專利名稱：改良溴化乙啶染色法快速檢測基因組dna的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物實驗技術發(fā)明，改良的檢測方法準確率比瓊脂糖凝膠電泳法有顯著提高，節(jié)省時間，提高DNA檢出效率，同時，可減少基因組DNA的上樣量。這種改良的溴化乙啶(EB)染色方法適用于大規(guī)模基因組DNA樣本的快速檢測，但不能用來確定DNA片段大小。
背景技術：
近年來，基因組DNA提取已經被廣泛應用于醫(yī)學、生命科學的許多領域。人類基因組計劃的完成，更為人類利用基因組DNA遺傳密碼破解疾病機制奠定了基礎，成百上千例DNA樣本量的病例-對照相關性研究越來越多的被用于發(fā)現(xiàn)疾病致病基因和相關變異位點。
傳統(tǒng)的基因組DNA提取后的檢測方法是通過瓊脂糖凝膠電泳/溴化乙啶染色，但這種檢測方法的靈敏度和重復性較差，需要樣本DNA上樣量較大，通常為5-10μ 1，當提取的基因組DNA含量低時，通常不易觀察到陽性結果。此外，瓊脂糖凝膠電泳檢測法用于檢測大量基因組DNA樣本時，顯的有些費時，費材，費力?？紤]到瓊脂糖凝膠電泳/溴化乙啶染色的這些缺點,本發(fā)明介紹一種改良的溴化乙啶染色快速檢測樣本基因組DNA的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種改良的溴乙啶染色快速檢測樣本基因組DNA的方法。此改良方法節(jié)省時間，敏感性比瓊脂糖凝膠電泳法有顯著提高，并可減少基因組DNA的上樣量，節(jié)省DAN樣本。本發(fā)明的實驗方法為剪切20 X 40mm的PARAFILM “M”封口膜，按照檢測樣本數(shù)在封口膜上間隔50mm間距均勻點樣2 μ I O. 5 μ I/ml溴化乙錠，分別吸取2 μ I待檢DNA樣本與封口膜上溴化乙啶充分混合，同時每張封口膜預留1-2處溴乙錠陰性對照，室溫下靜置l-2mins，將封口膜置于暗箱式雙光紫外儀下觀察，記錄或拍攝封口膜上點樣的亮度，DNA陽性點樣呈橙紅色，DNA陰性點樣呈無色。封口膜大小依檢測樣本數(shù)量多少而定，點樣保留適當間隔即可。每次點樣溴化乙錠用量可O. 5-5 μ 1，DNA用量可O. 5-5 μ I。對點樣明亮度的觀察，以同時設定的溴化乙啶陰性對照對基準。改良的溴化乙啶染色法快速檢測基因組DNA，可用于初略估計DNA濃度。本發(fā)明通過對滅菌蒸餾水、溴化乙啶、DNA和溴化乙啶+DNA分組對比觀察，溴化乙啶+DNA組與其他組存在明顯亮度差。(如圖I)本發(fā)明將DNA樣本稀釋2χ、4χ、8χ、16χ、32χ后，同時進行改良法與傳統(tǒng)凝膠電泳法檢測。改良法在稀釋32χ后仍可見點樣亮度；而凝膠電泳檢測法在8χ稀釋后即不能檢出。(如圖2)本發(fā)明對161例正常人采集末梢靜脈血，提取基因組DNA。對改良溴化乙啶染色法和凝膠電泳法檢測基因組DNA的敏感度進行比較(如圖3)。結果發(fā)現(xiàn)，改良法的陽性檢出率明顯高于凝膠電泳法(P = O. 000005)(如圖4)本發(fā)明可用于制作DNA檢測芯片和日?？蒲泄ぷ髦械腄NA檢測。


圖I、改良法檢測基因組DNA圖2、改良法和電泳法檢測稀釋的基因組DNA結果
圖3、改良法和電泳法檢測基因組DNA結果比較圖4、改良法和電泳法檢測161例樣本基因組DNA結果
具體實施例方式剪切20 X 40mm的PARAFILM “Μ”封口膜，按照檢測樣本數(shù)在封口膜上間隔50mm間距均勻點樣2 μ I O. 5 μ I/ml溴化乙錠，分別吸取2 μ I待檢DNA樣本與封口膜上溴化乙啶充分混合，同時每張封口膜預留1-2處溴乙錠陰性對照，室溫下靜置l-2mins，將封口膜置于暗箱式雙光紫外儀下觀察，對比溴化乙啶陰性對照，明亮點樣為DNA陽性。
權利要求
1.一種改良溴化乙啶染色法快速檢測基因組DNA，敏感度比瓊脂糖凝膠電泳法有顯著提高，節(jié)省時間，提高DNA檢出效率，同時，可減少基因組DNA的上樣量。
2.這種改良的溴化乙啶(EB)染色方法適用于大規(guī)?；蚪MDNA樣本的快速檢測，但不能用來確定DNA片段大小。
3.如權利要求I中所述的改良溴化乙啶染色法快速檢測基因組DNA，方法如下剪切20X40mm的PARAFILM “M”封口膜，按照檢測樣本數(shù)在封口膜上間隔50mm間距均勻點樣O.5 μ I/ml溴化乙錠2 μ 1，分別吸取2 μ I待檢DNA樣本與封口膜上溴化乙啶充分混合，同時每張封口膜預留1-2處溴化乙錠陰性對照(不加DNA)，室溫下靜置l-2mins，將封口膜置于暗箱式雙光紫外儀下觀察，對比溴化乙啶陰性對照，明亮點樣為DNA陽性。
4.如權利要求3中所述的改良溴化乙啶染色法快速檢測基因組DNA，封口膜大小依檢測樣本數(shù)量多少而定，點樣保留適當間隔即可。每次點樣溴化乙錠用量可O. 5-5μ 1，DNA用量可 O. 5~5 μ I。
5.如權利要求3中所述的改良溴化乙啶染色法快速檢測基因組DNA，對點樣明亮度的觀察，以同時設定的溴化乙啶陰性對照對基準。
6.如權利要求1-5中所述的改良溴化乙啶染色法快速檢測基因組DNA，可用于初略估計DNA濃度。
7.如權利要求I至6中所述的改良溴化乙啶染色法快速檢測基因組DNA，可用于制作DNA檢測芯片和日?？蒲泄ぷ髦械腄NA檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改良的溴化乙啶染色快速檢測樣本基因組DNA的方法，屬于生物實驗技術發(fā)明。通過實驗發(fā)現(xiàn)，改良的檢測方法準確率比瓊脂糖凝膠電泳法有顯著提高，并節(jié)省時間，提高了DNA檢出效率。同時，可減少基因組DNA的上樣量，節(jié)省樣本DNA的用量。這種改良的溴化乙啶染色方法適用于基因組DNA樣本的快速檢測，但不能用來確定DNA片段大小。
文檔編號C12Q1/68GK102634569SQ20111007337
公開日2012年8月15日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權日2011年3月25日
發(fā)明者劉健, 劉澤輝, 朱志強, 王有亮, 蘆秀麗, 鄧智先, 高兵 申請人:沈陽醫(yī)學院