專利名稱：融合蛋白tetph、表達載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及融合蛋白TETPH、表達載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
肺癌，尤其非小細胞肺癌是人類發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤之一，近年來，生物技術(shù)給惡性腫瘤的治療開辟了新途徑。腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor, TNF)相關(guān)凋亡誘導配體 (TNF-relatedapoptosis inducing ligand, Trail)基因，1995 年，首次由 Wiley 等 (Wiley SR, SchooleyK, Cmolak PJ, et al. Identification and characterization of a new member of the TNFfamily that induce apoptosis[J]. Immunity,1995,16 (6) 673_821.)發(fā)現(xiàn)并克隆，Pitti 等(Pitti RM,Marsters SA, Ruppert S et al. Induction of apop tosis by Apo_2 ligand, anew member of the tumor necrosis factor cytokine family [J], J B ioChem，1996，271 (22) :12687-90.)于 1996 年也克隆到同樣的基因，而命名為Apo-2L。Trail基因是第3個TNF家族分子，存在于胎盤、肺、腎、脾、外周淋巴等組織的細胞中，在誘導瘤細胞凋亡方面具重要作用。人Trail分子cDNA長ll(^bp，其分子質(zhì)量為32. 5kD，編碼281個氨基酸，等電點為7.63，屬II型跨膜蛋白。C端(胞外區(qū))保守性強度與!^asL和TNF相當，N端(胞內(nèi)區(qū))無信號肽，是TNF超家族成員。它的15 40位氨基酸殘基為疏水區(qū)能形成跨膜結(jié)構(gòu)(Falschlehner C, Schaefer U, Walczak H. Following TRAIL' s path in the immunesystem[J] · Immunology，2009，127 O) : 145-54.)，天然狀態(tài)以三聚體方式行使作用。其109位為一 N2糖基化位點，金屬蛋白酶能將它從膜上切下形成可溶性肽(114 281位氨基酸)，即可溶性Trail (sTrail)。在體外，膜結(jié)合型Trail 及sTrail都可誘使多種腫瘤細胞凋亡(Ma H, Liu YX, Liu S L, et al IRecombinant adeno-associated virusmediated TRAIL gene therapy supp resses livermetastatic tumor [J], Int J Cancer，2005，116 :314-211.)。 sTrail 與其受體結(jié)合后啟始胞內(nèi)信號。 其受體有二，一是其胞漿結(jié)構(gòu)域不完整或無胞漿結(jié)構(gòu)域，以無功能截斷形式存在，與sTrail 結(jié)合后不傳遞死亡信號，稱誘騙受體(sTrail_R3/DCRl與sTrail-RVDCI^)；另一是具胞漿死亡結(jié)構(gòu)域，與sTrail結(jié)合后，經(jīng)該死亡結(jié)構(gòu)域激發(fā)傳遞凋亡信號，使Caspase蛋白發(fā)生酶解級聯(lián)反應(yīng)，使細胞凋亡，稱死亡受體(sTrail-Rl/DR4與Trail_R2/DR5)。大多數(shù)正常細胞表達DCRl、DCR2、DR4、DR5，瘤細胞卻僅見DR4與DR5表達，正常細胞的死亡受體與誘騙受體同sTrail競爭性結(jié)合，以躲避死亡攻擊。腫瘤細胞由于無誘騙受體，易受sTrail攻擊而發(fā)生凋亡(Zou YX, ZhangXD, Mao Y, et al. Acute toxicity of a single dose DATR, recombinant soluble humanTRAIL mutant, in rodents and crab-eating macaques[J]. Hum Exp Toxicol, 2010, 29 (8) :645-52.)。