專利名稱：利用rt-lamp方法快速檢測植株中水稻黑條矮縮病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻、小麥和玉米等植株上水稻黑條矮縮病毒的快速檢測技術(shù)及其在病害診斷上的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水稻黑條矮縮病毒(Riceblack-streaked dwarf virus, RBSDV)，是水稻上一種危害嚴重的病毒病，隸屬于植物呼腸孤病毒科斐濟病毒屬(Fijivirus)，病毒粒體球狀，主要由灰飛虱傳播，田間癥狀前期主要表現(xiàn)為植矮縮，葉片濃綠，后期在葉片、葉鞘及莖桿上出現(xiàn)蠟滴狀突起，而后形成黑條，對水稻的產(chǎn)量影響很大，重病田甚至可導(dǎo)致無產(chǎn)量。該病毒除侵染水稻外，還可侵染玉米(玉米粗縮病)、小麥(小麥綠矮)及多種禾本科雜草。1963 和1966年在中國江蘇、上海、浙江一帶流行，90年代在我國許多玉米和水稻產(chǎn)區(qū)爆發(fā)流行， 造成了嚴重損失。近年來該病在江浙地區(qū)蔓延發(fā)生，且呈日漸嚴重的趨勢，2008年僅江蘇省發(fā)病面積就達400萬畝，致使當?shù)氐乃旧a(chǎn)損失嚴重。2007年以來在廣東和海南等省新發(fā)生一種水稻病毒病，田間癥狀與水稻黑條矮縮病毒極其相似，對其基因組序列進行測定后發(fā)現(xiàn)其與水稻黑條矮縮病毒存在較大差異 (兩者的S9和SlO片段的同源性僅僅為75%和80% )，定名為南方水稻黑條矮縮病毒 (Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)，該病毒也屬于植物呼腸孤病毒科斐濟病毒屬(Fijivirus)，病毒粒體球狀，基因組由10條雙鏈RNA組成，傳播介體主要為白背飛虱，灰飛虱也可傳播，田間癥狀表現(xiàn)為植株矮縮、葉色深綠、葉背及莖稈出現(xiàn)條狀乳白色或深褐色小突起，寄主除水稻外還包括玉米及多種雜草。近年來該病長江下游地區(qū)蔓延發(fā)生，且呈日漸嚴重的趨勢，2009年南方水稻黑條矮縮病毒全國發(fā)生面積達300萬畝，2010 年迅速上升至1900萬畝，僅湖南省就發(fā)生近1000萬畝，絕收面積8萬畝，給水稻生產(chǎn)帶來了巨大的損失。由于兩種病毒在癥狀、粒體形狀、傳播介體及寄主等方面非常相似，由此也給其診斷及鑒定造成了困難。目前在植物病毒鑒定識別上常采用的方法有生物學(xué)接種實驗，血清學(xué)檢測，電鏡觀察及分子生物學(xué)檢測。由于這兩種病毒在很多方面都具有非常接近的特性， 因此傳統(tǒng)的植物病毒檢測方法，如電鏡觀察(病毒粒子大小形狀相近)、傳統(tǒng)的生物學(xué)接種鑒定(癥狀、介體、寄主范圍相近)、血清學(xué)檢測(序列仍有較高的同源性)等方法都很難區(qū)分。環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)，是由 Notomi T等在2000年發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，它是一種高靈敏的鏈置換技術(shù)，一種新型的PCR替代技術(shù)。LAMP特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計了 4個特異引物，利
用一種鏈置換DNA聚合酶-Bst (Bacillus stearothermophilus) DNA polymerase在恒溫
(65°C )的條件下反應(yīng)1小時即可完成核酸擴增反應(yīng)，通過熒光染色直接目測比色就可以得到清晰的反應(yīng)結(jié)果。不需要長時間的溫度循環(huán)，不需要PCR等昂貴的儀器，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過程。目前已廣泛應(yīng)用于人類和動植物各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測和快速診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種快速檢測植株上水稻黑條矮縮病毒的方法，通過該方法可以排除南方水稻黑條矮縮病毒的干擾，快速診斷出疑似病株是否為水稻黑條矮縮病。