專利名稱：萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體及分泌型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體及分泌型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
萊茵衣藻是一種單細(xì)胞真核藻，屬于綠藻門等鞭毛綱團(tuán)藻目衣藻屬 {Chlamydomonas)。萊茵衣藻個(gè)體呈卵形、球形或橢圓形，前端略尖突，兩側(cè)有兩條等長(zhǎng)的鞭毛，可以自由游動(dòng)。一般球形類的衣藻個(gè)體的直徑為5-17mm，卵形類的長(zhǎng)為6_27mm，寬為27mm。萊茵衣藻既能光合自養(yǎng)生長(zhǎng)，又能依賴乙酸鹽異養(yǎng)生長(zhǎng)。生長(zhǎng)速度快，細(xì)胞數(shù)量倍增時(shí)間為5-6小時(shí)，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量遺傳后代進(jìn)行遺傳分析。目前，其基因組序列測(cè)序已完成，大大推進(jìn)了萊茵衣藻作為模式植物用于分子生物學(xué)的研究和基因工程的操作。萊茵衣藻的核基因組大小約為100Mb，線狀的線粒體基因組大小為15. 71Λ，環(huán)狀的葉綠體基因組大小為203. 81Λ，是目前少數(shù)的細(xì)胞核、葉綠體和線粒體三套基因組均能進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的植物。因此，受到國(guó)內(nèi)外廣大學(xué)者的關(guān)注。以萊茵衣藻作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源基因具有以下優(yōu)勢(shì)①萊茵衣藻生長(zhǎng)周期短、生長(zhǎng)迅速、光和效率高，有“綠色光和酵母”之稱，能解決底物成本高的問題。②作為真核生物，萊茵衣藻可以對(duì)真核蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后加工修飾，如糖基化修飾等。③萊茵衣藻遺傳背景清晰，已有較完備的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)可供利用；葉綠體基因組具有原核基因組的特點(diǎn)，使得萊茵衣藻既可表達(dá)真核基因，也可表達(dá)原核基因。④萊茵衣藻可以通過“光一生物反應(yīng)器”進(jìn)行密閉培養(yǎng)，避免了“基因漂流”對(duì)環(huán)境安全產(chǎn)生的潛在性危害，且能進(jìn)行集約化生產(chǎn)，所以是理想的轉(zhuǎn)基因植物受體。萊茵衣藻作為一種生物反應(yīng)器，已成功生產(chǎn)多種重組蛋白及抗體，生產(chǎn)的部分產(chǎn)品并已實(shí)現(xiàn)了商品化生產(chǎn)(張洪濤，艾山江 阿不都拉，徐田枚等.萊茵衣藻葉綠體生物反應(yīng)器研究進(jìn)展.生物技術(shù)通報(bào).2007; 2:27-31)。目前已有生物可降解性塑料聚-β-羥基丁酸(王潮崗，胡章立，胡煒等.PhbB基因在萊茵衣藻中的表達(dá)與分子檢測(cè).科學(xué)通報(bào).2004; 49(15) 1519-1522)、綠色熒光蛋白(mi JX, Hu ZL, Wang CG et al. Efficient expression of green fluorescent protein (GFP) mediated by a chimeric promoter in Chlamydomonas reinhardtii. Chin. J. Oceanol. Limnol. 2008 ； 26(3) J42-M7)等多種外源基因在衣藻細(xì)胞核中成功表達(dá)。在衣藻葉綠體中也成功表達(dá)了人腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL蛋白(楊宗岐，李鐵女，陳鳳等.人可溶性 TRAIL蛋白在衣藻葉綠體中的表達(dá).科學(xué)通報(bào).2006; 12(51) :1400-1405)、人白細(xì)胞介素 4 (趙雅坤，史賢明，張忠明.人白細(xì)胞介素4在衣藻葉綠體中的高效轉(zhuǎn)化及表達(dá).華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2006; 25 (2) :110-116)、丙肝病毒融合抗原基因NS 3-6 (張中林，山松，陳曦等.丙肝病毒融合抗原基因NS3- C定點(diǎn)整合入衣藻葉綠體基因組的研究，遺傳 HEREDITAS (Beijing). 1999; 21 (6) 1-6)等多種藥用蛋白。然而，利用衣藻生產(chǎn)得到的重組蛋白，主要是胞內(nèi)表達(dá)的蛋白，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎后再純化，繁瑣的純化操作程序，不僅降低重組蛋白的回收率，還使蛋白的構(gòu)象容易發(fā)生改變。即便是在目的蛋白加上序列標(biāo)簽，通過各種親和層析手段進(jìn)行純化，除了具有以上的缺點(diǎn)外，還需要去除序列標(biāo)簽，這對(duì)目的蛋白的分離純化以及應(yīng)用生產(chǎn)帶來極大的不便。此外，體外基因表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行外源基因表達(dá)，在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)時(shí)，一般會(huì)通過宿主細(xì)胞是否賦有新的抗性而進(jìn)行篩選。因此，這種抗性基因?qū)胨拗骷?xì)胞后，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗性蛋白。人類在進(jìn)食轉(zhuǎn)基因食品的同時(shí)，就會(huì)擔(dān)心這些抗性蛋白對(duì)人類的健康會(huì)產(chǎn)生不利的影響。利用信號(hào)肽構(gòu)建分泌型表達(dá)載體進(jìn)行外源基因的表達(dá)，則可以將目的蛋白分泌到細(xì)胞外，利于目的蛋白的分離純化，不需要擔(dān)心因食用轉(zhuǎn)基因抗性蛋白而對(duì)身體產(chǎn)生影響。但目前國(guó)內(nèi)市面上未有萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體出售，同時(shí)未見有萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因的構(gòu)建方法及應(yīng)用。因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體及分泌型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其中根據(jù)萊茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，使用信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，人工合成或擴(kuò)增預(yù)測(cè)的萊茵衣藻分泌型蛋白的信號(hào)肽基因序列，將信號(hào)肽基因序列插入到萊茵衣藻啟動(dòng)子序列和克隆位點(diǎn)之間，構(gòu)建萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體。所述的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其中，包括以下步驟
