFl :5，- GAATTCATGAAGCTCGTGCTGTTTTTCCT _3，；其中端含有 EcoRI 位點(diǎn)；
下游引物 QR :5，- GTCGACTTACTCCAACAAACCAATGTCCGT -3，；其中 5、端含有 SalI 位
點(diǎn)ο將PCR純化產(chǎn)物克隆至pMDIS-T載體并進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定，凝膠回收片段與同樣進(jìn)行酶切的穿梭表達(dá)載體PMV261連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五cWi DH5a感受態(tài)細(xì)胞后篩選重組質(zhì)粒，用EcoRIjall進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，重組質(zhì)粒命名為pMM61_CyP(如圖1所示)。 將BCG接種于MB7H9 ADC液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，沉淀用10% 甘油洗滌，最后重懸Iml 10%甘油中，用于電轉(zhuǎn)化。取60-80ulBCG感受態(tài)菌液加入0. Iug重組質(zhì)粒PMV261-CyP置于電轉(zhuǎn)杯中。電穿參數(shù)電壓2. 5KV，電容25 μ F，電阻1000 Ω。電穿孔轉(zhuǎn)化后立即加入ΜΒ7Η9 ADC培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2d后涂布于含20ug/mlKan MB7H9 ADC培養(yǎng)基平板，約3w后長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化菌落。從培養(yǎng)基平板上挑取BCG重組子，接種于液體培養(yǎng)基(含Kan)，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PCR證實(shí)陽(yáng)性克隆后，45°C水浴中誘導(dǎo)4h，離心收集菌體，并處理，最后加入等體積2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，100°C 5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE 分析及Astern blotting鑒定(見圖2)。二、整合表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗的制備步驟
參照Cyclophilin基因DNA序列及穿梭載體pMV361物理圖譜設(shè)計(jì)兩對(duì)引物并引入酶切位點(diǎn)。上游引物QF2: 5，- CTCGAGATGAAGCTCGTGCTGTTTTTCCT -3，；其中端含有 XhoI 位點(diǎn)；
下游引物 QR :5，- ATCGATTTACTCCAACAAACCAATGTCCGT -3，；其中 5、端含有 ClaI 位
點(diǎn)ο將PCR純化產(chǎn)物克隆至PMD18-T載體并進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定，凝膠回收片斷與整合表達(dá)載體PMV361連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五cWi DH5a感受態(tài)細(xì)胞后篩選重組質(zhì)粒，用和)(h0I、ClaI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，重組質(zhì)粒命名為PMV361-CyP (如圖3所示)。取60_80ul感受態(tài)BCG菌液加入0. Iug重組質(zhì)粒PMV361-CyP置于電轉(zhuǎn)杯中。電穿參數(shù)電壓2. 5KV,電容25 μ F，電阻1000 Ω。電穿孔轉(zhuǎn)化后立即加入ΜΒ7Η9 ADC培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2d后涂布于MB7H9 ADC培養(yǎng)基平板。從培養(yǎng)基平板上挑取BCG重組子，接種于液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PCR證實(shí)陽(yáng)性克隆后45°C水浴中誘導(dǎo)4h，離心收集菌體，并處理，最后加入等體積2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，100°C 5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Western blotting鑒定(見圖4)。試驗(yàn)例1
以下實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明弓形蟲重組卡介苗疫苗的效果一、穿梭表達(dá)載體剛地弓形蟲重組卡介苗疫苗