本發(fā)明所提供的一種快速檢測植株上水稻黑條矮縮病毒的方法，是通過以下方法獲得的1)根據(jù)NCBI已報道的水稻黑條矮縮病毒核苷酸序列，通過軟件DNAstar分析后找出該病毒核酸相對保守的區(qū)域作為模板參考序列使用在線LAMP引物設(shè)計軟件 primerExplorer V4 (http //primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0/index, html)設(shè)計弓I物；2) Trizol reagent 法提取植株總 RNA ；3)設(shè)置不同內(nèi)外引物濃度比例、Mg2+濃度，確定最佳反應(yīng)體系；分別改變反應(yīng)時間和溫度進行RT-LAMP擴增反應(yīng)，確定最佳反應(yīng)條件。4)在最佳反應(yīng)參數(shù)條件下，以南方水稻黑條矮縮病毒為對照驗證這一方法的特異性；5)與RT-PCR方法進行比較，驗證RT-LAMP的可靠性；6)通過肉眼判斷和STOR GreenI染色對RT-LAMP產(chǎn)物進行可視化處理。本發(fā)明提供的引物序列如下F 3GGTACTTCTACTTCTAGTCCTTB 3CTTTTTTCATGTCCATCAACTTFIP ACGTAAAGACGATCCTTTTTCAGT-ACAGATAAGAAATTCATTGACTGGBIP AGTGCCACTAATACTTCAACCAC-TCGTCAAAATATTGAACAGAGART-LAMP的反應(yīng)溫度為60_63°C，反應(yīng)時間為60-80min。利用電泳檢測或熒光染料方法可以排除南方水稻黑條矮縮病的干擾，鑒定出水稻黑條矮縮病毒植株樣品。一種檢測植株上水稻黑條矮縮病毒方法的應(yīng)用包括在水稻、小麥和玉米等疑似病植株的快速診斷與鑒別。利用這一方法可以排除南方水稻黑條矮縮病的干擾，快速鑒定出水稻黑條矮縮病毒植株樣品，進而采取針對性的防治策略，減少病害帶來的損失。


圖1為不同反應(yīng)溫度條件下RT-LAMP結(jié)果的電泳圖(M為標準分子量；1 為 60°C ；2 為 61°C ；3 為 62°C ；4 為 63°C ；5 為 64°C ；6 為 65°C ；7 為陰性對照)。圖2為不同反應(yīng)時間條件下RT-LAMP結(jié)果的電泳圖(M為標準分子量；1為20min ； 2 為 40min ；3 為 60min ；4 為 80min ；5 陰性對照)。圖3為RT-LAMP與RT-PCR靈敏性比較圖及熒光染料方法檢測RT-LAMP擴增產(chǎn)物圖(A為RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果圖；B為RT-PCR反應(yīng)結(jié)果圖；C為STOR GreenI熒光染料方法檢測結(jié)果圖；1 為 0. 3255 μ g/μ 1 ；2 為 0. 3255 X KT1 μ g/μ 1 ；3 為 0. 3255 X 1(Γ2 μ g/μ 1 ； 4 為 0. 3255 X 1(Γ3 μ g/μ 1 ；5 為 0. 3255 X 1(Γ4 μ g/μ 1 ；6 為 0. 3255 X 1(Γ5 μ g/μ 1 ；7 為 0. 3255 X IO"6 μ g/μ 1 總 RNA ；8 為陰性對照)。具體實施方法實施例1，水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化①水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP引物的設(shè)計。
根據(jù)NCBI已報道的水稻黑條矮縮病毒(AF227206. 1，http://www. ncbi. nlm.nih.gov/nuccore/183229399 ；EU784843. 1， http://ffww.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/209867306)S10核苷酸序列，通過軟件DNAstar分析后找出該病毒核酸相對保守的區(qū)域950-1467bp，利用ETO23359. 