51、以堿性磷酸酶(PHOX)蛋白信號(hào)肽序列為來源，合成含有MeI限制性酶切位點(diǎn)和 Tsp^ I酶切位點(diǎn)的信號(hào)肽基因序列Sgl，Sgl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
52、將信號(hào)肽基因序列Sgl克隆到商用載體pUC57中，插入位點(diǎn)為I，得到含有Sgl 序列的載體PUCSgl ；
53、使用限制性內(nèi)切酶I消化質(zhì)粒pSPlM，將獲得的表達(dá)盒他CS .VWe RBCS2 與黽EcoR I消化的pH105載體連接，通過幻μ I酶切篩選正向連接的質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒命名為PH124 ；
54、使用限制性內(nèi)切酶MeI消化質(zhì)粒pUCSgl，回收，再用5 I酶切位點(diǎn)消化，切膠回收Sgl片段，插入經(jīng)Me I和/ ^ I消化的載體pH124，獲得pHSgl載體。所述的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其中，包括以下步驟
51、以PHOX蛋白信號(hào)肽序列為來源，合成含有MeI限制性酶切位點(diǎn)和Tsm I酶切位點(diǎn)的信號(hào)肽基因序列Sgl，在Sgl的基礎(chǔ)上，增加了妨_7 ll,Afe I,Age l、Mlu I,Pmac I限制性酶切位點(diǎn)，合成信號(hào)肽基因序列Sg2，Sg2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；
52、將信號(hào)肽基因序列Sg2克隆到商用載體pUC57中，插入位點(diǎn)為I，得到載體 pUCSg2 ；
53、使用限制性內(nèi)切酶MeI消化質(zhì)粒pUCSg2，回收，再用5 I酶切位點(diǎn)消化，切膠回收Sg2片段，將獲得的Sg2片段插入經(jīng)Me I和/ ^ I消化的pHIM載體中，獲得pHSg2 載體。
所述的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其中，包括以下步驟
51、以iie-assimilatingprotein 2信號(hào)肽序列為來源，合成上游含有船e I位點(diǎn)和下游含有多克隆位點(diǎn)勒“/ U^Pst l.Afe \,Age I,Mlu I,Pmac I限制性酶切位點(diǎn)的信號(hào)肽基因序列SgFe, SgFe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；
52、將信號(hào)肽基因序列SgFe克隆到商用載體pUC57中，插入位點(diǎn)為I，得到載體 pUCSgFe ；
53、使用限制性內(nèi)切酶MeI消化質(zhì)粒pUCSgFe，回收，再用Sma I酶切位點(diǎn)消化，切膠回收SgFe片段，將獲得的SgFe片段插入經(jīng)Me I和Prmc I消化的pHIM載體中，獲得 PHSgFe 載體。所述的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其中，包括以下步驟
51、以VAMP72-family的R-SNAREprotein信號(hào)肽序列為來源，合成上游含有船e I位點(diǎn)和下游含有多克隆位點(diǎn)勒“/ U,Pst I,Afe I.Age I,Mlu l.Pmac I限制性酶切位點(diǎn)的信號(hào)肽基因序列SgRS，SgRS的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示；
52、將信號(hào)肽基因序列SgRS克隆到商用載體pUC57中，插入位點(diǎn)為I，得到載體 pUCSgRS ；
53、使用限制性內(nèi)切酶MeI消化質(zhì)粒pUCSgRS，回收，再用Sma I酶切位點(diǎn)消化，切膠回收SgRS片段，將獲得的SgRS片段插入經(jīng)Me I和Prmc I消化的pHIM載體中，獲得 PHSgRS 載體。一種萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體，其中，含有以萊茵衣藻分泌型蛋白的信號(hào)肽來源合成的信號(hào)肽基因序列，信號(hào)肽基因序列位于構(gòu)建的載體中啟動(dòng)子序列和多克隆位點(diǎn)之間。所述的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體，其中，所述載體含有以PHOX蛋白信號(hào)肽來源的信號(hào)肽基因序列Sgl，位于構(gòu)建的載體中啟動(dòng)子序列和多克隆位點(diǎn)之間；所述Sgl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體，其中，所述載體含有Sg2信號(hào)肽基因序列；所述 Sg2信號(hào)肽基因序列是在Sgl基礎(chǔ)上增加了多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，Sg2的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3 所示。所述的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體，其中，所述載體含有以Fe-assimilating protein 2信號(hào)肽序列為來源的信號(hào)肽基因序列SgFe ；所述Sgi^e的核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示。所述的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體，其中，所述載體含有以R-SNARE protein信號(hào)肽序列為來源的信號(hào)肽基因序列SgRS ；所述SgRS的核苷酸序列如SEQ ID N0. 7所示。一種萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)，其中，包含有萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體；所述萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體是含有以萊茵衣藻分泌型蛋白的信號(hào)肽序列為來源合成的信號(hào)肽基因序列。所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)，其中，所述萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體含有以PHOX蛋白信號(hào)肽序列為來源合成的信號(hào)肽基因序列。所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)，其中，所述萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體含有以!^-assimilating protein 2的信號(hào)肽序列為來源合成的信號(hào)肽基因序列。