與其它TNF超家族成員相比，sTrail的抗腫瘤作用有如下特點更強的誘使腫瘤細胞凋亡的能力、廣譜的抗腫瘤作用、對正常細胞無顯著毒副作用、僅對胞核因子NF-K B有稍微激活作用、與放化療藥明顯協(xié)同作用等(deBruyn M, Rybczynska AA, Wei Y，et al. Melanoma-associated Chondroitin SulfateProteoglycan(MCSP)-targeted delivery of soluble TRAIL potently inhibits melanomaoutgrowth in vitro and in vivo [J], Mol Cancer. 2010，23 ;9 :301.)。sTrail 在癌的治療研究中具旁觀者效應(yīng)(bystander effect) (Ciusani Ε, Croci D, GelatiM et al. In vitroeffects of topotecan and ionizing radiation on Trail/Apo-L mediated apoptosis inmalignant glioma[J]. J N eurooncol,2005,71 (1) 19-25. Huang X，Lin T, Gu J, etal. Cell to cell contact required for bystander effect of the TNF~relatedapoptosis-inducing ligand (TRAIL) gene [J], Int J Oncol, 2003, 22 (6) : 1241-45.)，該效應(yīng)主要依賴轉(zhuǎn)染胞膜表面的結(jié)合sTrail與相鄰細胞表面的死亡受體結(jié)合，顯示更強的殺瘤效應(yīng)?？扇苄?Trail分子(sTrail)，在體外它能廣泛引起許多組織瘤細胞凋亡，對正常細胞卻無毒副作用(Wajant H，Gerspach J，Pfizenmaier K.Tumor therapeuticby design :targeting and activation of death recep tors [J]. Cytokine Grow th FactorReview,2005, 16(1) :55-76.Shi J，ZhengD, Liu Y et al. Overexp ression of soluble Trailinduces apoptosis in human lung adenocarcinoma and inhibits growth of tumorxenografts in nude mice[J]. Cancer Res，2005，65 (5) 1687-92. Ciusani E，Croci D，GelatiM et al. In vitro effects of topotecan and ionizing radiation on Trai1/ Apo-Lmediated apoptosis in malignant glioma[J]. J N eurooncol,2005，71(1) 19-25.)，其誘導腫瘤細胞的凋亡不依賴基因p53是否突變(K. Herzer，T. G. Hofmann, A· Teufel，etal· IFN—alpha—induced apoptosis in hepatocellular carcinoma involves promyelocyticleukemia protein and Trail independently of p53' [J]. Cancer Res， 2009,69 :855-62)。可見，sTrail基因在腫瘤治療中具廣泛應(yīng)用前景。^WMM^fMMJMW^M (urokinase plasminogen activator, uPA) ^ 411個氨基酸殘基，分子質(zhì)量為50 60kD的糖蛋白。其初始分泌出時為無活性的單鏈前體酶(pro-uPA)，若與其胞膜受體結(jié)合后使血漿酶活化為有活性的雙鏈酶。有活性的雙鏈 uPA可反過來催化與相應(yīng)受體結(jié)合的血漿酶原成為血漿酶，其結(jié)果使局部組織細胞膜上有活性的uPA增多。在正常組織細胞uPA及其uPAR表達極低，而幾乎所有的腫瘤，兩者明顯過表達。uPA與腫瘤的生長、浸潤與轉(zhuǎn)移等均密切相關(guān)(Dorn J，Harbeck N，Kates R， et al. Impact of expression differences ofkallikrein-related peptidases and of uPA and PAI-I between primary tumor andomentum metastasis in advanced ovarian cancer [J]. Ann Oncol, 2010 Oct 5. [ Epubahead of print] Markl B, Renk I, Oruzio DV, and et al. Tumour budding，uPA and PAI-Iare associated with aggressive behaviour in colon cancer[J]. J SurgOncol. 2010，102(3) :235-41. Fong Y，Shen KH，Chiang TA,and et al.Acacetin inhibitsTPA—induced MMP-2 and u_PA expressions of human lung cancer cells throughinactivating JNK signaling pathway and reducing binding activities of NF-kappaB andAP_l[J]· J Food Sci，2010，75 (1) :H30_8.)，因此被視為重要的腫瘤標志物與極具吸引力的腫瘤治療靶標。