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用BALB/c雌性小鼠，18-22g，隨機(jī)分為4組，每組10只。將穿梭表達(dá)載體重組卡介苗疫苗rBCG PMV261-Cyp以IOOug/只的劑量通過(guò)口服、靜脈注射兩種不同免疫途徑免疫小鼠，并同時(shí)設(shè)BCG免疫組和陰性對(duì)照組。分三次免疫，每次間隔一周，三免一周后口服接種腹腔注射的方式接種弓形蟲RH株速殖子IX IO3個(gè)/只進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)，進(jìn)行以下各項(xiàng)指標(biāo)判定，包括存活時(shí)間、存活率、腦組織包囊數(shù)等，免疫后采血，流式細(xì)胞儀對(duì)CD4+、 CD8+進(jìn)行細(xì)胞水平免疫檢測(cè)，分離血清ELISA方法對(duì)體液免疫水平進(jìn)行檢測(cè)。攻蟲后觀察并記錄各組小鼠死亡時(shí)間。取等質(zhì)量死亡小鼠腦組織，用研缽磨碎， ImLPBS混勻，取100 μ L均分成四份鏡檢腦組織包囊數(shù)。結(jié)果顯示各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于PBS 陰性對(duì)照組。結(jié)論說(shuō)明我們所采用的免疫程序是安全有效的，靜脈注射試驗(yàn)組較對(duì)照組腦組織包囊數(shù)減少可達(dá)45%，口服免疫組較對(duì)照組腦組織包囊數(shù)減少可達(dá)41. 2%，小鼠存活時(shí)間與對(duì)照組相比均差異顯著(Ρ<0. 05)發(fā)揮了 BCG作為免疫增強(qiáng)劑的效果，效果尤為突出的是本發(fā)明所提供的穿梭表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMM61-CyP，而免疫方式以靜脈注射方式效果最佳(見表3，4 )。將發(fā)明的新型疫苗rBCG PMV261-CyP免疫小鼠后，于第三次免疫后1周，每組隨機(jī)各取4只小鼠處死，取脾臟，加2mL PBS，在200目篩上研磨，用PBS稀釋成細(xì)胞懸液(IO7 個(gè)/mL)。取100 μ L細(xì)胞懸液，加FITC標(biāo)記的抗⑶4+和PE標(biāo)記的抗⑶8+兔抗鼠單克隆抗體，避光作用40min，然后用PBS洗液洗2遍，加入0. 5mL熒光保存液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，并用SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明免疫組及BCG組⑶4+、⑶8+變量明顯高于陰性對(duì)照組，而rBCG PMV261-CyP靜脈注射組小鼠的 ⑶4+、⑶8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)均升高，與其他個(gè)組相比差異均顯著(P<0. 05)。每次免疫前尾靜脈采血，分離血清，用弓形蟲RH株速殖子蛋白作為包被抗原，通過(guò)間接ELISA方法對(duì)小鼠血清中IgG變化情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果一免后各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比IgG滴度變化不大，差異不顯著。二免后IgG滴度逐漸上升，第三次免疫后，各實(shí)驗(yàn)組均顯示一定的抗體效價(jià)，其中， rBCG PMV261-CyP靜脈注射組血清抗體吸光度最高，于其它組相比差異極顯著(P<0.01)。 (見表1，2)這證實(shí)本發(fā)明所提供的穿梭表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV261-CyP, 其最佳免疫方式是靜脈注射。二、整合表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用BALB/c雌性小鼠，18-22g，隨機(jī)分為4組，每組10只。將整合表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗rBCG PMV361-CyP以IOOug/只的劑量通過(guò)口服、靜脈注射兩種不同免疫途徑免疫小鼠，并同時(shí)設(shè)BCG免疫組和陰性對(duì)照組。分三次免疫，每次間隔一周，三免一周后口服接種弓形蟲RH株速殖子1 X IO3個(gè)/只進(jìn)行攻蟲試驗(yàn)，進(jìn)行以下各項(xiàng)指標(biāo)判定， 包括存活時(shí)間、存活率、腦組織包囊數(shù)等，免疫后采血，流式細(xì)胞儀對(duì)CD4+、CD8+進(jìn)行細(xì)胞水平免疫檢測(cè)，分離血清ELISA方法對(duì)體液免疫水平進(jìn)行檢測(cè)。攻蟲后觀察并記錄各組小鼠死亡時(shí)間。取等質(zhì)量死亡小鼠腦組織，用研缽磨碎， ImLPBS混勻，取100 μ L均分成四份鏡檢腦組織包囊數(shù)。結(jié)果顯示各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于PBS 陰性對(duì)照組。其中靜脈注射試驗(yàn)組較對(duì)照組腦組織包囊數(shù)減少可達(dá)34%，口服免疫組較對(duì)照組腦組織包囊數(shù)減少可達(dá)31%，兩組小鼠存活時(shí)間與對(duì)照組相比均差異顯著(Ρ<0. 05)發(fā)揮了 BCG作為免疫增強(qiáng)劑的效果，效果尤為突出的是本發(fā)明所提供的弓形蟲重組卡介苗疫苗 rBCG PMV361-CyP (見表 7，8)。將發(fā)明的新型疫苗rBCG PMV361-CyP免疫小鼠后，于第三次免疫后1周，每組隨機(jī)各取4只小鼠處死，取脾臟，加2mL PBS，在200目篩上研磨，用PBS稀釋成細(xì)胞懸液(IO7 個(gè)/mL)。取100 μ L細(xì)胞懸液，加FITC標(biāo)記的抗⑶4+和PE標(biāo)記的抗⑶8+兔抗鼠單克隆抗體，避光作用40min，然后用PBS洗液洗2遍，加入0. 