所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)，其中，所述萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體含有以R-SNARE protein的信號(hào)肽序列為來源合成的信號(hào)肽基因序列。一種萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，包括如下步驟
51、萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)萊茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，使用信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，然后人工合成或擴(kuò)增預(yù)測(cè)得到的信號(hào)肽基因序列，將信號(hào)肽基因序列插入到萊茵衣藻啟動(dòng)子序列和克隆位點(diǎn)之間，構(gòu)建萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體；
52、轉(zhuǎn)基因受體藻株的選擇與培養(yǎng)；
53、外源基因分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建將外源基因插入所述萊茵衣藻分泌型載體中，構(gòu)建含有外源基因的外源基因分泌型表達(dá)載體；
54、外源基因分泌型表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化；
55、分泌型轉(zhuǎn)基因衣藻的篩選。所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述信號(hào)肽基因序列是以PHOX蛋白信號(hào)肽序列為來源合成的信號(hào)肽基因序列。所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述信號(hào)肽基因序列是以!^-assimilating protein 2的信號(hào)肽序列為來源合成的信號(hào)肽基因序列。所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述信號(hào)肽基因序列是以R-SNARE protein的信號(hào)肽序列為來源合成的信號(hào)肽基因序列。所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，步驟S2中所述的轉(zhuǎn)基因受體藻株為萊茵衣藻的不同品系。所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，步驟S4中所述的遺傳轉(zhuǎn)化是采用珠磨法、基因槍法或電轉(zhuǎn)化法。所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，步驟S5中所述的分泌型轉(zhuǎn)基因衣藻的篩選包括以下步驟
通過抗性平板篩選或者營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選，對(duì)經(jīng)過初步篩選獲得的轉(zhuǎn)基因衣藻進(jìn)行分子檢測(cè)，確定能分泌表達(dá)外源基因。有益效果本發(fā)明所提供的一種萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體及分泌型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，利用信號(hào)肽基因序列構(gòu)建分泌型表達(dá)載體，通過萊茵衣藻遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)行外源基因在萊茵衣藻的表達(dá)，可以將目的蛋白分泌到細(xì)胞外，利于目的蛋白的分離純化，提高目的蛋白的回收率，且不需要擔(dān)心因食用轉(zhuǎn)基因抗性蛋白而對(duì)身體產(chǎn)生影響。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中含信號(hào)肽分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體pHsgl構(gòu)建示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中含信號(hào)肽分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體pHsg2構(gòu)建示意圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中含信號(hào)肽5 / 分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體PHSgFe構(gòu)建示意圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中含信號(hào)肽餘7 ^分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體pHSgRS構(gòu)建示意圖。
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圖5為本發(fā)明實(shí)施例5中外源基因基因的分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體 pHSg2ckkn構(gòu)建示意圖。圖6為本發(fā)明實(shí)施例8中SG轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的基因組DNA-PCR電泳圖。圖7為本發(fā)明實(shí)施例8中SG轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的RT-PCR電泳圖。圖8為本發(fā)明實(shí)施例8中SG轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的western雜交分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體及分泌型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明利用來源于萊茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，通過信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)其信號(hào)肽，對(duì)預(yù)測(cè)獲得的信號(hào)肽進(jìn)行人工合成信號(hào)肽基因序列，并將其插入到萊茵衣藻表達(dá)載體的啟動(dòng)子和克隆位點(diǎn)之間，構(gòu)建了萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體。