專利名稱：：腫瘤壞死因子受體Ⅱ-脂聯(lián)素球部融合蛋白改構(gòu)體快速篩選方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，為基因工程重組蛋白的應(yīng)用。具體涉及腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部融合蛋白及其基因的人工重組改構(gòu)和密碼子優(yōu)化，以期獲得該重組蛋白更好的生物學(xué)效應(yīng)、更高的穩(wěn)定性及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中更高效的表達(dá)產(chǎn)量。為此，本發(fā)明同時(shí)建立了一種利用腺病毒載體/BHK21細(xì)胞系統(tǒng)來表達(dá)改構(gòu)體的方法。目的是將其做為一種技術(shù)手段，以便于快速篩選出活性更高、結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部融合蛋白的各種改構(gòu)體。
背景技術(shù)：
：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)作為危害人類健康最常見、最難治愈的免疫疾病之一，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，是造成我國人群喪失勞動(dòng)力和致殘的主要病因。我國現(xiàn)有該病患者2000萬人，包括中重度活動(dòng)性患者約400多萬。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎至今尚無特效療法，傳統(tǒng)的綜合治療方法針對炎癥及后遺癥采取措施缺乏顯著療效，并且長期使用易引起嚴(yán)重的副作用。臨床表現(xiàn)為多處關(guān)節(jié)滑膜炎持久反復(fù)發(fā)作，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，甚至殘廢。該病在世界范圍內(nèi)普遍存在，其發(fā)病率約占人群的1%_2%。因此，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎已成為危害人類健康最常見、最難治的疾病之一(ToussirotEandWendlingD.TheuseofTNF-alphablockingagentsinrheumatoidarthritisanupdate.ExpertOpinPharmacother.2007,8(13)2089-2107)。研究發(fā)現(xiàn)，TNFa在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生中起著重要作用。如過度表達(dá)TNFa的轉(zhuǎn)基因小鼠會發(fā)生侵蝕性、炎性關(guān)節(jié)炎(KefferJ，ProbertL，CazlarisH，etal.Transgenicmiceexpressinghumantumournecrosisfactorapredictivegeneticmodelofarthritis.EMBOJ.1991,10(13):4025-4031);在狀的動(dòng)物模型中，膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎、佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎等，用TNFα阻滯劑治療可明顯減輕關(guān)節(jié)的炎癥與破壞；在RA患者的滑液中發(fā)現(xiàn)TNFa的表達(dá)量高于正常人等等(SaxneT，JrPalladinoMA,HeinegardD,etal.Detectionoftumornecrosisfactoralphabutnottumornecrosisfactorbetainrheumatoidarthritissynovialfluidandserum.ArthritisRheum.1988,31(8):1041-1045.)。因此去除過多的TNFa成為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的目標(biāo)之一(BrennanFM,ChantryD,JacksonA,etal.InhibitoryeffectofTNFalphaantibodiesonsynovialcellinterleukin-1productioninrheumatoidarthritis.Lancet.1989,2(8657):244-247)。TNFa拮抗劑作為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新型藥物在緩解疼痛、改善和維持關(guān)節(jié)功能上有著明顯的功效，得到了醫(yī)學(xué)界的廣泛重視，已成為目前治療該病的研究熱點(diǎn)。目前已開發(fā)的TNFa拮抗劑主要有Infliximab、Adalimumab和Etanercept三種(LandryYandGiesJP.Drugsandtheirmoleculartargetsanupdatedoverview.FundamClinPharmacol.2008,22(I):1_18)。其中Infliximab為嵌合性的抗TNFα抗體，Adalimumab為人源化的抗TNFa抗體，這兩種抗體均能分別與TNFa結(jié)合，并均能因此中和TNFa而獲得拮抗TNFa的作用。而Etanerc印t為TNFa的受體，也能與TNFa結(jié)合，產(chǎn)生拮抗TNFa的作用。腫瘤壞死因子(TNF)的受體分為TNFRI(TNFreceptorI,TNFRP，p55)和TNFRII(TNFreceptorII,TNFRα,ρ75)兩種(LoetscherH,SchlaegerEJ,LahmHW,etal.PurificationandpartialaminoacidsequenceanalysisoftwodistincttumornecrosisfactorreceptorsfromHL60cells.JBiolChem.1990，265(33)20131-20138)。TNFRI是分子量為50kD的I型跨膜蛋白，主要在除了紅細(xì)胞外的所有細(xì)胞表達(dá)，其蛋白前體編碼455個(gè)氨基酸，在剪切掉29個(gè)氨基酸的信號肽后成為為426個(gè)氨基酸的成熟TNFRI。成熟的TNFRI蛋白包括胞外區(qū)N端182個(gè)氨基酸，跨膜區(qū)21個(gè)氨基酸和胞漿內(nèi)C端含223個(gè)氨基酸三部分。胞外區(qū)部分有3個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，蛋白的理論的分子量為47.5kD(RotheJ,GehrG,LoetscherH,etal.Tumornecrosisfactorreceptors—structureandfunction.TmmunolRes.1992,11(2):81-90)。TNFRII分子量為75kD，主要在免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，其cDNA編碼439個(gè)氨基酸，包括跨膜區(qū)26個(gè)氨基酸，胞外區(qū)235個(gè)氨基酸和胞內(nèi)區(qū)178個(gè)氨基酸。TNFRII胞外區(qū)有2個(gè)糖基化位點(diǎn)，蛋白理論的分子量為50kD(SchallTJ,LewisM,RollerKJ,etal.Molecularcloningandexpressionofareceptorforhumantumornecrosisfactor.Cell.1990,61(2):361-370)?？扇苄訲NF受體(solubleTNFreceptor,sTNFR)是TNFR受體胞外區(qū)部分脫落下來形成的，不再參與信號的傳導(dǎo)，但能與TNF結(jié)合，可以中和TNF的活性(RotheJ，GehrG,LoetscherH,etal.Tumornecrosisfactorreceptors—structureandfunction.TmmunolRes.1992,11(2):81-90)。sTNFRII是TNFa的天然拮抗劑(Fernandez-BotranR.Solublecytokinereceptorsnovelimmunotherapeuticagents.ExpertOpinInvestigDrugs.2000；9(3):497-514)。