專(zhuān)利名稱(chēng)：靈芝屬內(nèi)重組的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因、該基因編碼的蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的基因及其應(yīng)用，具體是一種重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因、該基因編碼的蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白是從高等真菌的子實(shí)體中提取的、與植物凝集素和免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)及免疫功能相似的一類(lèi)小分子蛋白質(zhì)。自1989年日本學(xué)者Kino等從赤靈芝Oianoderma lucidium)子實(shí)體中分離提取出第一個(gè)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(LZ-8)以來(lái)， 已分別從松杉靈芝(G. tsugae)、金針菇(Flammulina velutipes)、草菇(Volvariella volvacea)、紫芝(G. japoncium)、小孢靈芝(G. microsporum)以及中國(guó)紫芝(G. sinense)中分離得到了七種 FIPs，即 LZ-8 (FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo、FIP-gja、FlP-gmi 和FlP-gsi，形成了一個(gè)新的蛋白質(zhì)家族——Fib。林忠平等在《遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》2006年第1期83-87頁(yè)發(fā)表了題為《真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP)結(jié)構(gòu)與功能研究》一文，文中評(píng)述，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白家族成員的一級(jí)結(jié)構(gòu)有著60% 70%的同源性，該家族蛋白也具有相似的免疫調(diào)節(jié)功能，如FIP能夠促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞的有絲分裂；誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子；減少抗原誘導(dǎo)型抗體的形成以及抑制非胖糖尿病小鼠的自身免疫。但是，不同的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白家族成員在氨基酸序列上仍然存在著一定的差異，其免疫調(diào)節(jié)功能在體內(nèi)與體外也有不同程度的表現(xiàn)。此外，在真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行重要的免疫調(diào)節(jié)功能的同時(shí)，并未表現(xiàn)出對(duì)機(jī)體的負(fù)面效應(yīng)。因此，該蛋白家族在藥物臨床應(yīng)用方面存在著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。然而值得注意的是，由于天然的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)量較低，如Kino，K.等在《Journal of Biological Chemistry》(生物化學(xué)雜志)1989 年第 1 期 472 478 頁(yè)發(fā)表了題為《Isolation and characterization of a new immunomodulatory protein, ling zhi-8 (LZ-8), from Ganoderma lucidium))(從赤芝中分離和描述了一種新的免疫調(diào)節(jié)蛋白lingzhi-8(LZ-8)) —文，文中評(píng)述，340g靈芝菌絲體中僅分離純化得到5 IOmg的LZ-8。并且分離純化工藝成本較高且費(fèi)時(shí)，所以，應(yīng)用基因工程思路改造真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因，并采用可大規(guī)模生產(chǎn)化的工程菌有效表達(dá)， 就具有著重要的研究意義和實(shí)際價(jià)值。利用基因工程手段，將真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在微生物以及植物中高效表達(dá)的報(bào)道已經(jīng)屢見(jiàn)不鮮。例如，白杰英等在《分子植物育種》2006年第 5期645-649頁(yè)發(fā)表了題為《靈芝LZ-8在煙草中的表達(dá)及產(chǎn)物特性的初步研究》一文，文中評(píng)述，LZ-8 (FIP-glu)在大腸桿菌中的表達(dá)量約為36. 46mg/L，在煙草中的表達(dá)量約為 149μ g/g鮮葉片；李奇璋等在《西北植物學(xué)報(bào)》2010年第1期35-40頁(yè)發(fā)表了題為《紫芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的原核表達(dá)與功能分析》一文，文中評(píng)述，在大腸桿菌中表達(dá)的FlP-gsi約占大腸桿菌總蛋白的46. 1%。對(duì)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因進(jìn)行改造，提高FIP在原核生物中的表達(dá)，以及提高FIP 的生物學(xué)活性，是FIP應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的重要途徑之一。DNA改組技術(shù)是一種非常有效的分子水平的體外定向進(jìn)化技術(shù)。實(shí)際上是一種依賴(lài)于PCR的體外誘變技術(shù)，其過(guò)程是將單基因或相關(guān)基因家族的靶序列隨機(jī)性的片段化之后，根據(jù)這些小片段之間一定程度的同源性，通過(guò)PCR技術(shù)將其合成為嵌合基因，然后進(jìn)行高通量的篩選以期得到理想的突變體。與隨機(jī)突變、盒式突變以及同源重組相比，以DNA重組技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA改組技術(shù)能夠獲得更加多樣性的突變文庫(kù)及更高的適應(yīng)性。目前國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)有利用基因重組技術(shù)對(duì)靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行重組并獲得有效蛋白的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種靈芝屬內(nèi)重組的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因、該基因編碼的蛋白及其應(yīng)用。重組后的基因表達(dá)于大腸桿菌獲得目的蛋白，并且證明其仍然能具有很好的免疫調(diào)節(jié)活性，這對(duì)于FIP的大規(guī)模生產(chǎn)與作為藥物或其他健康產(chǎn)品的應(yīng)用提供了一種新的思路與探索途徑。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，該核苷酸序列，具有與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第1-333位的核苷酸序列有至少85%
