專利名稱：一種檢測血液中轉移肝癌細胞的試劑盒、標志物及方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學腫瘤學領域，具體涉及一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的試劑盒、標志物及其檢測方法。
背景技術：
原發(fā)性肝癌是世界上惡性成度極高，且預后極差的惡性腫瘤之一，全世界每年約 100萬人死于肝癌。據(jù)統(tǒng)計中國乙肝病毒攜帶者約一億多人，而每年新增加肝癌患者約45 萬，在城市發(fā)病率僅次于肺癌，是威脅人們生命的第二大惡性腫瘤“殺手”。肝癌是一種惡性腫瘤，癌細胞轉移是它的特性之一。肝癌的轉移有四種途徑，即血路、淋巴道、直接蔓延、浸潤或種植。其中以血行轉移最為重要。肝內血行轉移發(fā)生最早，也最常見，肝細胞型肝癌以血行轉移多見，通過血行轉移至全身各部，以肺、腎上腺、骨、腎、腦等器官較為常見。大量臨床實踐證明，惡性腫瘤的預測，關鍵在于是否能做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷，而目前腫瘤只有爭取早期治療，才有可能被徹底治愈。早期發(fā)現(xiàn)肝癌意義重大，了解并掌握如何早期發(fā)現(xiàn)肝癌對肝癌的治療、預后及降低病死率、延長壽命等方面可謂發(fā)揮著很關鍵的作用。肝臟是鳥氨酸循環(huán)的重要器官。鳥氨酸循環(huán)又稱“尿素循環(huán)”，是機體對氨的一種解毒方式。它的重要生物學意義是將體內蛋白質代謝產(chǎn)生的較高毒性的氨轉化為低毒的尿素，從而排出體外。肝臟是哺乳類動物生成尿素的主要器官，由于精氨酸酶的作用使精氨酸水解為鳥氨酸及尿素。而精氨酸代琥珀酸合成酶(ASQ和精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)是鳥氨酸循環(huán)的關鍵酶。臨床氨基酸分析121例肝癌患者血清和85例正常血清，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清精氨酸含量為Gl.四士 12. 25 μ mol/mL)，正常人血清精氨酸含量為 (107. 38士 11. 61 μ mol/mL)，數(shù)據(jù)顯示兩者差異明顯(P < 0. 05)，表明肝癌患者精氨酸合成障礙。免疫組化和Western blot的方法研究肝癌與精氨酸代琥珀酸合成酶(ASQ及精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)之間的關聯(lián)，結果顯示精氨酸代琥珀酸合成酶(ASQ和精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)在肝癌組織中的表達與正常組織相比明顯下調。通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)肝癌ASS基因和ASL基因的啟動子區(qū)域CpG島呈高度甲基化狀態(tài)，CpG島通常位于基因的啟動子區(qū)或是第一個外顯子區(qū)。健康人基因組中，CpG島中的CpG位點通常是處于非甲基化狀態(tài)，而在CpG島外的CpG位點則通常是甲基化的。這種甲基化的形式在細胞分裂的過程中能夠穩(wěn)定的保留。當腫瘤發(fā)生時，抑癌基因CpG島中的 CpG則呈高度甲基化狀態(tài)，以致于染色體螺旋程度增加及抑癌基因表達的失活，這是癌癥發(fā)生的一個重要機制。一些基因的過甲基化成為腫瘤乃至癌細胞形成的標志物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物。本發(fā)明的目的還在于一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的方法。
一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的試劑盒，包括dNTP、IOxPCR buffer、MgCl2, ddH20，其特征在于，還包括標準血液DNA、熱啟動TaqDNA聚合酶、引物F 1、 引物Bi、引物F2、引物B2、引物B3、引物R1、引物Li、引物R2、引物L2、引物L3 ；上述引物用于做甲基化特異性PCR，PCR時，引物的配對方案為引物FU Bl配對，引物FU B2配對，引物F2、Bl配對，引物F2、B3配對，用于檢測 ASS基因(GeneBank NG_011M2，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)甲基化情況；引物Rl、L1配對，引物Rl、L2配對，引物R2、L3配對，用于檢測ASL基因(GeneBank NG_009^8，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)甲基化情況。 所述標準血液DNA為取自無肝癌健康人血液提取的基因組DNA并經(jīng)過重亞硫酸鹽處理。引物F 1具有序列表中SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列，引物Bl具有序列表中 SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列，引物F2具有序列表中SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列，引物B2具有序列表中SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列，引物B3具有序列表中SEQ ID No. 10 所示的核苷酸序列，引物Rl具有序列表中SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列，引物Ll具有序列表中SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列，引物R2具有序列表中SEQ ID No. 13所示的核苷酸序列，引物L2具有序列表中SEQ ID No. 14所示的核苷酸序列，引物L3具有序列表中 SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列。