同時(shí)，通過萊茵衣藻遺傳方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。實(shí)施例中利用外源基因ckkn檢測(cè)構(gòu)建的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的表達(dá)效率。本發(fā)明實(shí)施例中所提供的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體，是以堿性磷酸酶(PHOX)蛋白的信號(hào)肽序列為來源構(gòu)建的表達(dá)載體，所述以PHOX蛋白的信號(hào)肽序列為來源的信號(hào)肽基因序列在構(gòu)建的載體中位于啟動(dòng)子序列和多克隆位點(diǎn)序列之間。所述信號(hào)肽基因序列和多克隆位點(diǎn)序列可具有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。含有SEQ ID NO. 1的信號(hào)肽基因序列和克隆位點(diǎn)序列的分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體可具有SEQ ID NO. 2的核苷酸序列，其物理圖譜如圖1所示，命名為pHSgl。所述信號(hào)肽序列和多克隆位點(diǎn)序列還可具有SEQ ID NO. 3的核苷酸序列。含有SEQ ID NO. 3的信號(hào)肽基因序列和多克隆位點(diǎn)序列的分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體可具有SEQ ID N0. 4的核苷酸序列，其物理圖譜如圖2所示，命名為pHSg2。本發(fā)明實(shí)施例中還提供的一種萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體，是以Fe-assimilating protein 2的信號(hào)肽序列為來源構(gòu)建表達(dá)載體，所述以!^-assimilating protein 2的信號(hào)肽序列為來源的信號(hào)肽基因序列在構(gòu)建的載體中位于啟動(dòng)子序列和多克隆位點(diǎn)序列之間。所述信號(hào)肽基因序列和多克隆位點(diǎn)序列還可具有SEQ ID N0. 5的核苷酸序列。含有SEQ ID N0. 5的信號(hào)肽基因序列和多克隆位點(diǎn)序列的分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體可具有SEQ ID N0. 6的核苷酸序列，其物理圖譜如圖3所示，命名為pHSgFe。本發(fā)明實(shí)施例中還提供的一種萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體，是以R-SNARE protein 的信號(hào)肽序列為來源構(gòu)建表達(dá)載體，所述以R-SNARE protein的信號(hào)肽序列為來源的信號(hào)肽基因序列在構(gòu)建的載體中位于啟動(dòng)子序列和多克隆位點(diǎn)序列之間。所述信號(hào)肽基因序列和多克隆位點(diǎn)序列還可具有SEQ ID N0. 7的核苷酸序列。含有SEQ ID N0. 7的信號(hào)肽基因序列和多克隆位點(diǎn)序列的分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體可具有SEQ ID N0. 8的核苷酸序列，其物理圖譜如圖4所示，命名為pHSgRS。本發(fā)明萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)中的分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體，可引導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白到細(xì)胞外；多克隆位點(diǎn)豐富；不含有任何序列標(biāo)簽。本發(fā)明萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法包括以下步驟1、根據(jù)萊茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，使用信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，人工合成或擴(kuò)增預(yù)測(cè)的信號(hào)肽基因序列，將信號(hào)肽基因序列插入到萊茵衣藻啟動(dòng)子序列和克隆位點(diǎn)之間，構(gòu)建萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體。2、將信號(hào)肽基因序列插入到萊茵衣藻啟動(dòng)子序列和克隆位點(diǎn)之間，構(gòu)建萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體。3、將外源基因插入上述載體中，構(gòu)建含有外源基因的分泌型表達(dá)載體。4、轉(zhuǎn)基因受體藻株的選擇和培養(yǎng)
進(jìn)行萊茵衣藻外源基因分泌表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化，可選擇萊茵衣藻的不同品系進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)基因受體藻株篩選標(biāo)記選擇中，以上不同的遺傳轉(zhuǎn)化方法均可選擇營(yíng)養(yǎng)缺陷型藻株或抗生素篩選標(biāo)記。萊茵衣藻的培養(yǎng)將純化的萊茵衣藻單藻落從固體TAP平板中，接種于TAP液體培養(yǎng)基中，在連續(xù)光照條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。4、外源基因分泌型表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化
萊茵衣藻遺傳轉(zhuǎn)化方法可以選擇珠磨法、基因槍法、電轉(zhuǎn)化法等。在本發(fā)明的實(shí)施案例中，使用珠磨法將帶有cMs基因的分泌型表達(dá)載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣藻(購(gòu)自美國(guó)Duck大學(xué)衣藻遺傳中心)受體藻株中。5、轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的篩選