的同源性；或能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第1-333位的核苷酸序列雜 、-父。所述的中度嚴(yán)謹(jǐn)條件是指核苷酸序列之間能在2XSSC(0.3M檸檬酸鈉，3M氯化鈉，ρΗ7· 0) mo.1% SDS 的條件下。本發(fā)明涉及一種重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。所述的靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白是指赤芝(G. Iucidium)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白和紫芝(G. sinense)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。本發(fā)明涉及上述重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在促血紅細(xì)胞凝集、誘導(dǎo)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄或表達(dá)中的應(yīng)用，包括用于促小鼠血紅細(xì)胞凝集以及用于誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)錄或表達(dá)細(xì)胞因子。本發(fā)明的重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因所編碼的重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量比同樣在大腸桿菌中表達(dá)的赤芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白和紫芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)量有所提高，提高到1 % 204%。并且重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因表達(dá)載體構(gòu)建容易，表達(dá)方法簡(jiǎn)單，只需添加少量IPTG即可實(shí)現(xiàn)大量穩(wěn)定的表達(dá)。表達(dá)蛋白的分離純化過(guò)程簡(jiǎn)單，制備得到的重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可以促小鼠血紅細(xì)胞凝集以及誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本發(fā)明具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明中所涉及的大腸桿菌M15已在《和生琦，丁國(guó)富，李斌，李軍，羅平，董燕，張蓉，顏偉，周紅；青霉素結(jié)合蛋白加C-末端在大腸桿菌M15中的表達(dá)、純化及鑒定，創(chuàng)傷外科雜志，2007，9(1) :28-31》中公開(kāi)；本發(fā)明中涉及的M15大腸桿菌菌株可通過(guò)公開(kāi)市售的商業(yè)渠道取得，如北京博邁德科技發(fā)展有限公司，公司地址北京市海淀區(qū)西四環(huán)中路甲59號(hào)。


圖1基因片段重組電泳圖。圖2菌落雜交篩選圖。圖3重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因序列比對(duì)圖。圖4重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白氨基酸序列比對(duì)圖。圖5重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白電泳圖。圖6重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白Western Blot檢測(cè)圖。圖7重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白血液凝集圖。圖8重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1、靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因重組1.片段合成根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，在不改變其蛋白質(zhì)序列的前提下，將赤芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因(FlP-glu)和紫芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因(FlP-gsi)重新編碼。將按照大腸桿菌偏愛(ài)密碼子重新編碼的FlP-glu和FlP-gsi基因按照其DNA順序分割成50 60bp長(zhǎng)短的片段，每相鄰的兩個(gè)片段之間有約18bp的核苷酸重疊(SEQ ID N0. 3至SEQ ID N0. 20)， 并且合成這些片段。2.無(wú)引物 PCR將如SEQ ID N0. 3至SEQ ID N0. 20所示的寡聚核苷酸等量混合。利用KOD plus 聚合酶(日本東洋紡)對(duì)混合的基因片段進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系中無(wú)引物。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性anin后，按照94°C，1 ；55°C,15s ；72°C,25s進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。用小量DNA膠回收試劑盒(Bio Basic Inc)分別純化PCR產(chǎn)物，得到產(chǎn)物I。3.有引物 PCRA.引物合成根據(jù)靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因核苷酸序列比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)并合成如下引物SN-F GGCTCTAGAGCCGAGCTCGCGGGATCCATGAGCGATACCGCGCTGATTTTTCG (下劃線為 BamH I
酶切位點(diǎn))SN-R CCGGAATTCCGGAACTGCAGAACCCCAAGCTTTTAGTTCCACTGCGCAATAATAAAATC (下劃線為 Hind III酶切位點(diǎn))
