專利名稱：一種通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法、重組質(zhì)粒和永久轉(zhuǎn)基因的生殖細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法、重組質(zhì)粒和永久轉(zhuǎn)基因的生殖細(xì)胞。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因大動(dòng)物應(yīng)用前景廣闊，可直接服務(wù)于農(nóng)業(yè)、動(dòng)物育種、和生物醫(yī)藥_生產(chǎn)人類醫(yī)療性蛋白，人員源化器官等。所以，近年來(lái)已經(jīng)有多種轉(zhuǎn)基因技術(shù)問世，例如，傳統(tǒng)上主要用于小鼠轉(zhuǎn)基因的原核注射技術(shù)，后來(lái)出現(xiàn)過的通過核移植轉(zhuǎn)基因，通過理化方法轉(zhuǎn)基因電穿孔轉(zhuǎn)基因，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)基因，利用轉(zhuǎn)染率高的病毒性載體轉(zhuǎn)基因。最近出現(xiàn)了利用 zinc-finger endonucleases 禾口 transposons 轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因技術(shù)有些在體外條件下對(duì)細(xì)胞或胚胎轉(zhuǎn)基因效率較高，但是這些轉(zhuǎn)基因技術(shù)在活體轉(zhuǎn)基因時(shí)，或者是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代時(shí)，由于體內(nèi)環(huán)境難以隨轉(zhuǎn)基因的需要而轉(zhuǎn)變，其效率就大大降低。例如通過核移植轉(zhuǎn)基因的總體效率還不到1%，難以推廣應(yīng)用。而且這些技術(shù)用于大動(dòng)物時(shí)操作復(fù)雜難度增加，花費(fèi)較高，效率更低。在大動(dòng)物上過低的轉(zhuǎn)基因效率嚴(yán)重阻礙了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在這些動(dòng)物上的應(yīng)用。因此，要在生產(chǎn)中應(yīng)用，要實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)價(jià)值，就要實(shí)現(xiàn)大動(dòng)物轉(zhuǎn)基因，就需要建立新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以便較快地改進(jìn)遺傳性能，提高奶、肉、毛產(chǎn)量的質(zhì)量 (品質(zhì))，提高抗病力，制作動(dòng)物模型。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上面提到的現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明的一個(gè)目的是公開了一種通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于公開了通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法所采用的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于公開了通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法獲得的永久轉(zhuǎn)基因的生殖細(xì)胞。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法，其中，所述方法包括以下步驟 以超聲波影像引導(dǎo)，用B型超聲波抬頭找到睪丸網(wǎng)，順長(zhǎng)軸方向進(jìn)針，緩慢將外源包裝質(zhì)粒注入曲細(xì)精管和睪丸其他部位，得到動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因生殖細(xì)胞。上述技術(shù)方案中所述的通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法，其中，在所述得到動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因生殖細(xì)胞之前還包括下述步驟(1)、擴(kuò)增目的基因片段；(2)、將擴(kuò)增的目的基因片段與Lenti-GFP-T2A載體連接，獲得重組質(zhì)粒；(3)、將步驟(2)的重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中進(jìn)行高效包裝，使滴度達(dá)到108或轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上，獲得外源包裝質(zhì)粒。