然而研究表明，成熟的TNFα以三聚體(trimer)形式存在(JonesEY,StuartDIandWalkerNP.Structureoftumournecrosisfactor.Nature.1989,338(6212):225-228)。顯而易見，增強(qiáng)sTNFRII與TNFα間的親和力可以通過sTNFRII的三聚體化來實(shí)現(xiàn)。Etanercept是sTNFRII與IgG的Fe段形成的二聚體化(dimer)的融合蛋白(即sTNFRII-Fc融合蛋白)。此融合蛋白不僅延長受體在體內(nèi)的半衰期，并且借助于Fe的二聚化作用使融合蛋白形成同源二聚體，相比可溶性的sTNFRII單體更能有效地抑制TNFa。它用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，能有效緩解疼痛，防止或明顯降低關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞，從而改善并維持關(guān)節(jié)功能。Etanerapt拮抗TNFa的能力是相應(yīng)sTNFRII單體的50-1000倍(MohlerKM,TorranceDS,SmithCA,GoodwinRG,StremlerKE,FungVP,MadaniH,WidmerMB.SolubletumornecrosisfactorreceptorsareeffectivetherapeuticagentsinlethalendotoxemiaandfunctionsimultaneouslyasbothTNFcarriersandTNFantagonists.JTmmunol·1993；151:1548-61)。另外，有研究報(bào)道將T4的FibritinE與HIV-I的外膜糖蛋白gpl40結(jié)合，可以形成穩(wěn)定的同源三聚體，它的耐熱性和抗還原性比用GCN4修飾的三聚體更穩(wěn)定(YangX7LeeJ,MahonyEM,etal.HighlyStableTrimersFormedbyHumanImmunodeficiencyVirusTypeIEnvelopeGlycoproteinsFusedwiththeTrimericMotifofT4BacteriophageFibritin.JVriol2002，76(9)，4634-4642)T4噬菌體是一種有尾噬菌體，由頭部和尾部組成，頭部和尾部通過頸部相連。頸部由6條短的纖維狀物質(zhì)Fibritin形成項(xiàng)圈樣復(fù)合物。Fibritin是一種52KD的同型三聚體，研究發(fā)現(xiàn)Fibritin有一系列的突變體，F(xiàn)ibritinE就是其中的一種突變體，為同型三聚體，包括N端結(jié)構(gòu)域，中間不連續(xù)的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)和C端折疊結(jié)構(gòu)域。每個(gè)亞基由Fibritin的最后119個(gè)氨基酸組成。利用FibritinEC端27個(gè)氨基酸(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)，靠β折疊之間的疏水作用和極性作用(氫鍵)形成三聚體(TaoYZ,StrelkovSV,etal.StructureofbacteriophageT4fibritinasegmentedcoiledcoilandtheroleoftheC-terminaldomainstructure19975(6)789-798)。脂聯(lián)素(adiponectin，AD)是新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子，它以內(nèi)分泌方式循環(huán)于血液中，參與調(diào)節(jié)葡萄糖、脂肪酸代謝及抵抗炎癥反應(yīng)等生命活動(dòng)。脂聯(lián)素是脂肪特有基因apMl(adiposemostabundantgenetranscriptI)的編碼產(chǎn)物，該基因位于染色體3q27(SaitoK,TobeT,MinoshimaS,etal.Organizationofthegeneforgelatin-bindingprotein(GBP28).Gene.1996,229:67-73)脂聯(lián)素只在脂肪組織中表達(dá)，它由244個(gè)氨基酸組成，包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域N端氨基酸為分泌信號肽，之后為一個(gè)特異的超變量序列，膠原樣重復(fù)序列，C端為補(bǔ)體Clq樣球形結(jié)構(gòu)域(HuE，LiangP,SpiegelmanBM.AdipoQisanoveladipocytespecificgenedysregulatedinobesity.J.Biol.Chem.1996，27110697-10703)。脂聯(lián)素屬于可溶性膠原蛋白超家族，與膠原蛋白珊，X和補(bǔ)體Clq結(jié)構(gòu)相似，還與腫瘤壞死因子超家族(TNF)有高度同源性(ShapiroL,SchererPE.Thecrystalstuctureofacomplement—lqfamilyproteinsuggestsanevolutionarylinktotumornecrosisfactor.Curr.Biol.1998,8:335-338)。脂聯(lián)素球部(gAD)為脂聯(lián)素在蛋白酶裂解作用下產(chǎn)生，是全長脂聯(lián)素的羧基端部分，可以在體內(nèi)相互結(jié)合形成三聚體的形式(ShapiroL,SchererPE.Thecrystalstructureofacomplement-lqfamilyproteinsuggestsanevolutionarylinktotumornecrosisfactor.CurrBiol.1998,8(6)335-338)。脂聯(lián)素在發(fā)現(xiàn)之初就確定其作用與胰島素相關(guān)(SchererPE,WilliamsS，F(xiàn)oglianoM,etal.AnovelserumproteinsimilartoClq,producedexclusivelyinadipocytes.J.Biol.Chem.1995,270:26746-26749)，并參與調(diào)節(jié)能量的平衡，包括營養(yǎng)的吸收，碳水化合物和脂類的代謝。此后的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，認(rèn)為脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞特異性分泌的一種蛋白類激素，可以增加機(jī)體對胰島素的敏感性，參與人體多種代謝過程；相比其他激素，它在血液中的含量比較豐富，但在肥胖和II型糖尿病病人血液中含量減少(UkkolaO,SantaniemiM.AdiponectinalinkbetweenexcessadiposityandassociatedcomorbiditiesJ.Mol.Med.2002.80:696-702)。Yokota等發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素在造血和免疫防御方面的作用抑制骨髓單核細(xì)胞系的分化，抑制吞噬細(xì)胞的吞噬作用以及抑制脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-a(YokotaT,OritaniK,TakahashiI,etal.Adiponectin,anewmemberofthefamilyofsolubledefensecollagens,negativelyregulatesthegrowthofmyelomonocyticprogenitorsandthefunctionsofmacrophages.Blood.2000,96:1723-1732)。動(dòng)物和人類研究都以證實(shí)脂聯(lián)素與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的密切聯(lián)系，它可以促進(jìn)內(nèi)皮依賴的血管舒張，抑制動(dòng)脈粥樣硬化，抑制血管粘附分子受體的表達(dá)(OuchiN,ohishiM,KiharaS,etal.AssociationofHypoadiponectinemiaWithImpairedVasoreactivity.Hypertension.2003,42:231-234)。