專利名稱：一種結核桿菌融合蛋白HspX-Mtb8.4及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4和其制備方法，以及其在制備抗結核的候選疫苗中的應用。
背景技術：
結核病是長期危害人類健康的嚴重疾病之一。全世界仍有近1/3的人感染過結核分枝桿菌。大約有5%的結核感染者在2-5年內會發(fā)展為肺結核病人；其余的有可能會形成結核病的潛伏感染者。我國是結核病高負擔的國家之一，每年約有13萬人因結核病而死亡。目前，卡介苗BCG的接種是有效預防結核病的重要措施。然而，不同研究顯示，BCG在不同人群中的保護性不穩(wěn)定，尤其是對成人肺結核的保護效率介于0-80%不等。因此，研制和開發(fā)全面高效的抗結核疫苗是控制結核病的重要途徑?？晒┭芯康目菇Y核疫苗有亞單位疫苗，重組BCG，減毒的MTB活疫苗。而亞單位疫苗又包括蛋白疫苗，DNA疫苗和以病毒為載體的疫苗；其中的蛋白疫苗具有成分明確，使用安全等優(yōu)點，相對易于被人們接受。利用基因工程技術將具有優(yōu)勢的不同的單個結核保護性抗原進行重組，從而構建成融合蛋白。大量研究表明，與單個抗原相比，融合抗原的免疫原性會增強，顯示出更好的保護效果；因此受到國內外研究的重視。然而在以往的研究中，為了后期簡便的純化方法， 往往構建成帶有各種標簽(如His · Tag，GST · Tag，S· Tag等)形式的融合蛋白，卻未考慮這種融合蛋白所帶有的標簽是否會影響到動物實驗以及更進。

發(fā)明內容
基于以上的研究背景情況，本發(fā)明利用基因工程技術，克隆構建了無任何標簽的結核分枝桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4，并且進行了表達和純化，以期望成為抗結核的候選疫
田ο本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術中的缺陷，提供了一種結核桿菌融合蛋白 HspX-Mtb8. 4，是序列表中序列2的蛋白質。本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4的編碼基因。所述融合蛋白HspX_Mtb8. 4的編碼基因，是如下1)或2)的基因a)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；b)在嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子。含有上述融合蛋白HspX-MtbS. 4的編碼基因的重組表達載體，所述重組表達載體為PET30a質粒。 含有上述重組表達載體的宿主細胞，所述宿主細胞為大腸桿菌BL21。本發(fā)明的第三個目的是提供一種上述結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4的制備方法，其特征在于包括有以下步驟1)獲得上述結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4的編碼基因；
2)將步驟1)得到的結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4的編碼基因導入重組表達載體；3)將步驟2)載體導入宿主細胞；4)培養(yǎng)步驟3)得到的宿主細胞；5)將步驟4)得到的宿主細胞進行處理得到上述結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4 并純化和表達。所述編碼基因為序列1所示的核苷酸序列；所述重組表達載體為PET30a質粒；所述宿主細胞為大腸桿菌BL21。本發(fā)明的第四個目的是提供一種上述結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4在制備抗結核的候選疫苗中的應用。所述候選疫苗的制備方法是將結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4中加入DDA水溶液。所述DDA水溶液的制備方法為DDA用無菌蒸餾水配制成2. 5mg/ml，80°C水浴 10-20min，冷卻至室溫；將結核桿菌融合蛋白HspX_Mtb8. 4用PBS調至濃度0. 2mg/ml，并與 DDA水溶液按照體積比1 1混合。本發(fā)明的有益效果是結核桿菌Ag85B、ESAT-6、Mtb8. 4和HspX是最有可能對結核病起到保護作用的抗原。本發(fā)明選用的結核分枝桿菌Mtb8. 4是從結核桿菌培養(yǎng)濾液中純化分離的一種低分子治療蛋白抗原，具有較強的細胞免疫活性，能誘導CD4+Thl型細胞免疫反應和特異性CTL的產(chǎn)生，分泌高水平的IFN- γ。研究顯示，用Mtb8. 4加不完全弗氏佐劑免疫C57BL/6小鼠能誘導強烈的Thl型細胞反應和細胞毒性T細胞反應，對結核菌毒力株的攻擊起到有效的保護作用。HspX是一種相對分子質量為16000的熱休克蛋白，由基因hspX(rV2031c)表達，屬于結核菌休眠期調控子(DosR regulon)，研究表明HspX是結核分枝桿菌在靜止生長期或低氧狀態(tài)下產(chǎn)生的主要蛋白。有研究表明HspX在結核分枝桿菌感染后短時間內減緩其在體內生長速度方面可能起到某種關鍵作用。結核病患者及潛伏期感染者體內存在的針對HspX的特異性體液免疫和細胞免疫應答，均表明HspX是結核分枝桿菌潛伏感染期機體免疫反應的重要靶抗原。