所述標志物包括肝癌特異性低調控基因ASS^eneBank NG_011M2，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)或ASUGeneBank NG_009^8，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)的甲基化的第一外顯子和啟動子區(qū)域；所述ASS(GeneBankNG_011M2，精氨酸代琥珀酸合成酶基因) 基因甲基化的第一外顯子和啟動子區(qū)域核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示；所述 ASL (GeneBank NG_009^8，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)基因的甲基化的第一外顯子和啟動子區(qū)域核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物，其特征在于，所述標志物包括一個或多個甲基化的CpG島并由SEQ ID No. 3表示。包括一個或多個甲基化的CpG島并由SEQ ID No. 3表示的檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物，衍生于肝癌特異性表達降低的基因ASS (GeneBank NG_011M2，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)。檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物，其特征在于，所述標志物包括一個或多個甲基化的CpG島并由SEQ ID No. 4表示。檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物，其特征在于，所述標志物包括一個或多個甲基化的CpG島并由SEQ ID No. 5表示。包括一個或多個甲基化的CpG島并由SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 5表示的檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物，衍生于肝癌特異性表達降低的基因ASUGeneBank NG_009^8，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)。一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)從血液樣品中提取基因組DNA ；(2)將基因組DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理，使未甲基化的胞嘧啶全部轉變?yōu)槟蜞奏ぃ?br> (3)利用權利要求1所述試劑盒及引物配對方案，以ddH20、標準血液DNA、經(jīng)重亞硫酸鹽處理的血液樣品基因組DNA為模板，進行甲基化特異性PCR反應；(4)用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，如果以ddH20、標準血液DNA為模板的 PCR無擴增條帶，而以經(jīng)重亞硫酸鹽處理的血液樣品基因組DNA為模板的PCR擴增有擴增條帶，且擴增條帶與預測的條帶大小一致，則認為所檢測的血液樣品中含有轉移肝癌細胞。本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明的試劑盒和方法，通過檢測ASS基因和ASL基因的甲基化情況判斷肝癌轉移細胞的存在，具有專一性強，反應靈敏的特點，本發(fā)明對于了解并掌握如何早期發(fā)現(xiàn)肝癌意義重大，對肝癌的治療、預后及降低病死率、延長壽命等方面起指導作用。


圖1為引物Fl、Bl配對擴增正常人血液、肝癌患者血液及7402肝癌細胞、HepG2 肝癌細胞ASS基因MSP凝膠電泳圖；圖中，M-IOObp梯度DNA標準樣品、l_ddH20、2-正常血A、3_正常血B、4_肝癌血A、 5-肝癌血B、6-H印G2肝癌細胞、7-7402肝癌細胞。圖2為引物Rl、Ll配對擴增正常人血液、肝癌患者血液及7402肝癌細胞、HepG2 肝癌細胞ASL基因MSP凝膠電泳圖；圖中，M-IOObp梯度DNA標準樣品、l-ddH20、2_正常血、3-肝癌血A、4_肝癌血B、 5-肝癌血C、6-H印G2肝癌細胞、7-7402肝癌細胞。圖3為引物R2、L3配對擴增正常人血液、肝癌患者血液及7402肝癌細胞、HepG2 肝癌細胞ASL基因MSP凝膠電泳圖；圖中，M-IOObp梯度DNA標準樣品、l-ddH20、2-正常血、3-肝癌血A、4-肝癌血B、 5-肝癌血C、6-H印G2肝癌細胞、7-7402肝癌細胞。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。以下實施例未說明的實驗步驟參照《分子克隆實驗指南》第三版，或參照相應試劑盒的說明書。實施例1設計用于檢測血液中轉移肝癌細胞的靶序列和特異性專一引物(1)根據(jù)ASS基因(GeneBank NG_011M2，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)和ASL基因GeneBank NG_00^88，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)序列，登陸http //www. uroRene. orR/methprimer/indexl. html網(wǎng)站，根據(jù)網(wǎng)站上提供的方法，篩選出檢測肝癌細胞的甲基化靶序列區(qū)域，其堿基序列如SEQ ID No. 1和SEQID No. 2所示。