發(fā)明內(nèi)容
基于sTrail的抗腫瘤生物學特性及uPA與腫瘤的密切關(guān)系，本發(fā)明將兩者有機結(jié)合起來，克隆含uPA裂解位點(SGRSA)與sTrail的融合基因，并亞克隆至原核表達載體中，獲得受uPA靶向性裂解而釋放具凋亡誘導活性的sTrail分子，為進一步探討sTrail蛋白的體外抗非小細胞肺癌活性及體內(nèi)靶向治療肺癌的研究奠定基礎(chǔ)。融合蛋白，其具有如SEQ ID NOl所示氨基酸序列。上述融合蛋白的C端還帶有his標簽。融合蛋白TETPH，其氨基酸序列如SEQ ID N03所示，從N端至C端依次為Trx標簽、EK識別序列、sTrail肽段、uPA識別序列、His標簽，命名為TETPH。編碼上述融合蛋白的基因。該基因序列如SEQ ID N02或SEQ ID N04所示。含有上述基因的表達載體，其骨架載體為原核表達載體。所述原核表達載體為pET_32a。所述表述載體為pET-32a/STrail-uPAC-hiS，其結(jié)構(gòu)如圖9所示。上述表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)采用RT-PCR法，以人胎盤組織總RNA為模板，以上游SEQ ID N07和下游SEQ ID N08為引物對，擴增得到PCR產(chǎn)物I，克隆入載體pMD18-T，得到陽性質(zhì)粒pMDlS-T/drail，上游SEQ ID N07 :5，-GCGGATCCGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG-3，，下游SEQ ID N08 :5，-ATCTGCAGTTAGC CAACTAAAAAGGCCC-3，，(2)采用引物延伸法，以pMD18-T/sTrail為模板，以上游SEQ ID N09和下游SEQ ID NOlO為引物對，擴增得到PCR產(chǎn)物II，再用限制性內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物II和pET-32a 載體，回收含sTrail-uPAc-his cDNA片段和ρΕΤ_3^ι骨架片段，純化后連接，得到陽性質(zhì)粒 pET-32a/sTrail-uPAc-his，上游 SEQ ID N09 5' -CATGCCATGGCTGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGA GAGTAGC-3 ‘，下游 SEQIDNOlO 5' -CCGCTCGAGTTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTGATCGTCCGCTGCCAACTAAAAAGGCCCCGAAAAAA C-3'。生產(chǎn)上述融合蛋白的方法，包括如下步驟(1)將 pET-32a/sTrail-uPAc-his 轉(zhuǎn)化表達菌 BL21，(2)挑取克隆轉(zhuǎn)種于含50μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C，220r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入0. 4mmol/L IPTG，于過夜誘導，使轉(zhuǎn)化的細菌表達融合蛋白TETPH。所述方法還包括表達產(chǎn)物的分離及純化步驟，所述分離步驟為4°C，6000r/min離心15min收集細菌，10倍體積的pH 7. 3的PBS重懸菌體，超聲破碎；破菌完全后于4°C， 10000r/min離心15min，留取上清及沉淀，上清以0. 45 μ m微孔濾膜過濾。所述破菌時加入PMSF和DTT，防蛋白降解。所述純化步驟為采用金屬螯合Ni2+柱，上清上樣，以Elution Buffer洗脫，所述 Elution Buffer組成為20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl，8M尿素，0. 5M咪唑，pH7. 4。所述方法還包括純化后的酶切，向融合蛋白溶液中加入EK酶，過夜即可得到目的蛋白。上述融合蛋白在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用?；趕Trail的抗瘤特性及uPA與腫瘤的密切相關(guān)性，本發(fā)明將兩者結(jié)合起來即為本發(fā)明的目的蛋白uPA-sTrail，為便于識別，分離，可采用不同的標簽，本發(fā)明優(yōu)選采用六聯(lián)組氨酸(his)。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)將多串聯(lián)His肽序列與uPA的裂解位點序列引入人sTrail的C端，使其蛋白分子構(gòu)象發(fā)生改變，使之成為受His肽與uPA裂解位點