因此推斷，脂聯(lián)素具有抗炎，抗糖尿病，抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，它積極的參與了人體的多種生理過程，如能量代謝，機(jī)體對胰島素敏感性，免疫反應(yīng)和脈管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)等。在中國專利(專利號ZL200510100468.9)中，我們提出了通過構(gòu)建脂聯(lián)素膠原狀區(qū)域和球狀結(jié)構(gòu)域與sTNFRII融合基因的策略來獲得三聚體化的sTNFRII，即sTNFRII-gAD重組蛋白。該專利是利用了脂聯(lián)素球部自動(dòng)形成三聚體的特性而設(shè)計(jì)的，結(jié)果證明獲得的三聚體化sTNFRII-gAD融合蛋白拮抗TNFα的活性將比二聚體化sTNFRII-Fc更高。然而，由于原核表達(dá)的蛋白容易形成包涵體(NashPTandFlorinTH.Tumournecrosisfactorinhibitors.MedJAust.2005，183(4):205-208)，需要變復(fù)性，不能對蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾，因此獲得有活性的蛋白效率較低。因此本發(fā)明涉及用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)來制備目的蛋白。發(fā)明概述本發(fā)明是中國專利(專利號ZL200510100468.9)的進(jìn)一步延伸。具體地，本案去除了原基因結(jié)構(gòu)中sTNFRII和gAD之間的酶切位點(diǎn)和膠原的基因序列，共計(jì)18個(gè)堿基，編碼6個(gè)氨基酸，使其三聚體化的表達(dá)產(chǎn)物獲得更高的穩(wěn)定性；并且將改造后的基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，使其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中更高效的表達(dá)。這樣，經(jīng)過改造的基因表達(dá)出的融合蛋白具有更好的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性。為了快速和大量的制備融合蛋白，建立了一種利用腺病毒載體/BHK21細(xì)胞系統(tǒng)來表達(dá)改構(gòu)體的方法。在證明了腺病毒可以感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞BHK-21/c022后，我們構(gòu)建了三種攜帶目的基因的質(zhì)粒載體，然后用AdMax腺病毒載體系統(tǒng)制備攜帶上述融合基因的重組復(fù)制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD，rAd5-sTNFRII-gAD-new和rAd5-sTNFRII-gAD-opti。將這三種腺病毒分別以MOI為1000感染BHK-21/c022細(xì)胞,獲得的上清經(jīng)westernblotting檢測這三種蛋白的表達(dá)效率和熱穩(wěn)定性。最后，我們用MOI為100的腺病毒rAd5-STNFRII-gAD-opti感染轉(zhuǎn)瓶里的細(xì)胞，多次收集上清以大量制備蛋白sTNFRII-gAD-opti。利用純化出的蛋白sTNFRII-gAD-opti分析超速離心和進(jìn)行生物大分子之間的相互作用，比較這種蛋白和未改構(gòu)的蛋白sTNFRII-gAD之間的生物學(xué)活性。發(fā)明詳述本發(fā)明是中國專利(專利號ZL200510100468.9)的進(jìn)一步延伸。首先，為了進(jìn)一步提高重組蛋白sTNFRII-gAD(序列見專利ZL200510100468.9)的穩(wěn)定性，增加三聚體蛋白的含量，我們對原專利(ZL200510100468.9)中描述的原專利中sTNFRII-gAD融合蛋白的基因進(jìn)行了改造去除冗余序列。在設(shè)計(jì)上去掉融合基因中脂聯(lián)素的膠原區(qū)和連接部位的酶切位點(diǎn)，一共18個(gè)堿基,具體為aagcttcctggagaaggt,其編碼的6個(gè)氨基酸的相應(yīng)的氨基酸序列為Lys-Leu-Pro-Gly-Glu-Gly,其中Lys-Leu為HindIII位點(diǎn)，Pro-Gly-Glu-Gly為脂聯(lián)素的膠原區(qū)蛋白。這樣操作處理后,融合蛋白的氨基酸數(shù)量由原來的400個(gè)變成本案的394個(gè)。用重疊延伸PCR方法(見實(shí)施例I)獲得了只含有sTNFRII基因和脂聯(lián)素球部基因的新的融合基因sTNFRII-gAD-new，基因序列見(SEQIDNO.I)。氨基酸序列見(SEQIDNO.2)。這樣做可以使其三聚體化的表達(dá)產(chǎn)物獲得更高的穩(wěn)定性。此外，本發(fā)明還將原專利中的原核表達(dá)系統(tǒng)改換成哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。為了提高融合蛋白的表達(dá)水平，適應(yīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)特點(diǎn)，我們按照哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的偏愛密碼子合成了改構(gòu)后的蛋白的編碼基因，將這個(gè)優(yōu)化后的基因稱為sTNFRII-gAD-opti，基因序列見(SEQIDNO.3)。目前，利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)高生物學(xué)活性的蛋白是獲得重組蛋白最為廣泛的方式。其中應(yīng)用最普遍的是CHO/dhfr-表達(dá)系統(tǒng)。CHO細(xì)胞很少分泌內(nèi)源蛋白，這比較有利于外源蛋白的表達(dá)和分離純化。而且，這樣表達(dá)的外源蛋白能最大限度地保持天然的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。所以CHO表達(dá)系統(tǒng)常用于長期穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白(MaryP.Rossera,WeiXiab,StevenHartsellc，etal.TransienttransfectionofCHO-Kl-Susingserum-freemediuminsuspensionarapidmammalianproteinexpressionsystem.ProteinExpressionandPurification.Volume40，Issue2，April2005，Pages237-243)。這樣的策略的不利方面是，為獲得高效、穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白的CHO細(xì)胞株，需要進(jìn)行漫長的CHO細(xì)胞株加壓過程，不能滿足短期快速得到蛋白純品的要求。本研究采用了BHK_21/c022株細(xì)胞作為重組蛋白的生產(chǎn)細(xì)胞。BHK_21/c022細(xì)胞是我們從BHK21細(xì)胞中單克隆化挑選并且無血清馴化的懸浮適應(yīng)細(xì)胞株，具有生長迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，抗凋亡能力強(qiáng)，既可以在含有血清的培養(yǎng)液中貼壁生長，又可以在無血清的培養(yǎng)液中懸浮生長等特點(diǎn)。(見實(shí)施例7)。為了比較sTNFRII-gAD、sTNFRII-gAD-new和sTNFRII-gAD-opti三種融合基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)特性和表達(dá)水平，本案建立了一種重組5型腺病毒載體/BHK-21/c022細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用于快速表達(dá)和制備融合蛋白。