(2)根據(jù)SEQ ID No. 1靶序列和特異性甲基化位點，篩選出適合于甲基化特異性 PCR的核苷酸區(qū)段，為標志物，根據(jù)此序列設計PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，設計的檢測血液中轉移肝癌細胞ASS基因甲基化的5條特異性專用引物序列如下上游引物Fl 5' -TCGGTATCGGATAGAAGTGAGTAC-3‘ (SEQ ID No. 6)；下游引物Bl :5，-CAAAAAAAACGACAATAACTACGAC-3，(SEQ ID No. 7)；上游引物F2 5' -GTCGGTATCGGATAGAAGTGAGTAC-3‘ (SEQ ID No. 8)；
下游引物B2 :5，-CCAAAAAAAACGACAATAACTACGAC-3，(SEQ ID No. 9)；下游引物B3 :5，-CCAAAAAAAACGACAATAACTACGACG-3，(SEQ ID No. 10)；PCR時，引物的配對方案為引物FUBl配對；引物F1、B2配對；引物F2、B1配對； 引物F2、B3配對。根據(jù)SEQ ID No. 2靶序列和特異性甲基化位點，篩選出適合于甲基化特異性PCR 的核苷酸區(qū)段，為標志物，根據(jù)此序列設計PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No. 5所示，設計的檢測血液中轉移肝癌細胞ASL基因甲基化的5條特異性專用引物序列如下上游引物Rl :5，-GAGGATGGAGGTAACGTTTATTTC-3，(SEQ ID No. 11)；下游引物Ll :5，-CACTAACCAAAACTTTTCTAACCGA-3，(SEQ ID No. 12)上游引物R2 5' -AGTGTTTAGAATTCGGAGTTAGTTC-3‘ (SEQ ID No. 13)下游引物L2 :5，-ACTAACCAAAACTTTTCTAACCGAA-3，(SEQ ID No. 14)下游引物L3 :5，-ATATTAAACGATTCCTCGTCGTC-3，(SEQ ID No. 15)；PCR時，引物的配對方案為引物R1、L1配對；引物R1、L2配對；引物R2、L3配對。實施例2血液樣品中DNA的提取和重亞硫酸鹽處理抽取正常人血液(A、B)各200 μ L和肝癌患者(Α、B、C)血液各200 μ L，按照《分子克隆實驗指南》第三版所述DNA提取操作步驟提取血液樣品DNA，將提取的DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理使未甲基化的胞嘧啶全部轉變?yōu)槟蜞奏?，甲基化的胞嘧啶保持不變，未甲基化的胞嘧啶全部轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。取培養(yǎng)好的H印G2肝癌細胞(購買自上海超研生物科技有限公司)和7402肝癌細胞(購買自上海超研生物科技有限公司)各200uL，按照《分子克隆實驗指南》第三版所述DNA提取操作步驟提取DNA，將提取的DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理使未甲基化的胞嘧啶全部轉變?yōu)槟蜞奏ぃ谆陌奏け３植蛔?，未甲基化的胞嘧啶全部轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。實施例3甲基化特異性PCR以無肝癌健康人血液提取并經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA和ddH20為對照模板，肝癌患者血液、IfepG2. 7402肝癌細胞和7402肝癌細胞提取并經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA為模板， 采用下述引物配對方案做PCR 引物Fl、Bl配對，引物Fl、B2配對，引物F2、Bl配對，引物F2、B3配對，檢測ASS 基因的甲基化情況；引物Rl、Ll配對，引物Rl、L2配對，引物R2、L3配對，檢測檢測ASL基因的甲基化情況。PCR反應體系如下
權利要求
1.一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的試劑盒，包括dNTP、10x PCR buffer、MgCl2, ddH20，其特征在于，還包括標準血液DNA、熱啟動TaqDNA聚合酶、引物F 1、 引物Bi、引物F 2、引物B2、引物B3、引物R1、引物Li、引物R2、引物L2、引物L3 ；上述引物用于做甲基化特異性PCR，PCR時，引物的配對方案為引物Fl、Bl配對，引物Fl、B2配對，引物F2、Bl配對，引物F2、B3配對，用于檢測ASS 基因(GeneBank NG_011M2，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)甲基化情況；引物Rl、Ll配對，引物Rl、L2配對，引物R2、L3配對，用于檢測ASL基因(GeneBank NG_009^8，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)甲基化情況。
2.根據(jù)權利要求1所述一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的試劑盒，其特征在于，所述標準血液DNA為取自無肝癌健康人血液提取的基因組DNA并經(jīng)過重亞硫酸鹽處理。
