專利名稱：一種小麥早熟相關(guān)蛋白TaMAPK1及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種小麥早熟相關(guān)蛋白TaMAPKl 及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
促分裂素原活化蛋白激酶家族在所有真核生物信號傳導(dǎo)路徑中起重要作用。當(dāng)受到來自細胞外的環(huán)境刺激時，MAPKKK通過絲氨酸-蘇氨酸位點的磷酸化激活MAPKK，進而 MAPKK使MAPK蛋白活性loop中T-χ-Υ基序的絲氨酸和酪氨酸位點磷酸化，有活性的MAPK 進而使下游其他蛋白激酶、代謝酶類、轉(zhuǎn)錄因子和細胞骨架成分行使不同的細胞功能。擬南芥基因組存在至少60個ΜΑΡΚΚΚ，10個MAPKK和20個ΜΑΡΚ，但是目前這些激酶的功能及其參與的信號途徑大部分還不清楚。Ichimura等將植物ΜΑΗ(蛋白家族分成 A D四類，Α、B、C三類MAPK蛋白的loop環(huán)具有TEY基序，而D類蛋白激酶的loop環(huán)具有TDY基序，同時，D類MAPK的C端缺乏由一簇帶負電氨基酸殘基構(gòu)成的決定互作蛋白特異性的錨定結(jié)構(gòu)域(CD domain) 0植物的MAI3K級聯(lián)在對環(huán)境和非環(huán)境脅迫，植物自身生長發(fā)育、細胞死亡中起著重要的作用。現(xiàn)將擬南芥各類MAH(蛋白的功能描述如下。擬南芥A 類MAI3K包括AtMAH^JtMAraejtMAPKlO，在功能上，AtMAH^JtMAI3Ke存在功能冗余。例如，AtMAPK3/6參與乙烯、植物抗毒素camalexin合成；在花藥發(fā)育過程中AtMAPK3/6促進細胞分裂；AtMAPK3/6參與植物對臭氧的超敏反應(yīng)。AtMAPKlO的表達量很少，推測其可能是無功能的。B類MAPKs包括AtMAPK4 5、AtMAPKll 13。研究最多的是AtMAPK4，它能夠與 AtMAPEKKl，AtMAPKKl/AtMAPKK2 構(gòu)成一條完整的 MAraKK-MAPKK-MAra 信號通路，對植物的先天性免疫防御和細胞死亡起負調(diào)控作用；也參與植物對低溫、脫水、觸摸、創(chuàng)傷、高滲的響應(yīng)。C類激酶的研究非常有限，但是微陣列分析發(fā)現(xiàn)AtMAPK7的表達受到晝夜節(jié)律的調(diào)控；AtMAPK7可能參與調(diào)控PRl基因表達的病原信號傳導(dǎo)途徑；AtMAPKl/2在受到傷害、水楊酸、茉莉香酸、過氧化氫時活性上升。擬南芥的基因組有6個D類MAPK，該類AtMAPK的研究還未見報道，但與擬南芥D類同源的水稻(Oryza sativa) BWMKl和紫花苜蓿TDYl基因分別能夠被真菌和傷信號誘導(dǎo)表達。目前，一些植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量MAPK的存在，但目前小麥中MAPK被發(fā)現(xiàn)鑒定數(shù)量較少，小麥早熟相關(guān)的基因MAPK的研究尚未見報。品種生育期長短歷來是小麥育種中的一個重要目標(biāo)性狀，通過育種方法改變各類小麥的生育期，特別是縮短品種的生育期，不論是過去和將來，對小麥生產(chǎn)發(fā)展都具有十分重要的意義。MAH(提高植物的早熟性中起著至關(guān)重要的作用。這對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)會產(chǎn)生巨大推動作用和經(jīng)濟效益。因此，利用早熟相關(guān)的MAPK 基因基因改良作物具有非常重要理論和實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種小麥早熟相關(guān)蛋白TaMAPKl。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述小麥早熟相關(guān)蛋白TaMAPKl的編碼基因。
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本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的提供上述小麥早熟相關(guān)蛋白TaMAPKl及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的小麥早熟相關(guān)蛋白TaMAPKl，來源于小麥BS20，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。SEQ ID NO. 1 MTHGGRFLLYNIFGNQFEITAKYQPPIMPIGRGAYGIVCSVMNFETREMVAIKKIANAFDNNMDAKRTL
REIKLLRHLDHENIVGLRDVIPPATPQSFNDVYIATELMDTDLHHIIRSNQELSEEHCQYFLYQLLRGLKYIHSANV
IHRDLKPGNLLLNANCDLKICDFGLARPSSESDMMTEYVVTRWYRAPELLLNSTDYSAAIDVWSVGCIFMELINRAP
LFPGRDHMHQMRLITEVIGTPTDDDLGFIRNEDARRYMRHLPQFPRRSFPGQFPKVQPAALDLIERMLTFNPLQRIT
VEEALEHPYLERLRDVADEPICTDPFSFDFEQHPLTEDQMKQLIFNEALELNPNFRY. 根據(jù)本發(fā)明的TaMAPKl基因編碼上述蛋白，可具有如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序
列，TaMAPKl開放閱讀框(ORF)長度為1074bp。SEQ ID NO.2
atgacgcacggcggccgcttcctcctctacaacatattcggcaaccagttcgagatcacg60
gccaagtaccagccgccgatcatgcccatcggccgcggcgcctacgggatcgtctgctcg120
gtgatgaacttcgagacgagggagatggtggcaatcaagaagatcgcaaacgctttcgac180
aacaacatggacgccaagcgcacgctccgggagatcaagctcctgaggcacctcgaccac240
gagaacatagtaggcctccgagatgtgatcccgccggcgaccccgcagtccttcaacgac300
gtctacatcgccaccgagctcatggacacggacctccaccacatcatccgctccaaccaa360
gaactctcggaagaacactgccagtacttcctgtaccagctgctgcgcggcctcaagtac420
atccactcggcgaacgtgatccaccgcgacctcaagccgggcaacctgctgctgaacgcc480
aactgcgacctcaagatctgcgacttcggcCtggCgCggCcgtcgtccgagagcgacatg540
atgacggagtacgtggtcacgcggtggtacCgggCCCCggagctgctgctcaactccacc600