1上的對應(yīng)區(qū)域950_1467bp作為模板參考序列使用在線 LAMP 弓 I 物設(shè)計軟件 primerExplorer V4 (http //primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0/ index, html)設(shè)計引物。將模板序列上傳后，由系統(tǒng)軟件計算獲得初步的LAMP引物組合 (FIP，BIP, F3，B3)，再通過軟件提供的引物相應(yīng)的3’端或5’端穩(wěn)定性及引物二聚體等參數(shù)對設(shè)計出的多對引物進行比較選擇，最終選取一組最合適的引物，序列如下F 3GGTACTTCTACTTCTAGTCCTTB 3CTTTTTTCATGTCCATCAACTTFIP ACGTAAAGACGATCCTTTTTCAGT-ACAGATAAGAAATTCATTGACTGGBIP AGTGCCACTAATACTTCAACCAC-TCGTCAAAATATTGAACAGAGA②水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP的溫度梯度實驗從江蘇省重病區(qū)采集病株，參照季英華等的方法采用RT-PCR篩選出水稻黑條矮縮病毒樣品用于RT-LAMP檢測試驗(季英華等，《(中國水稻科學(xué)》，2011)。參照TRIzol Reagents (康為世紀)使用說明，提取樣品總RNA。雖然Bst DNA polymerase的最適反應(yīng)溫度為65. 8°C，但許多報道已經(jīng)證實RT-LAMP適宜反應(yīng)溫度在60°C_65°C之間，同時由于不同引物在設(shè)計時不可能保證所有引物的Tm值完全一致，而且RT-LAMP還要考慮到反轉(zhuǎn)錄酶的適宜反應(yīng)溫度，有鑒于此，本發(fā)明對RT-LAMP反應(yīng)溫度進行優(yōu)化試驗。RT-LAMP體系為 夕卜弓丨物F3禾口 B3各0. 2μΜ，內(nèi)引物FIP禾口 BIP各1. 2 μ M，dNTP混合物(IOmM each) 2. 5 μ 1， 20mM Tris-HCl(pH 8· 8，25°C )，IOmM KCl，IOmM(MM)2SO4，8mM MgSO4,0. 1% TritonX-100, Bst DNA 聚合酶 8U，M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶 100U，RNase Inhibitor 20仏811甜菜堿，2“ 1 總 RNA 模板，補充DEPC水至25 μ 1?；靹蚍磻?yīng)物在60°C，61 °C，62°C，63°C，64°C，65 V六種條件下恒溫反應(yīng)lh，80°C反應(yīng)5min終止RT-LAMP反應(yīng)，取2 μ L擴增產(chǎn)物上樣，在1. 5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)果EB染色。結(jié)果顯示在同樣反應(yīng)體系條件下，在60°C，6rC，62°C， 63°C恒溫反應(yīng)Ih后有階梯狀擴增條帶，說明這四個反應(yīng)溫度都適合，64°C恒溫反應(yīng)Ih后擴增產(chǎn)物的電泳條帶亮度非常弱，而65°C恒溫反應(yīng)Ih及陰性對照無擴增產(chǎn)物。(圖1)。因此本發(fā)明RT-LAMP的反應(yīng)溫度應(yīng)為60-63°C。③水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP的反應(yīng)時間梯度實驗許多報道已經(jīng)證實了 RT-LAMP反應(yīng)時間少于Ih也能檢測到擴增產(chǎn)物。按照②中已經(jīng)優(yōu)化好的RT-LAMP體系加樣后置于63°C恒溫條件下反應(yīng)，分別設(shè)置恒溫反應(yīng)20min， 40min,60min,80min四種處理，按②中完成反應(yīng)后電泳檢測。結(jié)果顯示當反應(yīng)時間為40min 時已經(jīng)有擴增產(chǎn)物，但產(chǎn)物較少，但是當反應(yīng)時間為60min時，RT-LAMP擴增產(chǎn)物開始增多， 此后當繼續(xù)增加反應(yīng)時間時，擴增產(chǎn)物的量幾乎不發(fā)生改變(圖幻。因此本發(fā)明確定的 RT-LAMP的反應(yīng)時間為60-80min。