經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因藻株可以在含有篩選抗生素的TAP培養(yǎng)基平板進(jìn)行培養(yǎng)和篩選，經(jīng)過初步篩選獲得的轉(zhuǎn)基因衣藻進(jìn)行如下的分子檢測(cè)基因組DNA的PCR檢測(cè)、 RT-PCR檢測(cè)、Western雜交檢測(cè)等。本發(fā)明萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)是適用于萊茵衣藻不同細(xì)胞系作為宿主， 實(shí)施例選擇的是細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣藻cc-503作為宿主。采用Tris-acetate-phosphate (TAP)培養(yǎng)基，在光照廣90 μ E/m2 · s)通氣或密閉條件下培養(yǎng)。實(shí)施例1 本發(fā)明表達(dá)載體pHsgl的構(gòu)建
根據(jù)已知的萊茵衣藻PHOX蛋白氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)XP_001703098. 1)，利用信號(hào)肽分析軟件SignalP V3. 0，預(yù)測(cè)得到能引導(dǎo)合成蛋白質(zhì)從細(xì)胞核分泌到細(xì)胞外的信號(hào)肽。根據(jù)預(yù)測(cè)信號(hào)肽的核苷酸序列，在上游添加Me I限制性酶切位點(diǎn)，下游進(jìn)行核苷酸序列點(diǎn)突變以形成T^7E I酶切位點(diǎn)，送上海生物工程有限公司通過人工合成的方法進(jìn)行合成，核苷酸序列命名為缺八信號(hào)肽基因缺7合成后克隆到商用載體pUC57中，插入位點(diǎn)為 Sma I，構(gòu)建后含有該序列的載體命名為pUCSgl。5W信號(hào)肽基因序列如SEQ ID NO. 1所示。萊茵衣藻表達(dá)載體 pH105 (Jinxia ffu, Zhangli Hu, Wang Chaogang et al. Efficient expression of green fluorescent protein (GFP) mediated by a chimeric promoter in Chlamydomonas reinhardtii. Chin. J. Oceanol. Limnol. 2008 (26): 242-247.)克隆有 HSP70A-RBCS2 啟動(dòng)子序列(HSP70A-RBCS2 promoter)和 RBCS2 終止子序列(RBCS2 terminater)，中間攜帶有/^ac I ,Nhe I ,Xba I和5 / I等多克隆酶切位點(diǎn)，可以插入外源基因并在衣藻核基因組中表達(dá)。載體pSPlM (Lambreras v, Stevens DR, Purton S. Efficient foreign gene expression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron. Plant J. 1998; 14(4) :441—447)含有表達(dá)盒 RBCS2 ble RBCS2,可使轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞獲得腐草霉素和komycin抗性，在本發(fā)明中作為衣藻轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記。使用限制性內(nèi)切酶EcoR I消化質(zhì)粒pSP124，將獲得的表達(dá)盒 RBCS2 ble RBCS2與黽EcoR I消化的pH105載體連接，通過命I酶切篩選正向連接的質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒命名為PH124。使用限制性內(nèi)切酶船e I消化質(zhì)粒pUCSgl，用TaKaRa Fragment Purification Kit試劑盒回收，再用I酶切位點(diǎn)消化，切膠回收Sgl片段(lllbp)，插入經(jīng)Me I和 Pmac I消化的載體pH124，獲得pHSgl載體(圖1)，其含有SEQ ID NO. 1序列的部分(包含商業(yè)載體pBluscript從fee I到幻7/ I的多克隆接頭)基因序列如SEQ ID NO. 2所示。實(shí)施例2 本發(fā)明表達(dá)載體pHsg2的構(gòu)建
為了便于目的基因與分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體的連接，在信號(hào)肽基因Sgl的基礎(chǔ)上， 增加了勒·7 U, Afe I, Age Y、Mlu I, Pmac I限制性酶切位點(diǎn)，送上海生物工程有限公司通過人工合成的方法進(jìn)行合成，核苷酸序列命名為餘么信號(hào)肽合成后克隆到商用載體 PUC57中，插入位點(diǎn)為I，構(gòu)建后含有該序列的載體命名為pUCSg2。信號(hào)肽基因序列如SEQ ID NO. 3所示。使用限制性內(nèi)切酶船e I消化質(zhì)粒pUCSg2，用TaKaRa Fragment Purification Kit試劑盒回收，再用I酶切位點(diǎn)消化，切膠回收Sg2片段(144bp)，插入經(jīng)Me I和 Pmac I消化的pH124載體，獲得pHSg2載體(圖2)，其含有SEQ ID N0. 3序列的部分(包含商業(yè)載體PBluscript從fee I到幻7/ I的多克隆接頭)基因序列如SEQ ID N0. 4所示。實(shí)施案例3 本發(fā)明表達(dá)載體pHSgFe-Ι的構(gòu)建
根據(jù)已知的萊茵衣藻Fe-assimilating protein 2氨基酸序列(GenBank登錄號(hào) ABB04462. 1)，利用信號(hào)肽分析軟件SignalP V3. 0，預(yù)測(cè)得到能引導(dǎo)合成蛋白質(zhì)從細(xì)胞核分泌到細(xì)胞外的信號(hào)肽。根據(jù)預(yù)測(cè)信號(hào)肽的核苷酸序列，在上游添加Me I限制性酶切位點(diǎn)， 下游添加勒UM l.Afe I,Age I,Mlu l.Pmac I限制性酶切位點(diǎn)，送上海生物工程有限公司通過人工合成的方法進(jìn)行合成，核苷酸序列命名為SgFe，信號(hào)肽基因SgFe合成后克隆到商用載體PUC57中，插入位點(diǎn)為Sma I，構(gòu)建后含有該序列的載體命名為pUCSgFe。SgFe 信號(hào)肽基因序列如SEQ ID N0. 5所示。
使用限制性內(nèi)切酶船e I消化質(zhì)粒pUCSgFe，用TaKaRa Fragment Purification Kit 試劑盒回收，再用Sma I酶切位點(diǎn)消化，切膠回收SgFe片段(117bp)，插入經(jīng)Me I稱Pimc I消化的PH124載體，獲得pHSgFe載體(圖3)，其含有SEQ ID N0. 5序列的部分(包含商業(yè)載體pBluscript從fee I到幻7/ I的多克隆接頭)基因序列如SEQ ID N0. 6所示。實(shí)施案例4 本發(fā)明表達(dá)載體pHSgRS的構(gòu)建