5封閉的暫無活性(或低活性)的融合分子，其具體組成順序，從N端到C端依次為成熟的 sTrail — uPA的裂解位點序列一多串聯(lián)His肽。我們克隆到了 sTrail-uPAc-his的融合基因并亞克隆至原核表達載體pET-32a中得到表達載體pET-32a/STrail-uPAC-hiS (如圖
9)，經(jīng)誘導成功獲約38kD含載體表達標簽(Trx)的融合蛋白"Trx-sTrail-uPAc-his(如圖
10)，命名為融合蛋白TETPH。EK酶切去其約18.5kD的Trx-His標簽蛋白，獲約19. 5kD的目的蛋白uPA-sTrail。純化該目的蛋白后行免疫源性鑒定可知其具人Trail抗原性。同時體外實驗證實uPA酶可裂解sTrail-uPAc釋放有活性的sTrail殺傷肺癌細胞，為讓帶uPA裂解序列的無活性sTrail在高表達uPA與uPAR的人體腫瘤組織其活性被釋放而發(fā)揮局部殺瘤作用奠定基礎(chǔ)，為腫瘤的治療提供新策略。


圖1人sTrail基因PCR產(chǎn)物的電泳分析，其中1 人 sTRAIL ；2 =DNA 標準(DL2000)，圖2重組質(zhì)粒pMD18_T/sTrail的酶切分析，其中1 :PMD18-T/sTrail 質(zhì)粒；2 =BamH I 與 Pst I 酶切 pMD18-T/sTrail 質(zhì)粒；3 DNA 標準(DL 2000，圖3重組原核表達載體PET-32a/sTrail-uPAc-his的酶切分析，其中1 :DNA 標準(DL 2000) ；2 :pET-32a/sTrail-uPAc_his ；3 =NcoI 與 XhoI 酶切 pET-32a/sTrail-uPAc-his,圖4重組質(zhì)粒pET-3h/uPA_sTrai 1表達檢測，其中1 細菌裂解沉淀；2 細菌裂解上清；3 上清過Ni2+柱穿透液；4 5 % ElutionBuffer 洗脫液；5 10% Elution Buffer 洗脫液；6 100% Elution Buffer 洗脫液； 7:標準蛋白，圖5重組質(zhì)粒pET-3h/uPA_sTrail表達融合蛋白的放大純化，其中1 細菌裂解上清；2 上清過Ni2+柱穿透液；3 洗脫收集的融合蛋白；4 標準蛋白。圖6目的蛋白的HPLC分析，其中縱坐標代表電信號響應(yīng)值，用mv表示；橫縱坐標代表被測蛋白經(jīng)過色譜柱所需時間，用minutes表示，圖7融合蛋白(38kD)過夜酶切分析，其中1 蛋白標準；2 融合蛋白；3 =EK酶切融合蛋白；圖8目的蛋白uPA-sTrail的免疫學鑒定檢測；其中1,2 目的蛋白westernblot，3 蛋白標準，圖 9 表達載體 pET-Sh/s^Trail-uPAc-his 的結(jié)構(gòu)圖，圖 10 融合蛋白 Trx-sTrail-uPAc-his 的結(jié)構(gòu)圖。圖lluPAc-sTrail重組蛋白對NCI-H460細胞增殖的影響a，與對照細胞和uPA酶處理的細胞比較，P <0.05 ；b，與uPAc_sTRAIL蛋白單獨處理的細胞比較，P < 0. 05圖12顯微鏡下觀察uPAc-sTRAIL重組蛋白殺傷人肺癌NCI-H460細胞照片，(A)正常人肺癌NCI-H460細胞；(B) 20ng/ml和(C) 100ng/mluPAc-sTRAIL重組蛋白在uPA酶存在條件下處理的人肺癌NCI-H460細胞，可見大量細胞死亡。(標尺=100 μ m)。圖13重組蛋白uPA-sTrail對非小細胞肺癌細胞NCI-H460凋亡的影響A:正常培養(yǎng)的對照細胞；B :20ng/ml uPA-sTrail 與 uPA 酶作用 NCI-H460 細胞 48h ；C :100ng/ml uPA-sTrail 與 uPA 酶作用 NCI-H460 細胞 48h。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施例11材料與方法1. 1 材料RT-PCR試劑盒，克隆載體pMD18-T，限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq聚合酶、EK 酶、DNA純化試劑及蛋白純化Ni (GE)填料等購自TaKaRa公司；表達載體pET_32a，大腸桿菌DH5ci和BL21(DE!3)表達菌由解放軍第三軍醫(yī)大學檢驗系臨床生化教研室惠贈，申請人處有保存，可對外公開發(fā)放；羊抗人sTrail單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的兔抗羊多克隆抗體購自IMGENEX ；測序由南京金斯瑞公司完成。