④RT-LAMP與RT-PCR靈敏性比較為了確定RT-LAMP和RT-PCR兩種檢測方法的靈敏度，將提取的總RNA用分光光度計測定濃度(0. 3255 μ g/μ 1)后用DEPC水進行10倍比稀釋，_70°C保存作為模板。分別取 10倍比稀釋后的各濃度RNA稀釋液2 μ L作為模板，采用所設(shè)引物用③中RT-LAMP反應(yīng)體系進行反應(yīng)(反應(yīng)時間為Ih)。取2yL擴增產(chǎn)物上樣，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。同時， 以RT-LAMP相同的2 μ L總RNA為模板，Β3為反轉(zhuǎn)錄引物，參照M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以RT合成的cDNA為模板，以F3和B 3為引物進行PCR擴增，使用常規(guī)PCR反應(yīng)體系。取2yL擴增產(chǎn)物上樣，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結(jié)果 EB染色。結(jié)果顯示用RT-LAMP方法可以檢測到濃度是0. 3255 X IO"4 μ g/ μ 1的RBSDV的總 RNA,而RT-PCR也能檢測到濃度是0. 3255 X IO"4 μ g/ μ 1的RBSDV的總RNA，即RT-LAMP和 RT-PCR靈敏性是基本一致的(圖3)。⑤熒光染料方法檢測RT-LAMP擴增產(chǎn)物按④中RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測后，向PCR管中加入SYBR GreenKl 1000) 2 μ 1，l-5min后察結(jié)果。結(jié)果顯示陽性擴增產(chǎn)物迅速變成綠色，而無擴增產(chǎn)物及陰性對照保持染料的橙色(圖3)。實施例2，水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP反應(yīng)的特異性試驗為了驗證RT-LAMP方法的特異性，選擇與RBSDV同一屬的南方水稻黑條矮縮病毒 (SRBSDV)作為對照。分別以RBSDV和SRBSDV的總RNA為模板，用②中的RT-LAMP反應(yīng)體系進行反應(yīng)。結(jié)果顯示用RT-LAMP引物去擴增SRBSDV的RNA模板時，沒有擴增出條帶；而擴增RBSDV的RNA時能夠擴增出目的條帶，這表明本發(fā)明建立的RT-LAMP檢測方法具有很好的特異性。一種檢測植株上水稻黑條矮縮病毒方法的應(yīng)用包括在水稻、玉米和小麥等疑似病植株的快速診斷與鑒別。上述實施不以任何形式限定本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測植株上水稻黑條矮縮病毒的方法，其特征在于利用RT-LAMP反應(yīng)的特異性引物，在60-63°C條件下恒溫反應(yīng)60-80mi n，利用電泳檢測或熒光染料方法可以排除南方水稻黑條矮縮病的干擾，鑒定出水稻黑條矮縮病毒植株樣品。
2.1中所述“RT-LAMP反應(yīng)的特異性引物”是指以下4對引物 F3 GGTACTTCTACTTCTAGTCCTTB3 CTTTTTTCATGTCCATCAACTTFIP ACGTAAAGACGATCCTTTTTCAGT-ACAGATAAGAAATTCATTGACTGG BIP AGTGCCACTAATACTTCAACCAC-TCGTCAAAATATTGAACAGAGA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水稻、小麥和玉米等植株上水稻黑條矮縮病毒的快速檢測技術(shù)及其在病害診斷上的應(yīng)用方法。利用這一方法可以排除南方水稻黑條矮縮病的干擾，快速鑒定出水稻黑條矮縮病毒植株樣品，進而采取針對性的防治策略，減少病害帶來的損失。
文檔編號C12Q1/70GK102154518SQ20111007189
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者蘭瑩, 周彤, 周益軍, 孫楓, 徐秋芳, 杜琳琳, 范永堅 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院