3.根據(jù)權利要求1所述一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的試劑盒，其特征在于，引物F 1具有序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，引物Bl具有序列表中SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列，引物F2具有序列表中SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列，引物B2 具有序列表中SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列，引物B3具有序列表中SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列，引物Rl具有序列表中SEQ IDNo. 11所示的核苷酸序列，引物Ll具有序列表中SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列，引物R2具有序列表中SEQ ID No. 13所示的核苷酸序列，引物L2具有序列表中SEQ ID No. 14所示的核苷酸序列，引物L3具有序列表中SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列。
4.一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物，其特征在于，所述標志物包括肝癌特異性低調控基因ASS (GeneBank NG_011M2，精氨酸代琥珀酸合成酶基因) 或ASUGeneBank NG_009^8，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)的甲基化的第一外顯子和啟動子區(qū)域；所述ASS (GeneBank NG_01K42，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)基因甲基化的第一外顯子和啟動子區(qū)域核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示；所述ASL (GeneBank NG_00i^88，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)基因的甲基化的第一外顯子和啟動子區(qū)域核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo. 2所示。
5.檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物，其特征在于，所述標志物包括一個或多個甲基化的CpG島并由SEQ ID No. 3表示。
6.根據(jù)權利要求5所述檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物，其特征在于，衍生于肝癌特異性表達降低的基因ASS (GeneBank NG_01K42，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)。
7.檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物，其特征在于，所述標志物包括一個或多個甲基化的CpG島并由SEQ ID No. 4表示。
8.檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物，其特征在于，所述標志物包括一個或多個甲基化的CpG島并由SEQ ID No. 5表示。
9.根據(jù)權利要求7-8任何一項所述檢測血液中轉移肝癌細胞的標志物，其特征在于， 衍生于肝癌特異性表達降低的基因ASUGeneBank NG_009288,精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)。
10.一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)從血液樣品中提取基因組DNA;(2)將基因組DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理，使未甲基化的胞嘧啶全部轉變?yōu)槟蜞奏ぃ?3)利用權利要求1所述試劑盒及引物配對方案，以ddH20、標準血液DNA、經(jīng)重亞硫酸鹽處理的血液樣品基因組DNA為模板，進行甲基化特異性PCR反應；(4)用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，如果以ddH20、標準血液DNA為模板的PCR 無擴增條帶，而以經(jīng)重亞硫酸鹽處理的血液樣品基因組DNA為模板的PCR擴增有擴增條帶， 且擴增條帶與預測的條帶大小一致，則認為所檢測的血液樣品中含有轉移肝癌細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于醫(yī)學腫瘤學領域的一種利用甲基化原理檢測血液中轉移肝癌細胞的試劑盒、標志物及其檢測方法。該標志物為肝癌細胞特異性表達降低的基因ASS基因或ASL基因，其啟動子區(qū)和第一外顯子區(qū)包含至少一個被甲基化的CpG島。該試劑盒包括針對ASS基因和ASL基因的各5條特異性專用引物，通過甲基化特異性PCR方法檢測ASS基因和ASL基因甲基化情況，進而推測待檢樣品中是否含有轉移肝癌細胞。該方法具有專一性強，反應靈敏的特點，對于了解并掌握如何早期發(fā)現(xiàn)肝癌意義重大。
文檔編號C12N15/11GK102206708SQ20111007769
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權日2011年3月29日
發(fā)明者林明 申請人:北京大學