專利名稱：一株產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株內(nèi)生細(xì)菌。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生菌是一個多樣性十分豐富的微生物類群，它們生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的細(xì)胞或細(xì)胞間隙內(nèi)而不引起植物病變，是與寄主植物在長期的共同進(jìn)化過程中建立起互惠共存、相互制約的和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物。近年來，植物內(nèi)生菌作為一種新的微生物資源引起了廣泛。植物內(nèi)生細(xì)菌是產(chǎn)生活性物質(zhì)和新化學(xué)物質(zhì)的潛在資源，不但可以幫助維護(hù)人類健康，也可以維護(hù)動物和植物的健康。藥用植物本身就能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，實驗研究表明，植物與內(nèi)生細(xì)菌在相互作用的過程中，有內(nèi)生細(xì)菌能產(chǎn)生與植物相同或相似的活性物質(zhì)，因此從藥用植物中分離到產(chǎn)生活性物質(zhì)的內(nèi)生細(xì)菌已成為當(dāng)今學(xué)者的研究趨勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌。產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，它為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX33，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M2011078，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2011年3月22日；它為革蘭氏陽性桿菌，長為2. 0 3. 0 μ m，寬為0. 7 0. 8 μ m,有芽孢、鞭毛和菌膜，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成白色圓形菌落。本發(fā)明中產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，它為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) CX33，其淀粉水解呈陽性、明膠液化呈陽性、接觸酶試驗呈陽性、脂酶試驗呈陰性、甲基紅呈陰性、乙酰甲基甲醇反應(yīng)呈陽性，生長溫度為10 50°C，最適生長溫度為40°C，生長耐鹽度為0. 5% 20%，生長耐鹽度為2%，最適生長pH值為6. 8 7. 6。本發(fā)明中產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，它為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) CX33，其16S rDNA序列通過GENBANK序列比對，CX33與序列號為AB199317. 1的枯草芽孢桿菌TCCC11021菌株序列相似性達(dá)到99%，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果，確定枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX33為芽孢桿菌屬的一個新菌種。本發(fā)明中產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，它為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) CX33，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No :M2011078，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2011年3月22日。本發(fā)明利用微生物制藥手段提取分離刺五加健康植株的內(nèi)生細(xì)菌，以抑菌活性為指標(biāo)，采用濾紙片法進(jìn)行抑菌實驗，篩選得到某些抑菌活性較強(qiáng)的目的菌株，并以薄層層析法，HPLC法為分析手段，從刺五加內(nèi)生細(xì)菌中找到能夠產(chǎn)生活性成分的菌株，并從其發(fā)酵液中提取分離活性物質(zhì)，測定其活性代謝產(chǎn)物，最后將獲得的目的菌株通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗測定和16S rDNA序列分析鑒定其種屬。
本發(fā)明中產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，它為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) CX33，其代謝物具有較好的抑菌活性，可為新型抗菌藥物的篩選提供參考；同時從其代謝物中發(fā)現(xiàn)其含有咖啡酸，咖啡酸為止血升白細(xì)胞藥，具有收縮增固微血管、提高凝血因子的功能、升高白細(xì)胞和血小板的作用，用于外科手術(shù)時預(yù)防出血或止血，以及內(nèi)科、婦產(chǎn)科等出血性疾病的止血。也用于各種原因引起的白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥。本發(fā)明對采用刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX33生產(chǎn)咖啡酸具有指導(dǎo)意義。


圖1為具體實施方式
一中咖啡酸對照品的HPLC色譜圖，其中a表示咖啡酸；圖2 為具體實施方式
一中供試品的HPLC色譜圖，其中a表示供試品CX33 ；圖3為具體實施方式
一中加入對照品后供試品的HPLC色譜圖，其中a表示加咖啡酸后供試品CX33a。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，它為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) CX33，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No :M2011078，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2011年3月 22日；它為革蘭氏陽性桿菌，長為2. 0 3. 0 μ m，寬為0. 7 0. 8 μ m，有芽孢、鞭毛和菌膜， 在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成白色圓形菌落。本實施方式中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) CX33，其進(jìn)行常規(guī)生理生化鑒定，實驗結(jié)果為淀粉水解呈陽性、明膠液化呈陽性、接觸酶試驗呈陽性、脂酶試驗呈陰性、 甲基紅呈陰性、乙酰甲基甲醇反應(yīng)呈陽性。本實施方式中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX33，其生長溫度為10 50°C，最適生長溫度為40°C，生長耐鹽度為0.5% 20%，生長耐鹽度為2%，最適生長pH 值為6. 8 7.6。本實施方式中產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，它為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX33，該菌株分離自健康野生刺五加植株，采自黑龍江省帽兒山地區(qū)，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)研究院傅克治研究員鑒定為五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus (Rupr. et Maxim) Harms，其樣本現(xiàn)存于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥專業(yè)實驗室；它按以下步驟進(jìn)行分離培養(yǎng)(1)材料預(yù)處理選取健康刺五加的根莖用自來水沖洗干凈后以無菌濾紙吸干水分，切成Icm小段，備用；(2)表面消毒于無菌超凈臺內(nèi)將刺五加的根莖按下述方法進(jìn)行表面消毒95% 酒精浸泡Imin-IO %次氯酸鈉浸泡5min-95%酒精浸泡30s_無菌水沖洗3次或者75%酒精浸泡lmin-10%雙氧水浸泡15min-75%酒精浸泡Imin-無菌水沖洗3次；(3)陰性對照取最后一次無菌水沖洗液涂布培養(yǎng)平板或取適量此沖洗液倒入牛肉膏蛋白胨液體分離培養(yǎng)基內(nèi)作對照，另將消毒后的實驗材料在牛肉膏蛋白胨固體分離培養(yǎng)基上滾動一周作對照，于相同的條件下培養(yǎng)；(4)菌體培養(yǎng)將消毒后的實驗材料分別置于液體和固體分離培養(yǎng)基中，于37°C 恒水浴搖床和溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 5d，待實驗材料周圍長出菌體，挑取菌體轉(zhuǎn)入平板多次劃線分離純化，將純化后的菌株置于斜面固體培養(yǎng)基中，4°C保存?zhèn)溆茫?