上述技術(shù)方案中所述的通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法，其中，步驟(1)中所述的目的基因片段為OlGF-I片段；所述步驟(2)中擴(kuò)增的目的基因片段與 Lenti-GFP-T2A載體連接是在 Oigf-I 片段 4· 5μ L、Lenti-GFP-T2A載體0. 5μ L和 solution I 5 μ L，共10 μ L的連接體系中，將上述溶液混勻，離心后，于14 16°C連接過夜，得到重組質(zhì)粒 Lenti-GFP-T2A-oIGF-l。上述技術(shù)方案中所述的通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法中所采用的重組質(zhì)粒，其中，所述重組質(zhì)粒是通過將目的基因片段與Lenti-GFP-T2A載體連接后獲得。上述技術(shù)方案中所述的通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法中所采用的重組質(zhì)粒，其中，所述重組質(zhì)粒是通過將目的基因片段oIGF-1與Lenti-GFP-T2A載體連接后獲得重組質(zhì)粒Lenti-GFP-T2A-oIGF-l。一種永久轉(zhuǎn)基因的生殖細(xì)胞，其中，所述永久轉(zhuǎn)基因的生殖細(xì)胞是通過上述技術(shù)方案中所述的通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法中任一方法制得的。本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明所采用將外源包裝質(zhì)粒注射入曲細(xì)精管和睪丸其他部位的方法具有超高轉(zhuǎn)基因效率，整體轉(zhuǎn)基因效率可達(dá)90%以上；2、精原干細(xì)胞可以自我復(fù)制，保存自己；同時(shí)可以分化成更高級(jí)的生殖細(xì)胞，向精子方向發(fā)展。從精原干細(xì)胞到精子形成的過程是一個(gè)很高效的生理機(jī)制，稱為精子發(fā)生。在大動(dòng)物大約需要45天?？梢钥闯?，一旦精原干細(xì)胞整合到外源基因，所轉(zhuǎn)基因就會(huì)隨之復(fù)制而復(fù)制，并隨生殖細(xì)胞分化而保留，最后到達(dá)精子，源源不斷。采用本發(fā)明所述的方法，由于將目的基因與載體重組后注射入曲細(xì)精管和睪丸其它部位，因此能夠持續(xù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因精子；而且轉(zhuǎn)基因精子應(yīng)用方便；3、與通過普通細(xì)胞或胚胎生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一次性方法相比，由于本發(fā)明所述的方法是將外源基因整合到精原干細(xì)胞中，精原干細(xì)胞最終分化為精子，可以形成穩(wěn)定的永久性的轉(zhuǎn)基因。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1 目的基因oIGF-1的克隆一、RNA 的提取1、取組織(IOg左右)，立刻浸入ImL Trizol0樣品體積一般不超過Trizol體積的10%。用組織勻漿器使組織勻漿化。2、加入0. 2ml氯仿，用手劇烈振蕩15 30s混均，室溫靜置5 lOmin。3U2000rp/min離心15min，樣品會(huì)分三層下層有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色的水相，RNA主要存在于水相中，把水相(不要吸取中間層的任何物質(zhì))移到一新的1.5mL微量印管中；4、加入等體積的異丙醇，室溫靜置lOmin。5、12，000rp/min離心lOmin，棄上清，加入Iml 75%乙醇振蕩混均。6、12，000rp/min離心5min，小心棄去上清，室溫或真空干燥5 lOmin，以便徹底去除殘余的乙醇；最后用50 μ L無(wú)RNA酶去離子水洗提，10，000rp/min離心lmin。印管中的液體即為所要的總RNA。直接RT-PCR或放于-80°C冰箱備用。
二、RT-PCR 以提取的RNA為模板，按一步法RT-PCR試劑盒說明書擴(kuò)增目的基因。RT-PCR反應(yīng)體系在DEPC浸泡過的無(wú)菌0. 2mL EP管中依次加入5Xone step PCR Buffer5μ LMgC12(25mM)10 μ LdNTP Mixture5 μ LRNase Inhibitor1 μ LAMV Reverse Transcriptase 1 μ LAMV optimized1 μ LRNA 模板2 μ LFP2 μ LRP2 μ L用RNA free ddH20 補(bǔ)充至總體積為 50 μ L。RT-PCR 反應(yīng)條件50°C 40min ；94°C 3min ；94°C 50s，54°C 30s, 72°C lmin，擴(kuò)增 36 個(gè)循環(huán)后，最后 72°C再延伸 lOmin。三、切膠回收經(jīng)過1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳后，用紫外燈觀察電泳條帶與目的片段 oIGF-1 (GenBank M30653)大小基本一致，切膠回收電泳條帶。按照上海生工生物工程有限公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書操作，具體操作步驟如下1、在紫外燈下切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，大約100 150mg，使用長(zhǎng)波長(zhǎng)的紫外光，盡量縮短照射時(shí)間，減少誘導(dǎo)突變；2、加入凝膠熔化劑300 μ L，于50 60°C水浴5 lOmin，每2min混均一次，直至