根據(jù)已知的萊茵衣藻R-SNARE protein氨基酸序列(GenBank登錄號(hào) XP_001692216. 1 )，利用信號(hào)肽分析軟件SignalP V3. 0，預(yù)測(cè)得到能引導(dǎo)合成蛋白質(zhì)從細(xì)胞核分泌到細(xì)胞外的信號(hào)肽。根據(jù)預(yù)測(cè)信號(hào)肽的核苷酸序列，在上游添加Me I限制性酶切位點(diǎn)，下游添加勒U,Pst l.Afe \,Age I,Mlu I,Pmac I限制性酶切位點(diǎn)，送上海生物工程有限公司通過人工合成的方法進(jìn)行合成，核苷酸序列命名為SgRS，信號(hào)肽基因SgRS合成后克隆到商用載體PUC57中，插入位點(diǎn)為/，構(gòu)建后含有該序列的載體命名為pUCSgRS。 SgRS信號(hào)肽基因序列如SEQ ID N0. 7所示。
使用限制性內(nèi)切酶船e I消化質(zhì)粒pUCSgRS，用TaKaRa Fragment Purification Kit試劑盒回收，再用Sim I酶切位點(diǎn)消化，切膠回收SgRS片段(104bp)，插入經(jīng)Me I和/^ac I消化的PH124載體，獲得pHSgRS載體(圖4)，其含有SEQ ID NO. 7序列的部分(包含商業(yè)載體pBluscript從fee I到幻7/7 I的多克隆接頭)基因序列如SEQ ID NO. 8所示。 實(shí)施例5 人組織激肽釋放酶基因分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體pHSg2Ckkn的構(gòu)建質(zhì)粒pckknl8 (由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建獲得，詳見專利申請(qǐng)?zhí)?200810066705. 8)含有人組織
激肽釋放酶基因(cMs基因)，其表達(dá)產(chǎn)物為人組織激肽釋放酶(hKl蛋白)。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增 CMT 基因，上游引入酶切位點(diǎn)勒·/ II，下游引入酶切位點(diǎn)/iBac I。將獲得的cM/ 基因與 IBgl II和Zfe^ I消化的pHSg2載體連接，獲得人組織激肽釋放酶基因分泌型萊茵衣藻表達(dá)載體，命名為pHSg2ckkn，其構(gòu)建示意圖如圖5所示。實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因受體藻株的選擇與培養(yǎng)
選擇細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣嫩Chlamydomonas reinhardtii, cc-503, 購(gòu)自美國(guó) Duck大學(xué)衣藻遺傳中心)作為轉(zhuǎn)基因的受體藻株。使用TAP培養(yǎng)基作為萊茵衣藻的培養(yǎng)基，其配方及成分如下所示2. 42g Tris, 25mL 4XBeijerinck salts (16g NH4Cl, 2g CaCl2 ·2Η20，4g MgSO4 ·7 H2O 溶于水中，定容至 1L)，ImL IM(K)PO4, ImL Trace 微量元素混合液(11. 4g H3BO3, 5. 6g MnCl2 ·4 H2O, 22g ZnSO4 · 7 H2O, 4. 99g FeSO4 · 7 H2O, 1. 61g CoCl2 · 6 H2O, 1. 57g CuSO4 · 5 H2O, 1. Ig (NH4)6Mo7O24 · 4 H2O, 50g Na2EDTA,溶于水中， 20% KOH調(diào)pH6. 5-6. 8，定容至1L)，溶解到975mL水中，使用冰醋酸調(diào)pH6. 95-7. 05，定容至IL0萊茵衣藻的培養(yǎng)條件在22-25°C，90yE/m2/s光照條件下連續(xù)培養(yǎng)，藻細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期濃度為l-2X106cells/mL。實(shí)施例7 萊茵衣藻的遺傳轉(zhuǎn)化
在本發(fā)明實(shí)施例中，萊茵衣藻的遺傳轉(zhuǎn)化方法為珠磨法。具體方法如下 采用 QIAGEN Plasmid Purification Kit 提取重組質(zhì)粒 pHSg2ckkn。萊茵衣藻 cc-503 采用“珠磨法”進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。具體步驟如下(1)將萊茵衣藻在連續(xù)光照和TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞數(shù)約為廣2X106cells/ml。5000rmp室溫離心5min，收集藻細(xì)胞；棄上清；(2)用滅過菌的新鮮TAP培養(yǎng)液重懸藻細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度至2X108cells/ml ;(3) 吸取270 μ 1藻細(xì)胞懸浮液到1. 5ml EP管里(里面有滅過菌的合金錫珠)，加入1 μ g酶切成線狀的pHSg2ckkn以及30 μ 1 50% PEG6000到EP管中；同時(shí)建立一個(gè)不添加PEG6000的樣品組；此外，還建立一個(gè)不添加DNA的對(duì)照組；(4)把衣藻細(xì)胞/合金錫珠/外源DNA混合物在振蕩器上以最高速振蕩25s ； (5)把混合液轉(zhuǎn)移到含有IOml新鮮TAP培養(yǎng)基的離心管中，在IOOrpm搖床弱光下過夜培養(yǎng)(22°C)，使細(xì)胞恢復(fù)；(6) 3000rmp室溫離心5min，收集細(xì)胞，棄上清；用500 μ 1新鮮TAP培養(yǎng)液小心重懸細(xì)胞，加入3. 5ml 0. 5 % TAP培養(yǎng)基， 混勻后倒在含有10μ g/ml的Zeomycin TAP固體平板上，置于22°C光照培養(yǎng)箱里倒置培養(yǎng)約3周，待平板上長(zhǎng)出綠色的單克隆，單克隆轉(zhuǎn)基因藻命名為SG0實(shí)施例8 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的篩選與鑒定
SG轉(zhuǎn)基因衣藻由于整合入力h基因(獲得Zeomycin抗性)，經(jīng)過抗生素平板初步篩選獲得的轉(zhuǎn)化子，可在含有l(wèi)Oug/ml的Zeomycin抗性平板上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。初步篩選獲得的SG轉(zhuǎn)基因衣藻進(jìn)行如下的分子檢測(cè)基因組DNA的PCR檢測(cè)、 RT-PCR檢測(cè)、Western雜交。具體步驟如下所示(1)轉(zhuǎn)基因衣藻總DNA的提取及PCR檢測(cè)