該表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)安全性好、高效感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞、高效表達(dá)外源基因，感染的細(xì)胞在不需要轉(zhuǎn)染和加壓篩選的情況下能高效而長時(shí)間的表達(dá)外源基因，有利于快速制備目的蛋白。為了獲得攜帶目的蛋白基因的腺病毒，我們將3種基因(sTNFRII-gAD、sTNFRII-gAD-new和sTNFRII-gAD-opti等基因)分別插入腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316(Microbix公司)中，構(gòu)建成pDC316_sTNFRII-gAD、pDC316-sTNFRII-gAD_new和pDC316-sTNFRII-gAD-opti(見實(shí)施例3)。然后我們用AdMax腺病毒載體系統(tǒng)制備攜帶上述融合基因的重組復(fù)制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD、rAd5-sTNFRII-gAD-new和rAd5-sTNFRII-gAD_opti(見實(shí)施例4)。腺病毒載體最多見用于基因治療和疫苗研究中，也有報(bào)道用腺病毒載體感染HEK293細(xì)胞來制備重組蛋白(Invitrogen公司)。用復(fù)制缺陷型5型腺病毒感染HEK293細(xì)胞過程中，不僅重組腺病毒能高效復(fù)制和產(chǎn)生子代病毒，外源基因也得到高效表達(dá)。但是對于制備重組蛋白而言，重組腺病毒的高效復(fù)制和子代病毒的產(chǎn)生有2個(gè)方面的缺陷1)生產(chǎn)細(xì)胞會因病毒大量復(fù)制而出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)，因此只能一次性感染收獲上清；2)腺病毒復(fù)制產(chǎn)生大量的病毒自身蛋白和子代病毒對于下游純化是多余的“雜質(zhì)”，因而對于生產(chǎn)細(xì)胞而言也是不必要的額外負(fù)擔(dān)。因此本發(fā)明利用不能支持El缺陷的重組腺病毒復(fù)制的細(xì)胞BHK-21/c022作為生產(chǎn)細(xì)胞，建立了重組腺病毒/BHK21表達(dá)系統(tǒng)。首先，我們用攜帶EGFP報(bào)告基因的重組腺病毒rAd5-EGFP感染BHK_21/c022細(xì)胞，檢測了感染復(fù)數(shù)與表達(dá)水平的關(guān)系(見實(shí)施例6)。結(jié)果表明隨著腺病毒用量(MOI)的增高，表達(dá)EGFP蛋白的BHK-21/c022細(xì)胞數(shù)量和亮度明顯增加；Μ0Ι在O至100之間被感染的BHK-21/c022細(xì)胞未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，MOI為1000時(shí)可觀察到細(xì)胞變圓和少量死亡現(xiàn)象。在證明了BHK_21/c022可以被腺病毒高效感染后，我們用腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD、rAd5-sTNFRII-gAD-new和rAd5-sTNFRII-gAD_opti以MOI為1000感染BHK-21/c022細(xì)胞，換成無血清培養(yǎng)液后48小時(shí)收取上清。為了比較三種蛋白的表達(dá)水平，我們將三種蛋白做westernblotting分析(見實(shí)施例8)。通過比較,我們看出經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的基因sTNFRII-gAD-opti表達(dá)的蛋白水平明顯提高，大約46倍。經(jīng)過優(yōu)化的基因有助于表達(dá)效率的提聞。為了比較三種蛋白的熱穩(wěn)定性，將三種蛋白置于37°C水浴中72小時(shí)，之后再經(jīng)過westernblotting分析，結(jié)果未經(jīng)改造的融合蛋白出現(xiàn)了降解，即sTNFRII-gAD在sTNFRII和gAD在連接處出現(xiàn)斷裂(sTNFRII抗體檢測出一條降解條帶，見圖7)，經(jīng)過改造的sTNFRII-gAD-new和sTNFRII-gAD-opti則沒有見到降解的條帶。說明改構(gòu)的蛋白sTNFRII-gAD-new和sTNFRII-gAD-opti的熱穩(wěn)定性明顯高于未改構(gòu)的sTNFRII-gAD。雖然腺病毒MOI為1000時(shí)蛋白的產(chǎn)量高，但是對細(xì)胞的傷害較大，不能連續(xù)多次收取上清，為了快速制備較大量的目的蛋白，我們用以MOI為100的rAd5-sTNFRII-gAD-opti感染轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的BHK_21/c022細(xì)胞以收獲蛋白。每個(gè)轉(zhuǎn)瓶待細(xì)胞長滿后改換無血清培養(yǎng)液，每48h收獲上清一次并換液，反復(fù)6次收取培養(yǎng)上清。將上清收集后，經(jīng)過硫酸銨濃縮、分子篩柱層析、透析等步驟濃縮和純化sTNFRII-gAD-opti融合蛋白(見實(shí)施例10)。我們通過改構(gòu)前后的sTNFRII-gAD-opti融合蛋白和sTNFRII-gAD融合蛋白拮抗TNFa，減少TNFa對L929細(xì)胞的殺傷作用來體外比較兩種蛋白的生物學(xué)活性。TNFa對細(xì)胞有直接的殺傷作用，加入我們的制備的目的蛋白后，TNFa能被拮抗掉，不能對L929細(xì)胞起到殺傷作用。細(xì)胞通過四唑鹽(MTT)比色法，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，二甲亞砜(DMSO)能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色的結(jié)晶物，溶液顏色的深淺與所含甲瓚量成正比，再用酶標(biāo)儀測定OD值，以此測得成活的細(xì)胞數(shù)。通過比較，改構(gòu)后蛋白sTNFRII-gAD-opti的生物學(xué)活性是改構(gòu)前蛋白sTNFRII-gAD的3-4倍(見實(shí)施例11)。為了證明我們所得到的蛋白是三聚體，我們將純化好的蛋白sTNFRII-gAD-opti做分析超速離心(AnalyticalUltra-centrifuge)(見實(shí)施例12)。離心作為一種手段，具有許多優(yōu)點(diǎn)。例如，超速離心是在低溫下操作，保護(hù)了生物大分子的活性。制備型的離心機(jī)負(fù)載量大，一次可分離提純幾克樣品，比層析、電泳上的樣品量大得多。分析離心機(jī)不僅可測物質(zhì)的分子量，最重要的特性是它可以檢驗(yàn)物質(zhì)的純度、構(gòu)象、沉降系數(shù)等。因此離心技術(shù)在生物學(xué)研究中占有重要的地位，是分離、純化細(xì)胞、病毒、蛋白、核酸和酶的最方便最有效的工具。本案利用分析離心的這一特點(diǎn)，最終得到提供蛋白質(zhì)的分子量是159kD，大約是單體蛋白52kD的三倍，該結(jié)果可以證明，本案所構(gòu)建的融合蛋白的基因的表達(dá)產(chǎn)物確實(shí)可以在體內(nèi)借助脂聯(lián)素球部的作用形成三聚體。此外，為了比較我們設(shè)計(jì)的三聚體化的融合蛋白sTNFRII-gAD-opti和現(xiàn)在已經(jīng)上市的二聚體化的sTNFRII-Fc融合蛋白(商品名Etanercept)與TNFα的親和力的差異，我們還利用儀器BIAC0RE3000對我們制備的蛋白sTNFRII-gAD-opti進(jìn)行生物大分子之間的相互作用分析。結(jié)果分析顯示結(jié)合相同摩爾質(zhì)量的TNFa，sTNFR-Fc的用量約為sTNFRII-gAD-opti的2.4倍(見實(shí)施例13)。即用較少的sTNFRII-gAD-opti蛋白，就可以起到與sTNFR-Fc相同的效果。由此我們推測，蛋白sTNFRII-gAD-opti可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，并且可以使用較少的劑量，從而獲得更好的治療效果。圖I:可溶性腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部融合基因(sTNFRII-gAd-new)改構(gòu)不意圖。