1. 2 方法1. 2. 1重組質(zhì)粒pMD18_T/sTrail的構(gòu)建和鑒定自行設(shè)計擴增sTrail基因引物，序列如下上游5，-GCGGATCCGTGAGAGAAAGAGGTC CTCAG-3，；下游5，-ATCTGCAGTTAGC CAACTAAAAAGGCCC-3，。RT-PCR 法，以人胎盤組織總 RNA 為模板擴增sTrail基因的cDNA序列，得到約510bp的人sTrail的cDNA片段(PCR產(chǎn)物I) (如圖1所示)。將其克隆入載體PMD18-T，采用限制性內(nèi)切酶BamHI與I^st I酶切重組質(zhì)粒，電泳顯示^22bp的pMD18-T骨架片段與510bp的sTrail目的片段(如圖2所示)。測序證實，所克隆到的人sTrail基因同GenBank庫顯的完全一致。菌液PCR法對重組子行初步鑒定。將可疑陽性重組子的質(zhì)粒測序鑒定，測序正確者命名為 pMDlS-T/s^Trail，如 SEQ ID N05 所示。1. 2. 2重組表達載體pET-32a/sTrail-uPAc_his的構(gòu)建和鑒定采用引物延伸法構(gòu)建融合蛋白，設(shè)計PCR法獲得sTrail-uPAc-his融合基因引物，序列為上游5 ‘ -CATgCCATggCTGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGC-3 ‘；下游5 ‘ -C CgCTCgAgTTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTGATCGTCCGCTGCCAACTAAAAAGGCCCCAAAAMAC-3'。 上游引物中CCATGG為NcoI酶切位點。下游引物中CTCGAG為XhoI酶切位點，TTATCA(反向互補序列為TGATAA)為終止密碼子，GTGGTGGTGGTGGTGGTG編碼六聯(lián)組氨酸(his)， TGCTGATCGTCCGCT 編碼 uPA 裂解位點(SGRSA)。以 pMDlS-T/s^Trail 為模板，擴增含酶切位點的 sTrail-uPAc-his cDNA 片段(PCR 產(chǎn)物II)。用限制性內(nèi)切酶》ιοΙ和NcoI切割以pMD18-T/sTrail質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物 II和pET-32a載體，回收含sTrail-uPAc-his cDNA片段和pET_32a骨架片段，純化后連接， 以NcoI與XhoI酶切該重組載體，電泳顯示M5bp的sTrail-uPAc目的片段與5852bp的 pET-32a骨架片段(如圖3所示)。菌液PCR法對重組子行初步鑒定。可疑陽性重組子送予測序，測序證實，攜帶sTrail基因的pET-32a/sTrail-uPAc-his重組原核載體被成功構(gòu)建。其序列如SEQID N06。 載體結(jié)構(gòu)示意圖見圖9，融合蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖見圖10。1.2. 3融合蛋白的誘導表達與純化測序正確的重組質(zhì)粒pET-32a/STrail-uPAC-hiS轉(zhuǎn)化表達菌BL21 (DE3)。次日挑 3個克隆，分別轉(zhuǎn)種于盛5ml LB培養(yǎng)基(含50 μ g/ml Amp)的20ml螺紋管中，37°C，220r/ min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入0.4mmol/L IPTG，于過夜誘導。各取Iml培養(yǎng)物， 14000r/min離心lmin，棄上清，100 μ 1蒸餾水重懸沉淀，加34 μ 1 4X loading buffer，混勻，沸水浴3 5min，15% SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白I^rx-sTrail-uPAc-his的誘導表達情況。如圖4所示。在相對分子質(zhì)量約38kD處有融合蛋白帶顯現(xiàn)，表達量約55%。大規(guī)模擴增后的工程菌經(jīng)IPTG誘導，4°C，6000r/min離心15min收集細菌，10倍體積的PBS (pH 7. 3)重懸菌體，超聲破碎(300W，工作10s，間隙10s，15次，循環(huán)3輪)，破菌時加入PMSF和DTT，防蛋白降解。鏡檢破菌效果。破菌完全后于4°C，10000r/min離心 15min,留取上清及沉淀，上清以0. 45 μ m微孔濾膜過濾。金屬螯合Ni2+柱中裝入約IOml Ni2+填料，His binding buffer平衡。