專(zhuān)利名稱：前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)基因評(píng)估方法及診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)發(fā)明，利用骨橋蛋白(Osteopontin，0ΡΝ)基因多態(tài)性早期評(píng)估前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法及診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
前列腺癌是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占男性癌癥死因的第二位，約占所有男性癌癥患者的40%。近年隨著人口老齡化及生活條件的改善，發(fā)病率有明顯增加的趨勢(shì)。前列腺癌通常生長(zhǎng)緩慢，患者常常在發(fā)病數(shù)年之后才出現(xiàn)明顯的癥狀或體征，因此及時(shí)發(fā)現(xiàn)并早期治療是前列腺癌診治的關(guān)鍵，然而前列腺癌的發(fā)病原因目前尚不清楚。人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成使我們對(duì)癌癥分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)步入了新的階段。基因多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)普遍存在于機(jī)體DNA序列中，是構(gòu)成疾病敏感性的基因基礎(chǔ)，通過(guò)病例對(duì)照研究不僅對(duì)于發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)基因及闡明其作用機(jī)制起著重要作用，而且對(duì)于癌癥易感性早期風(fēng)險(xiǎn)診斷，個(gè)體化醫(yī)療具有重要意義。骨橋蛋白(Osteopontin, 0ΡΝ)是一種磷酸化酸性糖蛋白，具有多功能細(xì)胞因子作用，同時(shí)也具有粘著蛋白的功能。OPN在多種細(xì)胞中有表達(dá)，包括巨噬細(xì)胞，上皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，并存在于機(jī)體的各種體液中，參與細(xì)胞遷移、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、細(xì)胞存活、組織損傷等多種生物過(guò)程。OPN作為一種炎癥調(diào)節(jié)因子，能延長(zhǎng)自動(dòng)攻擊免疫細(xì)胞的壽命，參與細(xì)胞介導(dǎo)的啟動(dòng)免疫，刺激Thl細(xì)胞因子表達(dá)而抑制Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，直接調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌這些細(xì)胞因子，并通過(guò)巨噬細(xì)胞發(fā)揮腫瘤免疫監(jiān)視作用。OPN基因和蛋白在許多腫瘤，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和胃癌中都增加表達(dá)，并影響腫瘤形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種通過(guò)分析人類(lèi)OPN基因多態(tài)性早期評(píng)估前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法和為開(kāi)發(fā)前列腺癌診斷試劑盒提供靶點(diǎn)。本發(fā)明對(duì)26例前列腺癌患者和38例健康人采集末梢靜脈血，提取基因組DNA，通過(guò)長(zhǎng)片段精確PCR擴(kuò)增OPN基因及其上下游DNA片段，純化PCR產(chǎn)物。對(duì)人類(lèi)OPN基因的獲得，也可通過(guò)采集人靜脈血、上皮細(xì)胞(如口腔上皮細(xì)胞)、毛發(fā)、手術(shù)中獲得的組織等。本發(fā)明中PrimerPremier 5. O軟件用于引物設(shè)計(jì),測(cè)序引物的覆蓋區(qū)域盡可能設(shè)計(jì)成首尾重疊，可對(duì)OPN基因進(jìn)行全序列測(cè)序(如圖I)。測(cè)序PCR反應(yīng)使用ABI BigDyeTerminatorCycle sequencing Ready Reaction Kit,每個(gè)反應(yīng)包括 50ng 的 LR-PCR 產(chǎn)物。反應(yīng)條件為95°C 15s，55°C 15s，60°C 4min共25循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物被提純后在ABI3700automated DNA sequencer中電泳。序列通過(guò)SeqScapeV2. I軟件與已知序列比對(duì)，混合峰中第二個(gè)峰大于主峰的45%則被確認(rèn)為SNPs。對(duì)SNP位點(diǎn)的基因型定型方法還包括限制性片段長(zhǎng)多型、5’核酸內(nèi)切酶分析(TaqMan探針技術(shù))、高分辨溶解曲線變異分析技術(shù)、PCR-SSP法、變性梯度凝膠電泳法、PCR-ASO法單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)和基因芯片技術(shù)等。