圖中，I是改構(gòu)如的不意圖，II是改構(gòu)后的不意圖。A是彳目號妝,B是sTNFRII基因，C是HindIII酶切位點(diǎn)，D是膠原序列，E是gAD基因。圖2:pDC316-sTNFRII-gAD-new質(zhì)粒的酶切鑒定。I是pDC316-sTNFRII-gAD_new質(zhì)粒；2是用XbaI和HindIII雙酶切pDC316_sTNFRII-gAD得到的大小為3777bp和1327bp的基因片段；3是用SalI和EcoRI雙酶切pDC316-sTNFRII-gAD_new質(zhì)粒得到3883bp和1221bp的基因片段；4是DNAmarker。圖3:共轉(zhuǎn)染pDC316-sTNFRII-gAD_new和pBHGlox(delta)El，3Cre后產(chǎn)生重組腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD_new。圖4:不同MOI的rAd5-EGFP對BHK21c022細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。A是熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果，B是電子顯微鏡下觀察的結(jié)果I到5的MOI分別為0，1，10，100，1000。圖5BHK21c022單克隆細(xì)胞。圖6:重組腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD、Ad5-sTNFRII-gAD-new和Ad5-sTNFRII-gAD-opti感染BHK_21/c022細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中蛋白westernblotting檢測。I是Ad5-sTNFRII-gAD感染細(xì)胞得到的蛋白；2是Ad5-sTNFRII-gAD-new感染細(xì)胞得到的蛋白；3是蛋白Marker;4是Ad5-sTNFRII-gAD-0pti感染細(xì)胞得到的蛋白。A所指就是目的蛋白sTNFRII-gAD。圖7:融合蛋白sTNFRII-gAD的熱穩(wěn)定性檢測(sTNFRII抗體檢測)。A所指是三聚體目的蛋白，B是單體目的蛋白，C是降解的條帶。圖8sTNFRII-gAD-opti融合蛋白的分子篩層析。峰I是蛋白sTNFRII-gAD-opti多聚體峰；峰2是蛋白sTNFRII-gAD-opti的三聚體峰。圖9:融合蛋白超速分析離心結(jié)果。圖10:融合蛋白親合力測定結(jié)果。圖11:改構(gòu)前后蛋白的生物學(xué)活性比較。橫軸是倍比稀釋的蛋白濃度，A是100ng/mL,B是50ng/mL,C是25ng/mL,D是12.5ng/mL,E是6.25ng/mL,F是3.85ng/mL,G是I.925ng/mL,H是0.9625ng/mL?？v軸是酶標(biāo)儀在570nm處的吸光度(OD)。圖12pDC316質(zhì)粒圖。圖13:pDC316-sTNFRII-gAD質(zhì)粒圖。以下實(shí)施例對本發(fā)明的腺病毒載體介導(dǎo)的重組蛋白快速表達(dá)和制備過程作了詳細(xì)說明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例IsTNFRII-gAD-new融合基因的制備將中國專利(專利號ZL200510100468.9)中描述的可溶性腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部融合基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造去掉了可溶性腫瘤壞死因子受體和脂聯(lián)素之間的酶切位點(diǎn)以及脂聯(lián)素除球部之外的膠原序列AAGCTTCTTCCACAAGGT，使整個(gè)融合基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更加緊湊，有利于三聚體的形成(見圖I)。利用重疊PCR的方法，設(shè)計(jì)以下引物將原序列中的酶切位點(diǎn)和膠原序列突變掉。設(shè)計(jì)引物為Pl:5，aatgtcgacgccaccatggcgcccgtcgccgtc3，P2:5，gcggtatacataggcgtcgccagtgctccc3，P3:5，cggggatccttagttggtgtcatggta3，P4:5，gggagcactggcgacgcctatgtataccgc3，Pl和P2為擴(kuò)增sTNFRII的引物，P3和P4為擴(kuò)增gAD的引物，兩個(gè)反應(yīng)體系在如下的循環(huán)條件下反應(yīng)25個(gè)循環(huán)變性95°C5min,94°C30s,59°C30s,72°Clmin，延伸72°CIOmin0將兩個(gè)反應(yīng)體系的PCR產(chǎn)物膠回收，利用天根膠回收試劑盒，按照說明書膠回收目的片段。膠回收后的sTNFRII和gAD片段再通過PCR反應(yīng)將兩段連接在一起。使用的反應(yīng)引物為Pl和P3。在下述的反應(yīng)條件下循環(huán)反應(yīng)25個(gè)循環(huán)變性95°C5min，94°C30s，59°C30s,72°Clminl5s，延伸72°CIOmin0得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物在I%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，在1200bp左右有一條很亮的條帶，與預(yù)期的1185bp的目的產(chǎn)物的大小相似。利用天根的膠回收試劑盒把目的片段回收。共得到sTNFRII-gAD-new的DNA約3微克。實(shí)施例2sTNFRII-gAD-opti融合基因的制備sTNFRII-gAD-opti融合基因是根據(jù)我們提供的氨基酸序列(SEQIDNO.2)，請德國GeneArt公司依據(jù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(CH0細(xì)胞)偏愛的密碼子優(yōu)化合成基因片段，并克隆到載體上獲得pMA-sTNFRII-gAD-opti。實(shí)施例3穿梭質(zhì)粒pDC316-sTNFRII-gAD，pDC316-sTNFRII-gAD_new和pDC316-sTNFRII-gAD-opti的構(gòu)建，酶切鑒定和質(zhì)粒的提取。用BamHI、SalI雙酶切融合基因sTNFRII-gAD和sTNFRII-gAD-new，這兩個(gè)基因都是第一個(gè)實(shí)施例中回收的DNA。再用BglII和SalI雙酶切載體pDC316(見圖12)。BamHI和BglII是同尾酶，有相同的粘性末端，可以通過其粘性末端之間的互補(bǔ)作用彼此連接起來。用T4連接酶將上述目的基因片段和PDC316片段連接，得到重組穿梭質(zhì)粒pDC316-sTNFRII-gAD和pDC316-sTNFRII-gAD-new(見圖13)。并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒。用BglII和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pMA-sTNFRII-gAD-opti和載體pDC316，用T4連接酶將上述目的基因片段和pDC316片段連接，得到重組穿梭質(zhì)粒pDC316-sTNFRII-gAD-opti。然后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒。質(zhì)粒分別用XbaI，HindIII和SalI,EcoRI酶切鑒定。(見圖2)感受態(tài)的制備(I)從37°C培養(yǎng)1620h的新鮮平板中挑取一個(gè)DH5α單菌落(直徑23mm)接種于5mL的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1618小時(shí)。將培養(yǎng)好的菌液按I:100的比例接種于200mL的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD6tltl=O.3O.4。(2)菌液放入50mL無菌離心管中，冰浴IOmin后,4000rpm,4°C,離心lOmin。