其中牛肉膏蛋白胨固體分離培養(yǎng)基每L由3. Og的牛肉膏、10. Og的蛋白胨、5. Og 的NaCl,16. Og的瓊脂粉和余量的H2O組成，pH值為7. 0 7. 2，121°C下高壓滅菌30min ；
牛肉膏蛋白胨液體分離培養(yǎng)基每L由3. Og的牛肉膏、10. Og的蛋白胨、5. Og的 NaCl和余量的H2O組成，pH值為7. 0 7. 2，121°C下高壓滅菌30min ；斜面固體培養(yǎng)基為取5mL牛肉膏蛋白胨固體分離培養(yǎng)基裝于試管中，121°C高壓滅菌30min后，鋪成斜面冷卻，以備保存菌種。結(jié)果從刺五加根莖中分離出內(nèi)生細(xì)菌，并且陰性對照中對照平板和對照液體培養(yǎng)基內(nèi)均無任何菌長出，多次重復(fù)均如此，證明所分到的菌是植物內(nèi)生細(xì)菌，而不是表面的附生菌。對篩選出的產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)生理生化鑒定；分子鑒定應(yīng)用國際細(xì)菌鑒定通用引物進(jìn)行pcr，得到約ieoobp的擴(kuò)增片段，純化后連入τ載體進(jìn)行測序，轉(zhuǎn)化的進(jìn)行重組子檢測，表明目的片段已經(jīng)轉(zhuǎn)入T載體，并成功在大腸桿菌中擴(kuò)增，將菌液送往測序公司測序；其16S rDNA序列通過GENBANK序列比對，與序列號為AB199317. 1的枯草芽孢桿菌TCCC11021菌株序列相似性達(dá)到99%，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果，確定篩選出的產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌為芽孢桿菌屬的一個新菌種，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX33。本實施方式中產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，它為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) CX33，它發(fā)酵液的抑菌活性實驗，結(jié)果如表1所示，刺五加內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的抑菌活性實驗結(jié)果表明，CX33對屎腸球菌，糞腸球菌，釀膿鏈球菌，肺炎克雷伯菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。表1CX33發(fā)酵液對12種試驗菌的抑菌活性篩選結(jié)果
^lSt A__^__C__D__E__F____I__J__K__1_
CX33 ++ ++ ++ +++ +++ + +++ ++ ++ ++ +++ + Str +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ -Nys----------- 十十十注A 枯草芽孢桿菌；B 短小芽孢桿菌；C 金黃色葡萄球菌；D 糞腸球菌；E 屎腸球菌；F 單增李斯特菌；G 釀膿鏈球菌；H 大腸桿菌；I 銅綠假單孢菌J 鮑曼不動桿菌；K 肺炎克雷伯菌；L 白假絲酵母；Str 鏈霉素；Nys 制霉素；-無活性；+活性較弱，抑菌圈直徑< Ilmm ；++活性中等，抑菌圈直徑11 15mm ；+++活性較強(qiáng)，抑菌圈直徑> 15mm。本實施方式中產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，它為枯草芽孢桿菌(Bacillus subti 1 iS) CX33，它活性代謝物的檢測如下a、CX33發(fā)酵液各組分的制備硅膠G板于120°C烘箱中活化lh，置干燥器內(nèi)備用，分別吸取CX33供試品液各 5 μ L，以定量毛細(xì)管分別點于硅膠板(硅膠G+0. 25% CMC，相對濕度90%)上，以氯仿甲醇=9 1 (ν/ν)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(254nm)下檢視；供試品液有相應(yīng)的清晰亮暗斑點，陰性對照液在相應(yīng)位置上無任何斑點；將大量的供試品液進(jìn)行薄層層析實驗，在紫外燈(254nm)下記錄層析后各個組 分的位置，刮取各部位的暗斑，溶于甲醇中，超聲60min，以0. 45 μ m微孔濾膜過濾，取濾液，將濾液置于室溫，揮干甲醇，得到少量固體，經(jīng)過多次重結(jié)晶，得到純度較高的各組分晶體，依次命名為CX33a，CX33b，置于4°C冰箱保存，備用；b、采用濾紙片法對CX33的活性組分進(jìn)行抑菌實驗，結(jié)果如表2所示，CX33的組分 CX33a, CX33b具有一定的抑菌活性；表2CX33各組分對12種試驗菌的抑菌活性篩選結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一株產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，其特征在于它為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX33，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No :M2011078，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2011年3月22日。
全文摘要
一株產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，它涉及一株內(nèi)生細(xì)菌。產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌，它為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CX33，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM2011078，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2011年3月22日。本發(fā)明中產(chǎn)咖啡酸的刺五加內(nèi)生細(xì)菌的代謝物具有較好的抑菌活性，可為新型抗菌藥物的篩選提供參考；同時從其代謝物中發(fā)現(xiàn)其含有咖啡酸，咖啡酸為止血升白細(xì)胞藥，具有收縮增固微血管、提高凝血因子的功能、升高白細(xì)胞和血小板的作用；對采用刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX33生產(chǎn)咖啡酸具有指導(dǎo)意義。
文檔編號C12R1/125GK102154185SQ201110080188
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者劉玉潔, 盧玢宇, 孫婷媛, 徐翠, 鄭春英 申請人:黑龍江大學(xué)