本發(fā)明中使用的統(tǒng)計(jì)方法用卡方檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)計(jì)算Hardy-Weinberg平衡，比較前列腺癌患者和健康個(gè)體間的等位基因型和單體型分布。Haploview軟件包用來(lái)評(píng)估連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD),識(shí)別 haplotype tagging SNPs (htSNPs)。檢驗(yàn)用SPSS10. O統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P < O. 05為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本發(fā)明中確定了 69個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型，其中次等位基因率大于1%的SNP位點(diǎn)有27個(gè)，連鎖不平衡分析產(chǎn)生3個(gè)連 鎖塊和13個(gè)htSNPs(如圖2)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)由 SNP(10)、SNP(Il)、SNP(13)、SNP(15)、SNP(22)、SNP(23)構(gòu)成的單體型組合和由SNP (35)、SNP (49)、SNP (59)構(gòu)成的單體型組合與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。其中，SNP10-11-13-15-22-23構(gòu)成的單體型為T(mén)-G-C-C-T-G的個(gè)體的前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)將明顯增加(P = 3. 64X IO-6)，而為G-T-C-C-T-G的個(gè)體的前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)將顯著降低(P =O. 0185)。本發(fā)明中又通過(guò)對(duì)26例前列腺癌患者和29例前列腺增生患者進(jìn)一步OPN基因多態(tài)性位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)SNP(35)、SNP(49)、SNP(59)構(gòu)成的單體型組合也可用于鑒別診斷前列腺癌與前列腺增生，當(dāng)單體型為A-C-T時(shí)，前列腺癌的幾率明顯增加(P = O. 002)，而單體型為G-T-C時(shí)前列腺增生的幾率增加(P = O. 002)。本發(fā)明用于評(píng)估前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的OPN基因包括9個(gè)多態(tài)性變異位點(diǎn)。(注多態(tài)性變異位點(diǎn)定位參照人類(lèi)OPN基因序列，D14813，序列見(jiàn)“核苷酸或氨基酸序列表”)I)SNP (10)，定位在OPN基因啟動(dòng)子領(lǐng)域第2122位置，多態(tài)性變異類(lèi)型為T(mén)/G。2) SNP (11)，定位在OPN基因啟動(dòng)子領(lǐng)域第2123位置，多態(tài)性變異類(lèi)型為G/T。3) SNP (13)，定位在OPN基因5’UTR領(lǐng)域第2317位置，多態(tài)性變異類(lèi)型為C/T。4) SNP (15)，定位在OPN基因5’UTR領(lǐng)域第2337位置，多態(tài)性變異類(lèi)型為C/T。5) SNP (22)，定位在OPN基因內(nèi)含子I領(lǐng)域第2337位置，編號(hào)rs2853749，多態(tài)性變異類(lèi)型為C/T。6) SNP (23)，定位在OPN基因內(nèi)含子I領(lǐng)域第2337位置，編號(hào)rs2853750，多態(tài)性變異類(lèi)型為A/G。7) SNP (35)，定位在OPN基因內(nèi)含子3領(lǐng)域第位置，編號(hào)rs6532039，多態(tài)性變異類(lèi)型為A/G。8) SNP (49)，定位在OPN基因外顯子6領(lǐng)域第位置，編號(hào)rs4754，多態(tài)性變異 類(lèi)型為C/T。9) SNP (59)，定位在OPN基因外顯子7領(lǐng)域第位置，編號(hào)rsl 126616，多態(tài)性變異類(lèi)型為T(mén)/C。其中A代表腺嘌呤，G代表鳥(niǎo)嘌呤，C代表胞嘧啶，T代表胸腺嘧啶。篩選出的9個(gè)SNP位點(diǎn)可單獨(dú)或兩個(gè)及兩個(gè)以上位點(diǎn)組成等位基因單體型，也可與OPN基因中或基因外附近的其他SNP位點(diǎn)組成單體型用于評(píng)估前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和作為前列腺癌診斷試劑盒的靶點(diǎn)，也可用于鑒別診斷前列腺癌與前列腺增生。上述中的SNP(IO)和 SNP(Il)與 SNPrs3841116 (-/G/T)相關(guān)，當(dāng) SNPrs3841116 為 堿基缺失基因型時(shí)，SNP (10)為“T”，SNP(Il)為“G”;當(dāng)SNPrs3841116為“G/T”基因型
時(shí)，SNP(IO)和(11)的等位基因均為“G/T”。SNP (35)、SNP (49)、SNP (59)也可以和OPN基因中或OPN基因外圍中的其他SNP位點(diǎn)共同組成單體型評(píng)估前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，也可用于鑒別診斷前列腺癌與前列腺增生。本發(fā)明適用于對(duì)體檢人群、具有癌癥家族史及有檢查意愿的正常個(gè)體進(jìn)行前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和早期診斷。