將SN-F與SN-R等體積混合，獲得引物SN。B.靈芝屬內(nèi)基因重組將實(shí)施例1. 2中獲得的產(chǎn)物I稀釋10倍做為模板，實(shí)施例1. 3中獲得的引物SN做為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性aiiin后，按照94°C，30s ；5530s ；72°C, 40s進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用小量DNA膠回收試劑盒(Bio Basic Inc)純化，獲得產(chǎn)物II，如圖1所示。實(shí)施例2、重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因表達(dá)載體的構(gòu)建及篩選將實(shí)施例1. 3中獲得的產(chǎn)物II經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III酶切過(guò)夜，并且與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶酶切的表達(dá)載體PQE-30連接。將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15宿主細(xì)胞，用含有l(wèi)OOmg/mL的羧芐西林鈉及50mg/mL的卡那霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子。提取克隆質(zhì)粒，即得到重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)載體。所得到的轉(zhuǎn)化子即為重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因重組文庫(kù)。將重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。待轉(zhuǎn)化子菌落生長(zhǎng)至直徑為Imm時(shí)，將菌落在PVDF膜上做印記。之后將膜移至含有l(wèi)OOmg/mL羧芐西林鈉、50mg/mL卡那霉素以及ImM IPTG的LB平板上，克隆面朝上，與印記后的平板同時(shí)在37°C下培養(yǎng)4 他。取出PVDF膜做Wfestern blot檢測(cè)。一抗使用真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白抗體，稀釋倍數(shù)為1 10，000;二抗選用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，稀釋倍數(shù)為1 10，000。顯色后，選擇在PVDF膜上顏色較深的點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的克隆(圖 2)。重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因轉(zhuǎn)化子篩選得到的克隆中含有的表達(dá)載體，即為重組載體PQE30-FIP-SN。將所選擇的克隆送上海桑尼生物工程有限公司測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明，重組載體PQE30-FIP-SN所編碼的重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列， 其開(kāi)放閱讀框(ORF)為序列表中SEQ IDN0. 1中從核苷酸第1_333位的核苷酸序列(圖3 所示為重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列與FlP-glu和FlP-gsi基因序列比對(duì)圖)，編碼氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0. 2所述的氨基酸序列(圖4所示為重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白氨基酸序列與FlP-glu和FlP-gsi氨基酸序列比對(duì)圖)。提取克隆質(zhì)粒，即得到重組表達(dá)載體PQE30-FIP-SN。實(shí)施例3、重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化1.重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot檢測(cè)將實(shí)施例2中獲得的單克隆接種于含有l(wèi)OOmg/mL的羧芐西林鈉及50mg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。次日以2%接種量接種于較大體積培養(yǎng)液。37°C繼續(xù)培養(yǎng)，至0D600達(dá)到0. 5 0. 7時(shí)，加入IPTG，使IPTG的終濃度達(dá)到ImM。 培養(yǎng)后，將所取得菌液樣品5，OOOrpm離心20min以收集菌體。去上清，菌體用IOOyL 2X SDS-PAGESample buffer (IOOmM pH 6. 8Tris-Cl,4% (ff/V) SDS,0. 2% (ff/V)BPB,20% (ff/V) glycerine, 2% (ff/V) β -ME)懸浮，并在95°C水浴鍋中保溫5min。之后再分別用兩塊 15% SDS-PAGE膠檢測(cè)。一塊用于考馬斯亮藍(lán)染色(圖5)，另一塊用于Western blot檢測(cè) (圖6)。圖5所示，為含有重組表達(dá)載體PQE30-FIP-SN的大腸桿菌M15細(xì)胞經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)電泳圖。箭頭所示即為重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。圖6為重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白Western Blot檢測(cè)。經(jīng)大腸桿菌發(fā)酵，重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)量提高到1 % 204%。2.重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的分離純化
將經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的菌液5，OOOrpm離心20min以收集細(xì)胞，用1/10體積的Lysis buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, IOmM imidazole, pH 8.0)懸?。粚⒒旌衔镏糜谝旱欣鋬?，之后再于冰水中融化；將融化后的樣品在冰水混合物中超聲波破碎，200 300W超聲6次，每次10s，期間間隔IOs ；超聲處理過(guò)的菌液于4°C下12，OOOrpm離心20 30min ； 取上清，使用Ni-NTA柱純化(預(yù)先用10倍柱體積的Lysis buffer平衡)；用20倍柱體積的 Wash buffer (50mMNaH2P04, 300mM NaCl,20mM imidazole, pH 8.0)洗柱；目的蛋白由 Elution buffer (50mMNaH2P04, 300mM NaCl,250mM imidazole, pH 8.0)洗脫出來(lái)。實(shí)施例4、重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白促小鼠血紅細(xì)胞凝集昆明小鼠心臟取血，1，200rpm離心5min,并用PBS洗滌3次，每次1，200rpm離心 5min收集血細(xì)胞，最后用PBS配制成1.5% (V/V)的血紅細(xì)胞溶液。在96孔U型板內(nèi)加入 100 μ Li. 5%的血細(xì)胞，并按照倍比稀釋法加入100 μ L重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白溶液，使重組蛋白的終濃度從0. 