gactactccgcggccatcgacgtctggtccgtcggctgcatcttcatggagctcatcaac660
CgCgCgCCgCtcttcccggggagggaccacatgcaccagatgcggctcatcacggaggtg720
atcggcacccccaccgacgacgacctgggcttcatccggaacgaggacgccaggaggtac780
atgaggcacctgccgcagttccctcgccggtccttcccgggacagttccccaaggtgcag840
CCCgCCgCgCtggacctcatcgagaggatgctcaccttcaacccgctgcagaggatcaca900
gttgaagaggcgctggagcacccatacctagagcggcttcgcgacgtcgccgacgagccc960
atctgcacggaccccttctccttcgacttcgaacagcacccactgacggaagaccagatg1020
aagcagctcatattcaacgaagccctggagttgaaccccaacttccgatactag1074
本發(fā)明的另,一個目的是提供一種培育早熟植物的方法。
本發(fā)明所提供的培育早熟植物的方法，是將上述任一種含有TaMAPKl基因的
表達載體導(dǎo)入植物細胞中，得到早熟植物。 本發(fā)明以小麥BS20 (Triticum aestivum L.)為實驗材料，得到了小麥早熟相關(guān)基因TaMAPKl，并將其導(dǎo)入煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草比野生型開花提前了 20天。


圖1顯示轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的生長情況，A為兩個月的生長情況；B、C為4四個月的生長情況。
具體實施例方式以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》 (第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。實施例1、TaMAPKl基因的克隆及序列基序分析對生長開花期的小麥葉片，用Trizol提取新疆偃麥草總RNA。應(yīng)用5’ RACE試劑盒(5，RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit) (GIBCOBRL, CAT. NO. 18374-058)和3，RACE試劑盒(3，RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends Kit) (GIBCOBRL, CAT. NO. 18373-019)獲得 TaMAPKl 基因的全長序列 1074bp。用iTrizol提取新疆偃麥草幼苗的總RNA，用superscript II (invitrogen)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得到cDNA。根據(jù)TaMAPKl基因編碼區(qū)序列設(shè)計引物Pl和P2。以反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA為模板，用引物Pl和P2進行PCR擴增。弓丨物Pl和P2的序列如下Pl :5，-atgacgcacggcggccgctt-3，，P2 :5， -aaccccaacttccgatactag-3，。對PCR產(chǎn)物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為11Λ左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與PGEM-T Easy (Promega)連接，參照 Cohen 等的方法(Proc Natl Acad Sci，69 :2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，根據(jù)pGEM-T Easy載體上的氨卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結(jié)果表明擴增到的TaMAPKl基因的開放閱讀框(ORF)為SEQ ID No. 2的自5’末端第1至894位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是SEQ ID No. 1的蛋白質(zhì)。將含序列SEQ ID No. 3所示TaMAPKl基因的重組載體命名為pTE_ErNAC7，其cDNA克隆結(jié)果如圖1所示。TaMAPKl基因的序列在Genabnk上進行比對，該基因與小麥中MAPK具有較高同源性，但基因功能未知。實施例2、轉(zhuǎn)TaMAPKl基因的煙草的表達特征將TaMAPKl基因連接到PBI121雙元植物表達載體的35S啟動子下游，構(gòu)建過量表達載體，并通過根癌農(nóng)桿菌C58C1介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到煙草W38株系中。待PCR 檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株生長到一定高度后移栽至花盆，觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草比野生型開花提前了 20天。
權(quán)利要求
1.一種小麥早熟相關(guān)蛋白TaMAPKl，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種小麥早熟相關(guān)基因TaMAPKl，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的小麥早熟相關(guān)基因TaMAPKl，其特征在于，其堿基序列如SEQID NO. 2。
4.包含權(quán)利要求2或3所述小麥早熟相關(guān)基因TaMAPKl的重組載體
5.權(quán)利要求1所述小麥早熟相關(guān)基因TaMAPKl的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述小麥早熟相關(guān)基因TaMAPKl的應(yīng)用。
7.一種培育早熟植物的方法，所述方法包括將含有權(quán)利要求2所述小麥早熟相關(guān)基因 TaMAPKl的重組表達載體導(dǎo)入植物細胞中、得到早熟植物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種小麥早熟相關(guān)蛋白TaMAPK1及其編碼基因和應(yīng)用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明的蛋白及基因?qū)τ谂嘤缡熳魑锞哂酗@著意義。
文檔編號C12N9/12GK102154236SQ201110071338
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者唐益苗, 張朝, 張風(fēng)廷, 趙昌平, 連魏衛(wèi), 馬錦繡, 高世慶 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院