圖1為初次誘導時目的蛋白表達情況(SDS-PAGE)。圖2為不同誘導條件下目的蛋白的表達情況。圖3為目的蛋白純化(SDS-PAGE)。
具體實施例方式構建一種新型去標簽融合蛋白HspX-MtbS. 4，并且進行了表達和純化，以期望成為抗結核的候選疫苗。引物應用引物設計軟件I^rimer Premier 5. 0自行設計引物，由大連寶生物生物工程公司合成，其中劃線部分為限制性內切酶的酶切位點序列。HM即HspX-MtbS. 4的簡寫。HM 中 Hspx 上游引物5，AAT CATATG GCCAC CACCC TTCCC GTTCA 3，(NdeI)；
4
HM 中 Hspx 下游引物5，GC GAGCTC GTTGG TGGAC CGGAT CTGAA 3，(SacI)；HM 中 Mtb8. 4 上游引物5，AT GAGCTC ATGAG GCTGT CGTTG ACC 3，(SacI)；HM 中 Mtb8. 4 下游引物5，ACCGG AAGCTT TTAAT AGTTG TTGCA GGA3，(HindIII)。以結核分枝桿菌H37Rv株基因組為模板，分別以Mtb8. 4和Hspx (含不同酶切位點)各自引物進行PCR擴增。PCR條件為Mtb8. 4基因:98°C 15s，63°C 15s，72°C 45s，30個循環(huán)；Hspx基因98°C 15s，66°C 15s，72°C lmin，30個循環(huán)。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒或膠回收純化試劑盒純化回收。PCR反應體系如表1所示。表 權利要求
1.一種結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4，是序列表中序列2的蛋白質。
2.權利要求1所述的結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS.4的編碼基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于所述融合蛋白HspX-MtbS.4的編碼基因，是如下1)或2)的基因a)其核苷酸序列是序列表中的序列1；b)在嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述融合蛋白HspX-MtbS.4的編碼基因的重組表達載體，所述重組表達載體為PET30a質粒。
5.含有權利要求4所述重組表達載體的宿主細胞，所述宿主細胞為大腸桿菌BL21。
6.一種如權利要求1所述的結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4的制備方法，其特征在于 包括有以下步驟1)獲得如權利要求2所述的結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS.4的編碼基因；2)將步驟1)得到的結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS.4的編碼基因導入重組表達載體；3)將步驟2、載體導入宿主細胞；4)培養(yǎng)步驟幻得到的宿主細胞；5)將步驟4)得到的宿主細胞進行處理得到如權利要求1所述的結核桿菌融合蛋白 HspX-Mtb8. 4并純化和表達。
7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于所述編碼基因為序列1所示的核苷酸序列；所述重組表達載體為PET30a質粒；所述宿主細胞為大腸桿菌BL21。
8.—種如權利要求1所述的結核桿菌融合蛋白HspX-MtbS. 4在制備抗結核的候選疫苗中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于所述候選疫苗的制備方法是將結核桿菌融合蛋白HspX_Mtb8. 4中加入DDA水溶液。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于所述DDA水溶液的制備方法為DDA用無菌蒸餾水配制成2. 5mg/ml，80°C水浴10-20min，冷卻至室溫；將結核桿菌融合蛋白 HspX-Mtb8. 4用PBS調至濃度0. 2mg/ml，并與DDA水溶液按照體積比1 1混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結核桿菌融合蛋白HspX-Mtb8.4，是序列表中序列2的蛋白質。本發(fā)明的有益效果是發(fā)明選用的結核分枝桿菌Mtb8.4是從結核桿菌培養(yǎng)濾液中純化分離的一種低分子治療蛋白抗原，具有較強的細胞免疫活性，能誘導CD4+Th1型細胞免疫反應和特異性CTL的產(chǎn)生，分泌高水平的IFN-γ。HspX是一種相對分子質量為16000的熱休克蛋白，HspX是結核分枝桿菌在靜止生長期或低氧狀態(tài)下產(chǎn)生的主要蛋白。結核病患者及潛伏期感染者體內存在的針對HspX的特異性體液免疫和細胞免疫應答，均表明HspX是結核分枝桿菌潛伏感染期機體免疫反應的重要靶抗原。
文檔編號C12N15/62GK102212138SQ20111006884
公開日2011年10月12日 申請日期2011年3月22日 優(yōu)先權日2011年3月22日
發(fā)明者劉萬波, 吳玉敏, 朱麗, 林孝發(fā), 王秉翔, 祝秉東, 胡麗娜, 譚繼英, 辛奇 申請人:蘭州大學