(3)棄上清，倒置浙干。以IOmL用冰浴冷的O.IMCaCl2重懸離心管中沉淀。(4)4000rpm,4°C,離心IOmin,棄上清，浙干。(5)每50mL初始培養(yǎng)物加入2mL用冰預(yù)冷的O.IMCaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀。(6)取200μL分裝到I.5mLEP管中。保存于4°C備用，或于_70°C長期保存。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(I)取感受態(tài)細(xì)胞50yL，加入連接液5yL，混勻，冰浴30min。(2)42°C熱擊90s，不要搖動(dòng)試管。(3)快速將管轉(zhuǎn)移至冰水中，使細(xì)胞冷卻2min。(4)加入LB150yL，放置于搖床中，200轉(zhuǎn)/分，45min。(5)將上述菌液200μL均勻涂布在預(yù)制干燥的含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C，過夜。質(zhì)粒提取從氨芐抗性的LB固體平板上挑取單菌落，接種于含有氨芐抗性的LB液體中，37°C培養(yǎng)過夜。按質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取質(zhì)粒。I%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒抽提的濃度和純度。實(shí)施例4重組腺病毒的制備將腺病毒基因組質(zhì)粒pBHGlox(delta)El，3Cre分別和pDC316_sTNFRII-gAD，pDC316-sTNFRIΙ-gAD-new,pDC316-sTNFRII-gAD_opti共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，用磷酸鈣共沉淀法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種HEK293細(xì)胞，5XIO5個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)染前46h換新鮮培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基)；取4μg的DNA與水混合成總體積為67.5μL的液體加入到EP管中。然后加入2.5ΜCaCl27.5μL,混勻后在4°C孵育20min;向EP管中貼壁加入2XHBS(4°C保存)75μL，輕柔地混勻后室溫靜置5min。最后將150μL液體加入準(zhǔn)備好的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕混勻。鏡下觀察可以看到十分細(xì)小而均勻的顆粒；37°C5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。9d后見到病毒噬斑，分別收集病變細(xì)胞和上清作為Ad5-sTNFRII-gAD，Ad5-sTNFRII-gAD_new，Ad5-sTNFRII-gAD-opti的毒種。(見圖3)實(shí)施例5重組腺病毒的擴(kuò)增與純化將獲得的Ad5-sTNFRII-gAD毒種，Ad5-sTNFRII-gAD_new毒種和Ad5-sTNFRII-gAD-opti的毒種在HEK293細(xì)胞上進(jìn)行擴(kuò)增和純化，得到滴度為IX1012vg/mL的純化病毒。用TCID50方法測定腺病毒的感染性滴度。實(shí)施例6Ad5-EGFP對BHK_21/c022細(xì)胞的感染在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種BHK-21/c022細(xì)胞(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基)，IXIO5個(gè)細(xì)胞/孔，同時(shí)按梯度加入重組腺病毒Ad5-EGFP(Μ0Ι分別為O、I、10、100、1000)，共5個(gè)孔。12h后換成無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，熒光顯微鏡下觀察，在相同的曝光時(shí)間(l/3s)觀察各孔中細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱以及細(xì)胞的形態(tài)變化。隨著MOI的增大，熒光細(xì)胞數(shù)量和亮度逐漸增強(qiáng)，表明腺病毒載體能夠有效轉(zhuǎn)染BHK-21/c022細(xì)胞，并且表達(dá)量與病毒用量呈正相關(guān)。但在MOI達(dá)到1000時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞變長、少數(shù)細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。(見圖4)實(shí)施例7BHK-21/c022細(xì)胞單克隆的挑取將貼壁的BHK21細(xì)胞消化后，用4倍比稀釋法將細(xì)胞稀釋，加入到6孔板中，使每個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)5-10個(gè)。待細(xì)胞貼壁后繼續(xù)生長3-4天，就會在電鏡下看到成簇的細(xì)胞團(tuán)，那是由單個(gè)細(xì)胞增殖生長而來。然后將培養(yǎng)的上清吸出，鋪入瓊脂(5%瓊脂培養(yǎng)基約為I8)使細(xì)胞固定于孔板底部。之后在顯微鏡下用槍頭吸取一個(gè)成簇的細(xì)胞團(tuán)，加入到96孔板中培養(yǎng)，這一個(gè)96孔中擴(kuò)增出的細(xì)胞就可以看做是由一個(gè)細(xì)胞分裂而來，他們的各種特征都是相同的穩(wěn)定的。我們共挑取了90個(gè)單克隆細(xì)胞(c001-c090)，觀察他們的生長形態(tài)和生長速度，最終選擇了c022作為腺病毒感染的細(xì)胞。(見圖5)實(shí)施例8重組腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD，Ad5-sTNFRII-gAD-new,Ad5-sTNFRII-gAD-opti感染BHK_21/c022細(xì)胞和蛋白和westernblotting檢測用MOI為1000的重組腺病毒Ad5_sTNFRII-gAD感染BHK_21/c022細(xì)胞，12h后換成無血清培養(yǎng)基。48h后收取細(xì)胞無血清培養(yǎng)上清。將上清和無水乙醇按I:3的比例混合到一起，-70°C放置半個(gè)小時(shí)。13000r/min離心5min。倒掉上清，用少量(一般為收取上清體積的十分之一)PBS溶液溶解沉淀,用于westernblotting實(shí)驗(yàn)。重組腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD-new和Ad5-sTNFRII-gAD-opti用相同的方法操作，收集上清，濃縮的蛋白后用于westernblotting檢測。(見圖6)取濃縮10倍的上清10μL加入10μL2Xloadingbuffer，一共20μL。100°C沸水煮5min，20μL樣品上樣，12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分離，然后用濕膠轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜。取出NC膜，用封閉液(5%脫脂牛奶，PBS配制)37°C封閉NC膜lh。棄去封閉液，加入I:500(用封閉液稀釋)的鼠抗人TNFRII的單抗，37°C孵育lh。PBS洗滌NC膜3次后，加入I1000(用封閉液稀釋)的馬抗小鼠IgG/磷酸酶標(biāo)記抗體37°C孵育lh。PBS洗滌NC膜3次后，加入BCIP/NBT,避光顯色。約1530min后棄去顯色液，用超純水洗滌NC膜中止反應(yīng)。結(jié)果顯示，經(jīng)過哺乳動(dòng)物細(xì)胞密碼子優(yōu)化后的基因表達(dá)效率高于未優(yōu)化的。實(shí)施例9三種蛋白的穩(wěn)定性比較將三種腺病毒表達(dá)的蛋白置于37度水浴中72小時(shí),然后做westernblotting檢測各種蛋白的存在狀態(tài)。