圖I、長(zhǎng)PCR擴(kuò)增OPN基因及全序列基因測(cè)序。圖2、在前列腺癌患者和健康人之間OPN基因的連鎖不平衡分析。
具體實(shí)施方式

OPN基因中SNP10-11-13-15-22-23構(gòu)成的T-G-C-C-T-G單體型將明顯增加前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P = 3. 64X 10 6), G-T-C-C-T-G單體型將顯著降低前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P =O. 0185)。OPN基因中SNP35-49-59-62-64構(gòu)成的G-T-C-A-A單體型個(gè)體的前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)將顯著降低(P = O. 0069)。OPN基因中SNP35-49-59構(gòu)成A_C_T單體型個(gè)體的前列腺癌發(fā)病幾率明顯增加(P=O. 002)，而單體型G-T-C個(gè)體為前列腺增生的幾率增加(P = O. 002)。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)檢測(cè)基因多態(tài)性變異位點(diǎn)早期評(píng)估前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法及診斷試劑盒，適用于對(duì)體檢人群、具有癌癥家族史及有檢查意愿的個(gè)體進(jìn)行前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和早期診斷。其特征在于，檢測(cè)基因?yàn)槿祟?lèi)骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)基因。人類(lèi)OPN基因定位在 4q21-q25,也稱 SECRETED PH0SPH0PR0TEIN I 或 SPPI, MIM ID 為 166490。
2.如權(quán)利要求I中所述的通過(guò)檢測(cè)人類(lèi)OPN基因多態(tài)性變異位點(diǎn)早期評(píng)估前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法及診斷試劑盒，其特征在于，包括OPN基因的以下9個(gè)多態(tài)性變異位點(diǎn)(注多態(tài)性變異位點(diǎn)定位參照人類(lèi)OPN基因序列，GenBank D14813，序列見(jiàn)“核苷酸或氨基酸序列表”) 1)SNP (10)，定位在OPN基因啟動(dòng)子領(lǐng)域第2122位置，多態(tài)性變異類(lèi)型為T(mén)/G。
2)SNP (11)，定位在OPN基因啟動(dòng)子領(lǐng)域第2123位置，多態(tài)性變異類(lèi)型為G/T。
3)SNP (13)，定位在OPN基因5’ UTR領(lǐng)域第2317位置，多態(tài)性變異類(lèi)型為C/T。
4)SNP (15)，定位在OPN基因5’ UTR領(lǐng)域第2337位置，多態(tài)性變異類(lèi)型為C/T。
5)SNP (22)，定位在OPN基因內(nèi)含子I領(lǐng)域第2337位置，編號(hào)rs2853749，多態(tài)性變異類(lèi)型為C/To 6)SNP (23)，定位在OPN基因內(nèi)含子I領(lǐng)域第2337位置，編號(hào)rs2853750，多態(tài)性變異類(lèi)型為A/G。
7)SNP (35)，定位在OPN基因內(nèi)含子3領(lǐng)域第位置，編號(hào)rs6532039，多態(tài)性變異類(lèi)型為A/G。
8)SNP (49)，定位在OPN基因外顯子6領(lǐng)域第位置，編號(hào)rs4754，多態(tài)性變異類(lèi)型為C/T。
9)SNP (59)，定位在OPN基因外顯子7領(lǐng)域第位置，編號(hào)rsl 126616，多態(tài)性變異類(lèi)型為T(mén)/C。
其中A代表腺嘌呤，G代表鳥(niǎo)嘌呤，C代表胞嘧啶，T代表胸腺嘧啶。
3.如權(quán)利要求I和2中所述的9個(gè)SNP位點(diǎn)可單獨(dú)或兩個(gè)及兩個(gè)以上位點(diǎn)組成等位基因單體型，也可與OPN基因中或基因外附近的其他SNP位點(diǎn)組成單體型用于評(píng)估前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和作為前列腺癌診斷試劑盒的靶點(diǎn)，也可用于鑒別診斷前列腺癌與前列腺增生。
4.如權(quán)利要求I至4中所述的SNP(IO)和SNP(Il)，其特征在于，與定位在OPN基因2113 位置的 SNPrs3841116 (-/G/T)相關(guān)，當(dāng) SNPrs3841116 為堿基缺失時(shí)，SNP(IO)為“T”，SNP(Il)為 “G”；當(dāng) SNPrs3841116 為 “G/T” 時(shí)，SNP(IO)和(11)的等位基因均為 “G/T”。