細菌裂解上清上樣，收集穿透，復平衡，分別用5%、10%和100% Elution Buffer (20mM磷酸鈉， 0. 5M NaCl，8M尿素，0. 5M咪唑，pH7. 4)洗脫，100%組分，透析于Tris (9. 0)緩沖液中。15% SDS-PAGE電泳鑒定融合蛋白的可溶性。如圖5所示。1. 2. 4融合蛋白的酶切、純度檢測與免疫學鑒定向約12ml融合蛋白溶液中加入100 μ 1 EK酶，過夜，留取約Iml未酶切樣品作對照，SDS-PAGE電泳檢測酶切效果。如圖7所示，融合蛋白過夜酶切，分別切下約19. 5kD的目的蛋白與18. 5kD的Trx-His標簽蛋白。酶切后的目的蛋白行高效液相色譜(high performance liquid chromatogram, HPLC)分析，色譜柱discoverH250mmX4. 6mm，5 μ m)，歸一法計算其純度。HPLC分析，其純度達98. 6% (圖6)。電泳后的目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，浸泡于含羊抗人sTrail多克隆抗體 (1 200)封閉液中，4°C過夜孵育，加辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗(1 500)，室溫孵育lh，25. 2°C，與化學發(fā)光底物結(jié)合5 lOmin，拍照并保存圖片。Western blot結(jié)果顯示，在約19. 5kD處出現(xiàn)相應(yīng)的染色帶，可見目的蛋白具人Trail抗原性(圖8)。實施例2體外實驗2. luPA-sTRAIL重組蛋白對NCI-H460細胞增殖的影響NCI-H460細胞(本研究所自備，可從ATCC等公司獲得)接種至4個96孔板，每孔接種3 X IO3細胞(每組5孔，150 μ 1/孔)，24h后加入uPAc-sTRAIL蛋白(200ng/ml)與 uPA 酶(1μ 1/孔，5. 75yg/y 1)，分別以單純 uPAc-sTRAIL 蛋白(200ng/ml)、單純 uPA 酶 (1 μ 1/孔，5. 75 μ g/ μ 1)作用于NCI_H460細胞及單純NCI-H460細胞做對照，單純培養(yǎng)液 (150 μ 1/孔)為空白對照孔，分別于24h、48h、72h、96h取出一 96孔板，每孔加換新培養(yǎng)基 90 μ L與10 μ L CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h，振蕩30秒混勻，紫外高效分析儀測定450nm波長處光密度值，以相對光密度值(實驗各組絕對光密度值-空白孔光密度均值)為Y軸，時間為X軸繪制增殖曲線。如圖11所示。
結(jié)果表明，uPAc-sTRAIL蛋白對腫瘤細胞有顯著殺傷作用(與對照細胞和uPA酶處理的細胞比較，P < 0. 05) ；UPAc-sTRAIL蛋白經(jīng)uPA酶裂解后腫瘤殺傷能力顯著增強(在處理后培養(yǎng)2-4天，較uPAc-sTRAIL蛋白單獨處理的細胞比較，P < 0. 05)。2. 2重組蛋白uPAc-sTrail對非小細胞肺癌細胞NCI-H460凋亡的影響用20 和 100ng/ml 重組蛋白 uPAc-s^Trai 1 與 uPA 酶處理 NCI-H460 細胞 48h 后，細胞在顯微鏡下觀察形態(tài)學改變并照相如圖12所示。之后，細胞用冰乙醇固定，按試劑盒說明進行Armexin V-PI雙染，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。如圖13所示。uPAc-sTRAIL重組蛋白經(jīng)uPA酶體外裂解釋放具殺傷活性的sTRAIL對人肺癌 NCI-H460細胞具有效的抗瘤活性，腫瘤細胞脫落、崩解，有顯劑量-效應(yīng)關(guān)系。重組蛋白uPAc-sTrail與uPA酶處理4 后，20ng/ml細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分別為(18. 85士 1. 36) %與(2. 74士0. 38) %, 100ng/ml細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分別為(22. 74士3. 18)%與(10. 85士 1. 66) %。兩者相比，差異具統(tǒng)計學意義(P < 0. 05)。 結(jié)果說明重組蛋白uPAc-sTrail經(jīng)uPA酶體外裂解對腫瘤細胞有顯著殺傷作用，其殺傷活性有“劑量效應(yīng)”特性。
權(quán)利要求
1.融合蛋白，其具有如SEQID NOl所示氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其C端還帶有his標簽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQID N03所示，從N端至C端依次為Trx標簽、EK識別序列、sTrail肽段、uPA識別序列、His標簽，命名為TETPH。