結(jié)果顯示未經(jīng)過改構(gòu)的蛋白，有一條降解的條帶，是sTNFRII和gAD在連接處斷裂的條帶，經(jīng)sTNFRII抗體檢測出，而經(jīng)過改構(gòu)的蛋白沒有降解的條帶，大大提高了目的蛋白的穩(wěn)定性，為下一步的純化提供了基礎(chǔ)。(見圖7)實(shí)施例10sTNFRII-gAD-opti蛋白大量生產(chǎn)和蛋白的濃縮、純化用MOI為100的rAd5-sTNFRII-gAD-opti感染5個(gè)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的BHK_21/c022細(xì)胞來大量制備sTNFRII-gAD-opti融合蛋白。每個(gè)轉(zhuǎn)瓶加無血清培養(yǎng)液IOOmL,每48h收獲上清一次并換液，反復(fù)6次收取培養(yǎng)上清。共得到約3L含有融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清。向上清中緩慢均勻的加入硫酸銨粉末(w/v=40%)o用磁力攪拌器在4°C冷庫中攪拌24h，13000g,Ih離心后棄去上清。用少量的PBS溶解沉淀(35mL)。然后將溶液進(jìn)行透析，除去多余的硫酸銨，得到重組融合蛋白的粗純品。依據(jù)Hiload16/60Superdex200prepgrade的說明書對得到的粗純品進(jìn)行凝膠過濾層析。將層析后各個(gè)收集峰進(jìn)行免疫印跡分析，收集含有目標(biāo)融合蛋白的峰合并獲到融合蛋白純品。(見圖8)實(shí)施例11改構(gòu)前后融合蛋白的活性比較96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪入L929細(xì)胞，I.5I.8XIO4個(gè)細(xì)胞/孔，37°C5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天，分別將sTNFRII-gAD融合蛋白和sTNFRII-gAD-opti融合蛋白純品，用含放線菌素D20μg/mL,TNFa20U/mL的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行2倍比梯度稀釋，各稀釋8個(gè)梯度；棄去96孔板中L929細(xì)胞的上清，加入前面已倍比稀釋好的兩種蛋白樣品，每孔100μL，每個(gè)梯度做3個(gè)復(fù)孔；同時(shí)加入放線菌素D20μg/mL與TNFa20U/mL的DMEM培養(yǎng)液(兩者結(jié)合殺傷性最大)作為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，再培養(yǎng)4h后，將96孔中的120μL液體吸出，換入100μLDMSO終止培養(yǎng)。檢測各孔的OD5ro值。(見圖11)實(shí)施例12融合蛋白的分析超速離心我們將純化好的蛋白sTNFRII-gAD-opti拿到中國科學(xué)院生物物理所做分析超速離心。將過分子篩純化后得到的蛋白超速分析離心，58000轉(zhuǎn)/分鐘，離心三個(gè)小時(shí)，結(jié)果測得三聚體蛋白的分子量大小是159.7kD。(見圖9)實(shí)施例13融合蛋白親和力BIAC0RE實(shí)驗(yàn)我們還在中科院生物物理所利用BIAC0RE3000做生物大分子之間的相互作用分析，將過分子篩純化后得到的sTNFRII-gAD-opti蛋白與sTNFRII-Fc相比較同腫瘤壞死因子的親和力?！ぞ唧w步驟如下(I)將芯片CM5用PBST(PBS+0.005%TWEEN)沖洗兩遍，100μL/min，5min。(2)NHS、EDC各取60μL混勻，10μL/min,共注射70μL0(3)用PH=4·O的IOMmNaAc稀釋TNFα，得到50μg/mL的TNFα，10μL/min,共注射35μLo(4)封閉液ΕΤΗ(乙醇胺)10μL/min，共注射70μL。至此，蛋白TNFa偶聯(lián)到芯片上，準(zhǔn)備工作完成。(5)開始上樣,首先注射融合蛋白，30μL/min,lmin。(6)然后洗脫，20mM的NaOH30μL/min，共注射12μL。(7)最后平衡，PBST30μL/min，共注射20μL0(8)繼續(xù)注射下一個(gè)樣品，步驟同(5)。從結(jié)果中可以看到TNFR-Fc和TNFa結(jié)合的上升階段比較平緩，證明結(jié)合能力相對強(qiáng)，但是下降的迅速，說明解離快。而sTNFRII-gAD-opti和TNFα結(jié)合上升的比較緩慢，結(jié)合能力相對較弱，但下降比較平緩，解離過程比較慢。(見圖10)經(jīng)軟件分析，可以得出sTNFRII-gAD-opti與TNFα的親和力約為5.63nm,而TNFR-Fc與TNFa的親和力約為13.4nm。即結(jié)合相同摩爾質(zhì)量的TNFa,TNFR-Fc的用量約為sTNFRII-gAD-opti的2.4倍。序列表〈110〉溫州醫(yī)學(xué)院〈110〉北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司〈120〉腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部融合蛋白改構(gòu)體快速篩選方法及應(yīng)用<160>3<210>1<211>1185<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉改構(gòu)的可溶性腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部(sTNFRII-gAD-new)融合基因SEQIDN0.I〈400〉Iatggcgcccgtcgccgtctgggccgcgctggccgtcggactggagctctgggctgcggcg60cacgccttgcccgcccaggtggcatttacaccctacgccccggagcccgggagcacatgc120cggctcagagaatactatgaccagacagctcagatgtgctgcagcaaatgctcgccgggc180caacatgcaaaagtcttctgtaccaagacctcggacaccgtgtgtgactcctgtgaggac240agcacatacacccagctctggaactgggttcccgagtgcttgagctgtggctcccgctgt300agctctgaccaggtggaaactcaagcctgcactcgggaacagaaccgcatctgcacctgc360aggcccggctggtactgcgcgctgagcaagcaggaggggtgccggctgtgcgcgccgctg420cgcaagtgccgcccgggcttcggcgtggccagaccaggaactgaaacatcagacgtggtg480tgcaagccctgtgccccggggacgttctccaacacgacttcatccacggatatttgcagg540ccccaccagatctgtaacgtggtggccatccctgggaatgcaagcatggatgcagtctgc600acgtccacgtcccccacccggagtatggccccaggggcagtacacttaccccagccagtg660tccacacgatcccaacacacgcagccaactccagaacccagcactgctccaagcacctcc720ttcctgctcccaatgggccccagccccccagctgaagggagcactggcgacgcctatgta780taccgctcagcattcagtgtgggattggagacttacgttactatccccaacatgcccatt840cgctttaccaagatcttctacaatcagcaaaaccactatgatggctccactggtaaattc900cactgcaacattcctgggctgtactactttgcctaccacatcacagtctatatgaaggat960gtgaaggtcagcctcttcaagaaggacaaggctatgctcttcacctatgatcagtaccag1020gaaaataatgtggaccaggcctccggctctgtgctcctgcatctggaggtgggcgaccaa1080gtctggctccaggtgtatggggaaggagagcgtaatggactctatgctgataatgacaat1140gactccaccttcacaggctttcttctctaccatgacaccaactaa1185<210>2<211>394<212>PR0TEIN〈213〉人工序列〈220〉