5.如權(quán)利要求I至4中所述的通過(guò)檢測(cè)人類(lèi)OPN基因多態(tài)性變異位點(diǎn)早期評(píng)估前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法及診斷試劑盒，其特征在于，包含有SNP(IO)、SNP(Il)、SNP(13),SNP (15)、SNP (22)、SNP (23)構(gòu)成的單體型組合與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。其中，SNP10-11-13-15-22-23構(gòu)成的單體型為T(mén)-G-C-C-T-G的個(gè)體明顯增加前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P = 3. 64X 10_6)，而為G-T-C-C-T-G的個(gè)體顯著降低前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P = 0. 0185)。
6.如權(quán)利要求I至4中所述的通過(guò)檢測(cè)人類(lèi)OPN基因多態(tài)性變異位點(diǎn)早期評(píng)估前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法及診斷試劑盒，其特征在于，包含有SNP (35)、SNP (49)、SNP (59)構(gòu)成的單體型組合與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。其中，SNP35-49-59構(gòu)成的單體型為G-T-C的個(gè)體的前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)將顯著降低6. 4倍(P = 0. 0069)。
7.如權(quán)利要求I至4中所述的通過(guò)檢測(cè)人類(lèi)OPN基因多態(tài)性變異位點(diǎn)早期評(píng)估前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法及診斷試劑盒，其特征在于，包含有SNP (35)、SNP (49)、SNP (59)構(gòu)成的單體型組合也可用于鑒別診斷前列腺癌與前列腺增生，當(dāng)單體型為A-C-T時(shí)，前列腺癌的可能性明顯增加(P = 0. 002)，而單體型為G-T-C時(shí)前列腺增生的可能性增加(P = 0. 002)。
8.如權(quán)利要求I至4中所述的通過(guò)檢測(cè)人類(lèi)OPN基因多態(tài)性變異位點(diǎn)早期評(píng)估前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法及診斷試劑盒，其特征在于，對(duì)人類(lèi)OPN基因的獲得，可通過(guò)采集人靜脈血、上皮細(xì)胞(如口腔上皮細(xì)胞)、毛發(fā)、手術(shù)中獲得的組織等。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或長(zhǎng)片段PCR用于對(duì)OPN基因的擴(kuò)增。
9.如權(quán)利要求I至4中所述的通過(guò)檢測(cè)人類(lèi)OPN基因多態(tài)性變異位點(diǎn)早期評(píng)估前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的方法及診斷試劑盒，其特征在于，對(duì)SNP rs3841116、SNP(IO)、SNP(Il)、SNP (13)、SNP (15)、SNP (22)、SNP (23)、SNP (35)、SNP (49)、SNP (59)及其相關(guān) SNP 位點(diǎn)的基因型定型方法包括基因測(cè)序、限制性片段長(zhǎng)多型、5’核酸內(nèi)切酶分析(TaqMan探針技術(shù))、高分辨溶 解曲線變異分析技術(shù)、PCR-SSP法、變性梯度凝膠電泳法、PCR-ASO法單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)和基因芯片技術(shù)等。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用骨橋蛋白基因多態(tài)性早期評(píng)估前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法及診斷試劑盒。本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明，主要特征如下通過(guò)對(duì)骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)基因中包含SNP(10)、SNP(11)、SNP(13)、SNP(15)、SNP(22)rs2853749、SNP(23)rs2853750構(gòu)成的單體型和包含SNP(35)rs6532039、SNP(49)rs4754和SNP(59)rs1126616構(gòu)成的單體型進(jìn)行基因定型，可評(píng)估前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，用于早期診斷和鑒別診斷。本發(fā)明適用于對(duì)體檢人群、具有癌癥家族史及有檢查意愿的個(gè)體進(jìn)行前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和早期診斷，也可用于前列腺癌與前列腺增生的鑒別診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102676644SQ201110073368
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者劉健, 劉澤輝, 朱志強(qiáng), 王有亮, 蘆秀麗, 鄧智先, 高兵 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院