4.編碼權(quán)利要求1-3任一所述融合蛋白的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N02或SEQ ID N04所示。
6.一種表達載體，為pET-32a/sTrail-uPAc-his，其結(jié)構(gòu)如圖9所示。
7.權(quán)利要求6所述的表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)采用RT-PCR法，以人胎盤組織總RNA為模板，以上游SEQID N07和下游SEQ ID N08為引物對，擴增得到PCR產(chǎn)物I，克隆入載體PMD18-T，得到陽性質(zhì)粒pMDlS-T/drail，上游 SEQ ID N07 :5’ -GCGGATCCGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG-3，，下游 SEQ ID N08 :5’ -ATCTGCAGTTAGC CAACTAAAAAGGCCC-3，，(2)采用引物延伸法，以pMD18-T/sTrail為模板，以上游SEQID N09和下游SEQ ID NOlO為引物對，擴增得到PCR產(chǎn)物II，再用限制性內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物II和pET-32a 體，回收含sTrail-uPAc-his cDNA片段和ρΕΤ_3^ι骨架片段，純化后連接，得到陽性質(zhì)粒 pET-32a/sTrail-uPAc-his，上游 SEQ ID N09 5' -CATGCCATGGCTGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGA GAGTAGC-3 ‘，下游 SEQID NOlO 5' -CCGCTCGAGTTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTGATCGTCCG CTGCCAACTAAAAAGGCCCCGAAAAAAC-3‘。
8.生產(chǎn)權(quán)利要求1-3任一融合蛋白的方法，包括如下步驟(1)將pET-32a/sTrail-uPAc-his 轉(zhuǎn)化表達菌 BL21，(2)挑取克隆轉(zhuǎn)種于含50μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C，220r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入0. 4mmol/L IPTG，于過夜誘導，使轉(zhuǎn)化的細菌表達融合蛋白TETPH。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，還包括表達產(chǎn)物的分離、純化和純化后的酶切步驟，所述分離步驟為4°C，6000r/min離心15min收集細菌，10倍體積的pH7. 3的PBS重懸菌體，超聲破碎，破菌時加入PMSF和DTT，防蛋白降解，破菌完全后于4°C，10000r/min離心15min， 留取上清及沉淀，上清以0. 45 μ m微孔濾膜過濾，Western blot檢測融合蛋白在上清和沉淀中的含量；所述純化步驟為采用金屬螯合Ni2+柱，上清上樣，以Elution Buffer洗脫，所述Elution Buffer組成為20mM磷酸鈉，0. 5MNaCl，8M尿素，0. 5M咪唑，ρΗ7· 4 ；所述純化后的酶切為向融合蛋白溶液中加入EK酶，過夜即可得到目的蛋白sTrail-uPAc。
10.權(quán)利要求1-3任一所述融合蛋白在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及“融合蛋白TETPH、表達載體及其構(gòu)建方法”，采用RT-PCR法克隆sTrail基因，經(jīng)引物延伸法構(gòu)建sTrail-uPAc-his融合基因并亞克隆至原核表達載體pET-32a中，該表達載體經(jīng)誘導成功獲約38kD含載體表達標簽(Trx)的融合蛋白TETPH，EK酶切該蛋白獲約19.5kD的目的蛋白sTrail-uPAc。實驗表明，該目的蛋白具人Trail抗原性；uPA酶可裂解sTrail-uPAc釋放有活性的sTrail殺傷肺癌細胞，為讓帶uPA裂解序列的低活性sTrail在高表達uPA與uPAR的人體腫瘤組織其活性被釋放而發(fā)揮局部殺瘤作用奠定基礎(chǔ)，為腫瘤的治療提供新策略。
文檔編號C12N15/62GK102206281SQ201110075829
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者孫慧勤, 戴曉天, 梁宇佳, 熊瑋, 繆殿南, 閆國和 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院