將萊茵衣藻cc-503和獲得的轉(zhuǎn)基因衣藻SG接種于新鮮的TAP培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在光照條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期，使用 TAKARA Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3. O 試劑盒分別提取其總DNA。以提取得到的萊茵衣藻cc-503和轉(zhuǎn)基因衣藻基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。根據(jù)CM"/ 基因序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增CM"/ 目的條帶。PCR 引物
Prckknl: 5’ - GCTAGCAGTTCCTCCACC -3， Prckkn2 5’ - AGGTGGAGGAACTGCTAGC-3’ PCR 程序940C，Imin ；60°C，Imin ；72°C，Imin ；30 個(gè)循環(huán)。電泳結(jié)果如圖6所示共有6條泳道，其中M示DL 2000 marker ； 1示陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)基因衣藻cc-503基因組PCR產(chǎn)物);2-4示轉(zhuǎn)基因衣藻SG基因組PCR產(chǎn)物；5示陰性對(duì)照 (H2O的PCR產(chǎn)物)。從圖4中可見，可擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)結(jié)果一致的目的條帶。電泳結(jié)果表明， ckkn基因已整合入萊茵衣藻細(xì)胞核基因組中。(2)轉(zhuǎn)基因衣藻總RNA的提取及RT-PCR檢測(cè)
萊茵衣藻cc-503和轉(zhuǎn)基因衣藻SG在光照條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期，進(jìn)行熱激誘導(dǎo)。 40°C光照下培養(yǎng)20min后，置于22°C光照培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)90min。采用RNAfast200-總 RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)提取其總RNA。以提取的萊茵衣藻cc-503和轉(zhuǎn)基因衣藻RNA作為模板，采用RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 (TaKaRa 公司)進(jìn)行 RT-PCR。使用 Oligo dT-Adaptor primer 進(jìn)行 cDNA 第一鏈的合成(50°C，30min ；99°C,5min ；5°C，5min ；)。分別以反轉(zhuǎn)錄的萊茵衣藻cc-503和轉(zhuǎn)基因衣藻cDNA作為模板，使用ckkn基因的特異性引物進(jìn)行cDNA第二鏈的合成和目的片段的 PCR擴(kuò)增。RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖7所示，共6條泳道，其中M示DL 2000 marker ;1示陰性對(duì)照(H2O的PCR產(chǎn)物)；2-4示轉(zhuǎn)基因衣藻SG的RT-PCR產(chǎn)物；5示陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)基因衣藻 cc-503的RT-PCR產(chǎn)物)；從圖5中可見，轉(zhuǎn)基因衣藻SG總RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，可擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)結(jié)果一致的目的條帶。電泳結(jié)果表明CM"/ 基因在萊茵衣藻中具有轉(zhuǎn)錄活性。( 3 )轉(zhuǎn)基因衣藻外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
由于HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子為熱激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，通過熱激誘導(dǎo)可以提高外源蛋白的表達(dá)量。將萊茵衣藻cc-503和轉(zhuǎn)基因衣藻SG培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，并進(jìn)行熱激誘導(dǎo)。先置于40°C培養(yǎng)箱下，光照熱激誘導(dǎo)30min，然后放回22°C光照培養(yǎng)箱中，光照培養(yǎng)5h ；光照完畢后再次置于40°C培養(yǎng)箱下，進(jìn)行第二次熱激誘導(dǎo)30min，再放回22°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ih0離心收集培養(yǎng)上清液，上清液使用0. 22 μ m針頭式無(wú)菌濾膜進(jìn)行過濾藻細(xì)胞后， 再用超濾離心管進(jìn)行超濾濃縮分泌到培養(yǎng)上清液的蛋白。(4)轉(zhuǎn)基因衣藻的Western分析
將濃縮的未轉(zhuǎn)基因衣藻和轉(zhuǎn)基因衣藻培養(yǎng)上清液蛋白，行12% SDS-PAGE電泳分離，使用KLKl單克隆抗體(Sigma公司)作為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(KPL公司)作為二抗，進(jìn)行免疫印記，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因衣藻中目的蛋白hKl的表達(dá)。具體方法參照Sigma公司的 Western印記方法。Western雜交結(jié)果如圖8所示，共7條泳道，其中M示DL 2000 marker ；1-3示轉(zhuǎn)基因衣藻SG培養(yǎng)上清液總蛋白；4示陰性對(duì)照(非分泌型轉(zhuǎn)基因衣藻培養(yǎng)上清液總蛋白);5示陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)基因衣藻cc-503培養(yǎng)上清液總蛋白)。與對(duì)照組(cc-503)相比， 轉(zhuǎn)基因衣藻SG在55kD附近有一雜交信號(hào)帶，推測(cè)表達(dá)的蛋白即為hKl。