5mL熒光保存液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，并用SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明免疫組及BCG組⑶4+、⑶8+變量明顯高于陰性對(duì)照組，而rBCG PMV261-CyP靜脈注射組小鼠的 ⑶4+、⑶8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)均升高，與其他個(gè)組相比差異均顯著(P<0. 05)。每次免疫前尾靜脈采血，分離血清，用弓形蟲RH株速殖子蛋白作為包被抗原，通過(guò)間接ELISA方法對(duì)小鼠血清中IgG變化情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果一免后各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比IgG滴度變化不大，差異不顯著。二免后IgG滴度逐漸上升，第三次免疫后，各實(shí)驗(yàn)組均顯示一定的抗體效價(jià)(見表 5，6)。表1重組卡介苗疫苗pMV261_CyP免疫后各組小鼠血清特異性抗體IgG滴度變化情況。
表2 重組卡介苗疫苗pMM61_CyP免疫后試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠脾臟⑶4+和 ⑶8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量。
權(quán)利要求
1.一種弓形蟲重組卡介苗，其特征在于首先獲得剛地弓形蟲保護(hù)性抗原基因，進(jìn)行 TA克隆，測(cè)序鑒定正確后酶切回收目的片段，再分別與同樣進(jìn)行酶切反應(yīng)的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體PMV261和整合表達(dá)載體pMV361相連，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG，經(jīng)抗性和 PCR篩選得到陽(yáng)性剛地弓形蟲重組卡介苗。
2.一種穿梭表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗是通過(guò)以下步驟制備的根據(jù)剛地弓形蟲CyP基因序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，TA克?。粶y(cè)序鑒定正確后進(jìn)行雙酶切，切膠回收，與進(jìn)行同樣酶切的PMV261穿梭表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入DH5 α 中，將重組質(zhì)粒CyP161電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，篩選BCG重組子， PCR證實(shí)為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行45°C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及 Western blotting 鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組卡介苗疫苗的制備工藝，包括以下步驟1)參照Cyclophilin基因DNA序列及穿梭載體pMV261物理圖譜設(shè)計(jì)兩對(duì)引物并引入酶切位點(diǎn)上游引物 QFl :5，- GAATTCATGAAGCTCGTGCTGTTTTTCCT -3，；其中 5、端含有 EcoRI 位占.下游引物 QR :5，- GTCGACTTACTCCAACAAACCAATGTCCGT -3，；其中 5、端含有 SalI 位占.2)將PCR純化產(chǎn)物克隆至pMDIS-T載體并進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定，凝膠回收片段與同樣進(jìn)行酶切的穿梭表達(dá)載體PMM61連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五C07iDH5 α感受態(tài)細(xì)胞后篩選重組質(zhì)粒，用EcoRI、Sail進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，得pMM61_CyP重組質(zhì)粒；3)將BCG接種于MB7H9ADC液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，沉淀用10%甘油洗滌，最后重懸Iml 10%甘油中，用于電轉(zhuǎn)化；4)取60-80ulBCG感受態(tài)菌液加入0.Iug重組質(zhì)粒PMV261_CyP置于電轉(zhuǎn)杯中；電穿參數(shù)電壓2. 5KV,電容25 μ F，電阻1000 Ω ；電穿孔轉(zhuǎn)化后立即加入ΜΒ7Η9 ADC培養(yǎng)基中， 37°C培養(yǎng)2d后涂布于含20ug/mlKan MB7H9 ADC培養(yǎng)基平板，約3w后長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化菌落；5)從培養(yǎng)基平板上挑取BCG重組子，接種于液體培養(yǎng)基(含Kan)，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PCR證實(shí)陽(yáng)性克隆后，45°C水浴中誘導(dǎo)4h，離心收集菌體，并處理，最后加入等體積2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，100 "C 5min ；取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Western blotting 鑒定6)將構(gòu)建成功的含有CyP基因的rBCGpMV261-CyP接種于MB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(3-4周)，離心收集菌體，沉淀用生理鹽水洗滌2次，最后重懸于滅菌生理鹽水中。