03 μ g/mL到50 μ g/mL。并以ConA蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS做為陰性對(duì)照，37°C培養(yǎng)。結(jié)果如圖7顯示重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白血液凝集實(shí)驗(yàn)。其中A表示重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白凝血反應(yīng)，B為陰性對(duì)照，C為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)施例5、重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)1.細(xì)胞培養(yǎng)取雄性昆明小白鼠0 8周齡)，采用頸部脫臼法處死，取出脾臟，在RPMI 1640 培養(yǎng)基中研磨至碎，過(guò)濾網(wǎng)Ooo目)，4°〇，1，500印111離心3 51^11;用紅細(xì)胞裂解液(碧云天公司)輕輕懸浮沉淀，4°C，1，500rpm離心3 5min ；RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌沉淀兩次， 40C，1，500rpm離心3 5min ；RPMI 1640培養(yǎng)基輕輕懸浮細(xì)胞，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定細(xì)胞濃度。用RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度稀釋至1 X IO7個(gè)/mL，分別加入重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白至濃度為0 μ g/mL、0. 5 μ g/mL、1 μ g/mL、2 μ g/mL、3 μ g/mL,于M孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)4h。2. RT-PCR 檢測(cè)A. RNA 提取采用柱離心式小量總RNA抽提試劑盒(華舜公司)，分別提取與不同濃度重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白共培養(yǎng)的小鼠脾細(xì)胞總RNA。B.引物設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的細(xì)胞因子核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成如下引物IL-2F :TTCAAGCTCCACTTCAAGCTCTACAGCGGAAGIL-2R :GACAGAAGGCTATCCATCTCCTCAGAAAGTCCIL-4F :ATGGGTCTCAACCCCCAGCTAGTIL-4R GCTCTTTAGGCTTTCCAGGAAGTCIFN- γ F TGAACGCTACACACTGCATCTTGG
IFN-yR CGACTCCTTTTCCGCTTCCTGAGTNF- α F :ATGAGCACAGAAAGCATGATCCGCTNF- α R CCAAAGTAGACCTGCCCGGACTCβ -actinF GTGGGCCGCTCTAGGCACCAAβ -actinR CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC
C. RT-PCR 反應(yīng)采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)，對(duì)重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)程序IL-2 :50°C 30min, RT 反應(yīng)；94°C 2min, RNase 失活；94°C變性 30s ；65°C退火 30s ； 72°C延伸40s，共25個(gè)循環(huán)。IL-4 :50°C 30min, RT 反應(yīng)；94°C 2min, RNase 失活；94°C變性 30s ；65°C退火 30s ； 72°C延伸40s，共30個(gè)循環(huán)。IFN-y :50°C 30min, RT 反應(yīng)；94°C 2min, RNase 失活；94°C 變性 30s ；60°C 退火 30s ；72°C延伸40s，共25個(gè)循環(huán)。TNF-α :50 °C 30min, RT 反應(yīng)；94°C 2min, RNase 失活；94°C 變性 30s ；60°C 退火 30s ；72°C延伸40s，共25個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖8所示為，重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子電泳圖。從圖中可以看出，重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α及IL-4。并且，重組蛋白的濃度與細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。說(shuō)明重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。
權(quán)利要求
1.一種重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示 ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，其特征是，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
3.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在促血紅細(xì)胞凝集、誘導(dǎo)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄或表達(dá)中的應(yīng)用，其特征在于，包括用于促小鼠血紅細(xì)胞凝集以及用于誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)錄或表達(dá)細(xì)胞因子。
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因、該基因編碼的蛋白及其應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明對(duì)靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因進(jìn)行重組，重組后的基因表達(dá)于大腸桿菌獲得目的蛋白，并且證明其仍然具有很好的免疫調(diào)節(jié)活性。這對(duì)于FIP的大規(guī)模生產(chǎn)與作為藥物或其他健康產(chǎn)品的應(yīng)用提供了一種新的思路與探索途徑。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102199201SQ20111006876
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者叢蔚然, 周選圍, 李奇璋, 王雪飛, 蘇愷琪 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)