〈223〉改構(gòu)的可溶性腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部(sTNFRII-gAD-new)的氨基酸序列SEQIDNO.2<400>2MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPG60QHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTC120RPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICR180PHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTS240FLLPMGPSPPAEGSTGDAYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKF300HCNIPGLYYFAYHITVYMKDVKVSLFKKDKAMLFTYDQYQENNVDQASGSVLLHLEVGDQ360VWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDTN394<210>3<211>1215<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉改構(gòu)后的蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的偏愛密碼子sTNFRII-gAD-opti融合基因SEQIDNO.3<400>3gagctcgaattcgccaccatggcccccgtggccgtgtgggccgctctggctgtgggactg60gaactgtgggctgccgctcacgctctgcctgctcaggtggccttcaccccctacgcccct120gagcctggctctacctgccggctgagagagtactacgaccagaccgcccagatgtgctgc180tccaagtgctcccctggccagcacgccaaggtgttctgcaccaagacctccgataccgtg240tgcgactcctgcgaggactccacctacacccagctgtggaactgggtgcccgagtgcctg300tcctgcggctccagatgctcctccgaccaggtggaaacccaggcctgcaccagagagcag360aaccggatctgcacctgtcggcctggctggtactgcgccctgtccaagcaggaaggctgc420agactctgcgcccctctgcggaagtgcagacctggcttcggcgtggccagacccgggacc480gagacatctgacgtcgtgtgcaagccctgtgcacctggcaccttctccaacaccacctcc540tccaccgacatctgccggcctcaccagatttgcaacgtggtggccatccccggcaacgcc600tccatggacgccgtgtgcacctccacatcccccaccagatccatggcccctggcgccgtc660catctgcctcagcctgtgtctacccggtcccagcacacccagcctacccccgaaccttct720accgccccctctaccagcttcctgctgcccatggggcctagtcctccagctgagggctct780accggcgacgcctacgtgtacagatccgccttctccgtgggcctggaaacctacgtgacc840atccccaacatgcccatccggttcaccaagattttctacaaccagcagaaccactacgac900ggctccaccggcaagttccactgcaacatccctggcctgtactacttcgcctaccacatc960accgtgtacatgaaggacgtgaaggtgtccctgttcaagaaagacaaggccatgctgttc1020acctacgaccagtaccaggaaaacaacgtcgaccaggcctccggctccgtgctgctgcat1080ctggaagtgggcgaccaggtctggctgcaggtctacggcgagggcgagcggaatggcctg1140tacgccgacaacgacaacgactctaccttcaccggctttctgctgtaccacgacaccaac1200tgaagatctggtacc121權(quán)利要求1.本發(fā)明描述了ー種經(jīng)改構(gòu)了的腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部的融合蛋白，其技術(shù)特征是去掉了原腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部之間的酶切位點(diǎn)和膠原序列，其三聚體化的基因表達(dá)重組蛋白的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。2.依據(jù)權(quán)利要求1，經(jīng)改構(gòu)了的腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部的融合蛋白的編碼基因經(jīng)過了哺乳動(dòng)物細(xì)胞偏愛密碼子優(yōu)化，其表達(dá)系統(tǒng)采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。3.依據(jù)權(quán)利要求1，經(jīng)改構(gòu)了的腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部的融合蛋白的表達(dá)使用重組5型腺病毒載體/BHK-21/c022細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，以便于快速表達(dá)和制備融合蛋白。4.依據(jù)權(quán)利要求1，經(jīng)改構(gòu)了的腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部的融合蛋白應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。5.依據(jù)權(quán)利要求3，含有經(jīng)改構(gòu)了的腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部的融合蛋白的重組5型腺病毒載體應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。全文摘要本發(fā)明改構(gòu)了可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ-“脂聯(lián)素”球部重組融合蛋白的基因序列，去除了腫瘤壞死因子受體Ⅱ和“脂聯(lián)素”球部基因間的冗余序列，共去除18個(gè)氨基酸，形成了只含有可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ和“脂聯(lián)素”球部的新的基因；并合成了改造后的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的偏愛密碼子。經(jīng)過比較，改構(gòu)后的基因表達(dá)的蛋白更加穩(wěn)定，優(yōu)化的密碼子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)效率提高約4-6倍。本發(fā)明還建立了一種快速大量獲得蛋白的腺病毒/BHK21表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)規(guī)模易于放大，適應(yīng)無血清培養(yǎng)，可以反復(fù)多次收獲目標(biāo)蛋白，成功制備了有生物學(xué)活性的改造后的融合蛋白。文檔編號C12N15/861GK102690353SQ201110073658公開日2012年9月26日申請日期2011年3月25日優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日發(fā)明者劉丹,吳小兵,董小巖,陸月,高基民申請人:北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司,溫州醫(yī)學(xué)院