凝膠完全融化；3、將融化的凝膠移至GenClean Column中，3，000rp/min室溫離心300s ；4、取出GenClean Column，棄去廢液，將GenClean Column管重新放回收集管中，加 Λ 500 μ L 洗脫液，8，000rpm/min,室溫離心 30s ；5、重復(fù)上述步驟一次；6、棄去廢液，10，OOOrp/min，室溫離心2min，徹底去除洗脫液；7、將GenClean Column管放回干凈的1. 5mL離心管中，于GenCleanColumn中央加入30 50 μ L Elution Buffer，37°C條件下放置2min (增加DNA的洗脫效率)。8、10000rp/min，室溫離心lmin，離心管中的液體即為目的基因。試驗(yàn)例2 重組質(zhì)粒Lenti-GFP-T2A-oIGF_l的制備把以上切膠回收的目的片段oIGF-l(羊IGF-1)與Lenti-GFP-T2A載體連接，連接方法按照本領(lǐng)域通用的方法在下列反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行，連接反應(yīng)體系目的片段(oIGF-1)4. 5 μ LLenti-GFP-T2A 載體0. 5 μ Lsolution I5 μ L
共10 μ L體系，將上述溶液混勻，離心后，于14 16°C連接過夜，獲得重組質(zhì)粒 Lenti-GFP-T2A-oIGF-l。試驗(yàn)例3 重組質(zhì)粒的高效包裝高效包裝是轉(zhuǎn)基因成功的前提。步驟如下1、取 IOul 重組 DNA (0. 5ug/ul)，與 490ulddH20，50ul 包裝 mix 禾口 500ul 轉(zhuǎn)染試劑混合均勻。根據(jù)DNA濃度調(diào)節(jié)ddH20量。2、室溫#置5分鐘。3、將達(dá)到 75%豐度的 293T 細(xì)胞換上 IOml 含 Tetracycline-free FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液。4、一滴一滴地將2中的轉(zhuǎn)染混合物均勻加入3中。5、輕輕swirl培養(yǎng)皿。6、靜置培養(yǎng) 48_60hr。7、收集上清液。8、500gxl0min離心，收取上清液。9、4C 20，000區(qū)離心4111·。10、棄上清。11、用 IOOul 0. 1% BSA-PBS 溶解沉淀。12、1 10作梯度稀釋，共8管13U0ul/well(24well-plate)轉(zhuǎn)染50%豐度3T3細(xì)胞，4-5天后觀察轉(zhuǎn)染效率。試驗(yàn)例4 永久轉(zhuǎn)基因的生殖細(xì)胞的獲得使用時(shí)，將PBS加入使高效包裝的重組質(zhì)?；謴?fù)原體積，視體積大小，將10 15ml (加0. 0lug/ml輔佐試劑)分別注入曲細(xì)精管和睪丸其它部位，操作方法是以超聲波影像引導(dǎo)，用B型超聲波探頭找到睪丸網(wǎng)(retetestis)，順長(zhǎng)軸方向進(jìn)針，緩慢注入曲細(xì)精管和睪丸其它部位。如此內(nèi)外注射以利包裝顆粒接觸雄性生殖干細(xì)胞，即精原干細(xì)胞。該技術(shù)可使生殖細(xì)胞永久轉(zhuǎn)基因，所轉(zhuǎn)基因可遺傳給下一代，總體轉(zhuǎn)基因效率高達(dá)90%以上， 下游操作簡(jiǎn)便，可以推廣使用。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)通過分子生物學(xué)技術(shù)和生物學(xué)效應(yīng)檢測(cè)，例如RT-PCR，real-time PCR, Southern blot, Western blot 等等。試驗(yàn)例5 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)-DNA的提取1、用移液器取0. 6ml血液放入一個(gè)新的1. 5ml離心管中，再加入等體積PBS緩沖液，充分混合均勻，12000r/min離心15分鐘，棄去上清液。2、重復(fù)步驟(1)至上清液澄清透明。3、再加入0. 6ml的DNA抽提緩沖液在離心管中，用移液槍槍頭反復(fù)吹打混勻，但是
應(yīng)避免白細(xì)胞粘附于離心管壁上。4、加入蛋白酶K至終濃度于120mg/ml，用槍頭反復(fù)吹打混勻，封口膜將離心管封口，放入水浴鍋內(nèi)55 °C消化過夜。5、將裝有DNA溶液的離心管取出放于室溫內(nèi)使管內(nèi)的溶液冷卻到室溫，再加入等體積的Tris飽和酚，緩慢的轉(zhuǎn)動(dòng)離心管10分鐘(避免劇烈振動(dòng)使DNA序列斷裂)，使其充分混勻，再放入離心機(jī)內(nèi)12000r/min離心20分鐘，將其上清液轉(zhuǎn)至一新的離心管內(nèi)。
6、在取出的上清液中再加入等體積的Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇(25 24 1) 混合液，緩慢的轉(zhuǎn)動(dòng)離心管20分鐘(避免劇烈振動(dòng)使DNA序列斷裂)，再在離心機(jī)內(nèi) 12000r/min離心10分鐘，將其上清液轉(zhuǎn)至一新的離心管內(nèi)。7、在取出的上清液中再加入等體積酚氯仿(24 1)，緩慢的轉(zhuǎn)動(dòng)離心管10分鐘 (避免劇烈振動(dòng)使DNA序列斷裂)，再放入離心機(jī)內(nèi)12000r/min離心10分鐘，將其上清液