4.一種整合表達(dá)載體弓形蟲重組卡介苗疫苗是通過(guò)以下步驟制備的根據(jù)剛地弓形蟲CyP基因序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，TA克??；測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行雙酶切，切膠回收，與進(jìn)行同樣酶切的PMV361穿梭表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入DH5 α 中，將重組質(zhì)粒CyP-361電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，篩選BCG重組子， PCR證實(shí)為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行45°C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及 Western blotting 鑒定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組卡介苗疫苗的制備工藝，包括以下步驟1)參照Cyclophilin基因DNA序列及穿梭載體pMV361物理圖譜設(shè)計(jì)兩對(duì)引物并引入酶切位點(diǎn)上游引物 QF2: 5’ - CTCGAGATGAAGCTCGTGCTGTTTTTCCT -3，；其中端含有 XhoI 位占.下游引物 QR :5，- ATCGATTTACTCCAACAAACCAATGTCCGT -3，；其中 5、端含有 ClaI 位占.2)將PCR純化產(chǎn)物克隆至PMD18-T載體并進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定，凝膠回收片斷與整合表達(dá)載體PMV361連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五cWi DH5a感受態(tài)細(xì)胞后篩選重組質(zhì)粒，用 XhoI.Cla I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，得PMV361-CyP重組質(zhì)粒；3)60-80ul感受態(tài)BCG菌液加入0. Iug重組質(zhì)粒PMV361-CyP置于電轉(zhuǎn)杯中；電穿參數(shù)電壓2. 5KV,電容25 μ F，電阻1000 Ω ；4)電穿孔轉(zhuǎn)化后立即加入ΜΒ7Η9ADC培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2d后涂布于ΜΒ7Η9 ADC培養(yǎng)基平板；5)從培養(yǎng)基平板上挑取BCG重組子，接種于液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PCR 證實(shí)陽(yáng)性克隆后45°C水浴中誘導(dǎo)4h，離心收集菌體，并處理，最后加入等體積2 X SDS-PAGE 上樣緩沖液，IOO0C 5min ；取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Western blotting鑒定；6)將構(gòu)建成功的含有CyP基因的rBCGpMV361-CyP接種于MB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(3-4周)，離心收集菌體，沉淀用生理鹽水洗滌2次，最后重懸于滅菌生理鹽水中。
全文摘要
本發(fā)明提供一種弓形蟲重組卡介苗及制備方法，首先將獲得剛地弓形蟲保護(hù)性抗原基因，進(jìn)行TA克隆，測(cè)序鑒定正確后酶切回收目的片段，再分別與同樣進(jìn)行酶切反應(yīng)的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體pMV261和整合表達(dá)載體pMV361相連，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG，經(jīng)抗性和PCR篩選得到陽(yáng)性剛地弓形蟲重組卡介苗。本發(fā)明疫苗熱穩(wěn)定性好，運(yùn)輸和保存較為容易，易于生產(chǎn)，產(chǎn)品不需純化，可直接用于免疫保護(hù)試驗(yàn)，免去了蛋白質(zhì)后處理的復(fù)雜工序，從而大大降低了成本，適宜于廣大農(nóng)村。
文檔編號(hào)C12R1/32GK102198267SQ20111006808
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者于欽磊, 宮鵬濤, 張倩, 張國(guó)才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李 赫, 楊舉 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)