實(shí)驗(yàn)證明，在利用本發(fā)明的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白hKl (人組織激肽釋放酶)的過程中，信號(hào)肽能引導(dǎo)目的蛋白hKl分泌到細(xì)胞外，并具有生物學(xué)活性。 本發(fā)明的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)可使轉(zhuǎn)基因受體藻株高效分泌表達(dá)外源蛋白。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于根據(jù)萊茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，使用信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，人工合成或擴(kuò)增預(yù)測(cè)的萊茵衣藻分泌型蛋白的信號(hào)肽基因序列，將信號(hào)肽基因序列插入到萊茵衣藻啟動(dòng)子序列和克隆位點(diǎn)之間，構(gòu)建萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟51、以萊茵衣藻分泌型蛋白信號(hào)肽序列為來源，合成上游含有MeI限制性酶切位點(diǎn)的信號(hào)肽基因序列；52、將步驟Sl中合成的信號(hào)肽基因序列克隆到商用載體pUC57中，插入位點(diǎn)為5 I， 得到含有信號(hào)肽基因序列的載體；53、使用限制性內(nèi)切酶I消化質(zhì)粒pSPlM，將獲得的表達(dá)盒他CS .VWe RBCS2 與黽EcoR I消化的pH105載體連接，通過幻μ I酶切篩選正向連接的質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒命名為PH124 ；54、使用限制性內(nèi)切酶MeI消化含有信號(hào)肽基因序列的載體，回收，再用I酶切位點(diǎn)消化，切膠回收含有信號(hào)肽基因序列的片段，插入經(jīng)Me I和/ ^ I消化的載體 PH124，獲得萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟Sl 中所述萊茵衣藻分泌型蛋白的信號(hào)肽是PHOX蛋白的信號(hào)肽或!^-assimilating protein 2的信號(hào)肽或VAMP72-family的R-SNARE protein的信號(hào)肽。
4.一種萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體，其特征在于，含有以萊茵衣藻分泌型蛋白的信號(hào)肽來源合成的信號(hào)肽基因序列，信號(hào)肽基因序列位于構(gòu)建的載體中啟動(dòng)子序列和多克隆位點(diǎn)之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體，其特征在于，所述萊茵衣藻分泌型蛋白的信號(hào)肽是PHOX蛋白的信號(hào)肽或!^-assimilating protein 2的信號(hào)肽或 VAMP72-family 的 R-SNARE protein 的信號(hào)月太。
6.一種萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟51、萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)萊茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，使用信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，然后人工合成或擴(kuò)增預(yù)測(cè)得到的信號(hào)肽基因序列，將信號(hào)肽基因序列插入到萊茵衣藻啟動(dòng)子序列和克隆位點(diǎn)之間，構(gòu)建萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體；52、轉(zhuǎn)基因受體藻株的選擇與培養(yǎng)；53、外源基因分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建將外源基因插入所述萊茵衣藻分泌型載體中，構(gòu)建含有外源基因的外源基因分泌型表達(dá)載體；54、外源基因分泌型表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化；55、分泌型轉(zhuǎn)基因衣藻的篩選。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于， 步驟Sl中所述的萊茵衣藻分泌型蛋白的信號(hào)肽是PHOX蛋白的信號(hào)肽或!^-assimilating protein 2 的信號(hào)肽或 VAMP72_family 的 R-SNARE protein 的信號(hào)肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于， 步驟S2中所述的轉(zhuǎn)基因受體藻株為萊茵衣藻的不同品系。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于， 步驟S4中所述的遺傳轉(zhuǎn)化是采用珠磨法、基因槍法或電轉(zhuǎn)化法。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的萊茵衣藻分泌表達(dá)外源基因系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于， 步驟S5中所述的分泌型轉(zhuǎn)基因衣藻的篩選包括以下步驟通過抗性平板篩選或者營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選，對(duì)經(jīng)過初步篩選獲得的轉(zhuǎn)基因衣藻進(jìn)行分子檢測(cè)，確定能分泌表達(dá)外源基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體及分泌型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，本發(fā)明利用來源于萊茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，通過信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)其信號(hào)肽基因序列，對(duì)預(yù)測(cè)獲得的信號(hào)肽基因進(jìn)行人工合成，并將其插入到萊茵衣藻表達(dá)載體的啟動(dòng)子和克隆位點(diǎn)之間，構(gòu)建了萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體。同時(shí)，利用外源基因檢測(cè)構(gòu)建的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體的表達(dá)效率，將含有外源基因的萊茵衣藻分泌型表達(dá)載體，通過萊茵衣藻遺傳轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化到萊茵衣藻，經(jīng)過篩選，獲得能分泌表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因工程藻株。本發(fā)明為利用萊茵衣藻作為生物反應(yīng)器分泌表達(dá)外源基因奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/79GK102181471SQ20111007078
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者吳錦霞, 胡章立, 陳俊 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)