轉(zhuǎn)至一新的離心管內(nèi)。8、在取出的上清液中再加入等體積氯仿，緩慢的轉(zhuǎn)動(dòng)離心管10分鐘(避免劇烈振動(dòng)使DNA序列斷裂)，再放入離心機(jī)內(nèi)12000r/min離心10分鐘，將其上清液轉(zhuǎn)至一新的離心管內(nèi)。9、在取出的上清液中再加入加0. 1倍體積的NaAc緩沖液和2倍體積的無(wú)水冰乙醇用于沉淀DNA，緩慢的轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，可見白色DNA絮狀沉淀。10、將絮狀DNA用槍頭挑出放到另一新的1.5ml離心管中，然后加-20°C預(yù)冷的 70%乙醇洗兩次，12000r/min離心10分鐘，打開離心管放置于室溫條件下以便去除殘留的乙醇，將DNA放置通風(fēng)處干燥，最后加入適量TE溶解，4°C保存。實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因檢泖丨_目的基因的擴(kuò)增一、DNA的擴(kuò)增以提取的DNA為模板，試劑盒說明書擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)體系在滅菌處理過的EP管中依次加入10XPCR buffer5μ LdNTP Mixture1 μ LMgC12(25mM)3μ L質(zhì)粒模板2 μ LFP1 μ LRP1 μ LTaqDNA 聚合酶0· 5 μ L加滅菌去離子水補(bǔ)充至總體積50 μ L。反應(yīng)條件如下95°C 4min -MV 35s，56°C 50s, 72°C Imin循環(huán)35次；72°C再延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR結(jié)果。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟以超聲波影像引導(dǎo)，用B型超聲波抬頭找到睪丸網(wǎng)，順長(zhǎng)軸方向進(jìn)針，緩慢將外源包裝質(zhì)粒注入曲細(xì)精管和睪丸其他部位，得到動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因生殖細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于， 在所述得到動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因生殖細(xì)胞之前還包括下述步驟(1)、擴(kuò)增目的基因片段；(2)、將擴(kuò)增的目的基因片段與Lenti-GFP-T2A載體連接，獲得重組質(zhì)粒；(3)、將步驟(2)的重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中進(jìn)行高效包裝，使滴度達(dá)到108或轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上，獲得外源包裝質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于， 步驟⑴中所述的目的基因片段為oIGF-1片段；所述步驟⑵中擴(kuò)增的目的基因片段與 Lenti-GFP-T2A載體連接是在 Oigf-I 片段 4· 5μ L、Lenti-GFP-T2A載體 0. 5μ L和 solution I 5 μ L，共10 μ L的連接體系中，將上述溶液混勻，離心后，于14 16°C連接過夜，得到重組質(zhì)粒 Lenti-GFP-T2A-oIGF-l。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法中所采用的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒是通過將目的基因片段與Lenti-GFP-T2A載體連接后獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法中所采用的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒是通過將目的基因片段oIGF-1與Lenti-GFP-T2A載體連接后獲得重組質(zhì)粒Lenti-GFP-T2A-oIGF-l。
6.一種永久轉(zhuǎn)基因的生殖細(xì)胞，其特征在于所述永久轉(zhuǎn)基因的生殖細(xì)胞是通過權(quán)利要求1 3中任一權(quán)利要求所述的通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法制得的。
全文摘要
本發(fā)明一種通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法、重組質(zhì)粒和永久轉(zhuǎn)基因的生殖細(xì)胞，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的通過精原干細(xì)胞獲得動(dòng)物永久轉(zhuǎn)基因的方法包括下述步驟(1)擴(kuò)增目的基因片段；(2)將擴(kuò)增的目的基因片段與Lenti-GFP-T2A載體連接，獲得重組質(zhì)粒；(3)將步驟(2)的重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中進(jìn)行高效包裝；(4)將步驟(3)的外源包裝質(zhì)粒分別注入曲細(xì)精管和睪丸其它部位，獲得永久轉(zhuǎn)基因的生殖細(xì)胞。本發(fā)明具有超高轉(zhuǎn)基因效率，整體轉(zhuǎn)基因效率可達(dá)90％以上；能夠持續(xù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因精子；而且轉(zhuǎn)基因精子應(yīng)用方便；可以形成穩(wěn)定的永久性的轉(zhuǎn)基因的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102212526SQ20111008291
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者曹文廣 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所