專利名稱：一種穩(wěn)定聯(lián)產(chǎn)異丙醇和丁醇的工程菌及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，尤其涉及一種穩(wěn)定聯(lián)產(chǎn)異丙醇和丁醇的工程菌及其構建方法與應用。
背景技術：
隨著能源與環(huán)境危機的日益加重，迫使人們去尋找新的方法來逐步減少對于化石資源的依賴。通過微生物利用可再生資源來生產(chǎn)化學品是重要的途徑之一。異丙醇(isopropanol)是重要的化工產(chǎn)品和原料。主要用于制藥、化妝品、塑料、 香料、涂料及電子工業(yè)上用作脫水劑及清洗劑。異丙醇作為低成本溶劑或萃取劑在工業(yè)和消費產(chǎn)品中的生產(chǎn)中廣泛應用。低品質的異丙醇還可用在汽車燃料中。在許多情況下異丙醇可代替乙醇使用。2010年我國對異丙醇的年需求總量將達到30萬噸，我國異丙醇主要用作油墨、涂料和制藥工業(yè)過程中的溶劑或萃取劑，其消費量約占異丙醇總消費量的60%。 在化學中間體領域，我國異丙醇主要用于生產(chǎn)異丙胺、異丙醚以及一些酯類，其消費量約占異丙醇總消費量的25%。異丙醇在其他方面的應用主要包括電子工業(yè)清洗劑、汽車防凍液、 消毒劑、洗滌用品、日化產(chǎn)品等，其消費量約占異丙醇總消費量的15%。丁醇是一種優(yōu)良的可替代汽油的生物燃料，這是因為丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當，含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，不會腐蝕管道，便于管道輸送；蒸汽壓低， 安全性高，且能與汽油以任意比混合，因此是一種極具潛力的新型生物燃料。同時丁醇還是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、溶劑、萃取劑等，是一種高附加值化學品，全球年需求量超過140萬噸。1861年巴斯德首次發(fā)現(xiàn)細菌能夠產(chǎn)生丁醇，1912年魏茲曼(Weizmarm)發(fā)現(xiàn)了一種梭菌Clostridium acetobutylicum能夠將淀粉轉化為丙酮、丁醇及乙醇。有研究發(fā)現(xiàn)拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B593和NESTE 255可以在細胞內合成大約 IOOmM的異丙醇，其合成機理是通過一種異丙醇醇脫氫酶(又稱次級醇脫氫酶，secondary alcohol dehydregenase, SADH)將丙酮催化成異丙醇。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種聯(lián)產(chǎn)異丙醇和丁醇的工程菌及其構建方法與應用。本發(fā)明所提供的工程菌，按照包括如下步驟的方法構建將次級醇脫氫酶的編碼基因(sadh)整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，得到的重組菌即為所述工程菌。該方法使得次級醇脫氫酶的編碼基因能夠隨著染色體的復制而復制，實現(xiàn)穩(wěn)定表達。所述次級醇脫氫酶具體可為如下a)或b)的蛋白質a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有如下功能由(a)衍生的蛋白質將丙酮催化成異丙醇。所述次級醇脫氫酶的編碼基因具體可為如下1)或幻或；3)的基因
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼所述次級醇脫氫酶的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述次級醇脫氫酶的DNA 分子。所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，可通過下述任一種方法實現(xiàn)同源重組法、二型內含子整合法、特異位點整合法和隨機位點整合法。但不限于這幾種方法，包括任何可以在基因組中進行整合外源基因的方法。所述同源重組方法包括使用自殺載體進行重組，也包括使用復制性質粒和線性 DNA片段進行的重組方式。所述同源重組方法的整合位點是指染色體任何可以插入外源片段的位點。所述二型內含子整合法具體可為通過Li. ItrB 二型內含子的方法插入到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中。其中，插入位點是指產(chǎn)丁醇梭菌基因組中任何可以允許插入的DNA位點。所述特異位點整合法是將次級醇脫氫酶的編碼基因(sadh)通過特異位點的重組酶的幫助插入到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中。所述隨機位點整合法是將次級醇脫氫酶的編碼基因(sadh)通過以隨機方式整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中。所述隨機方式整合包括轉座子和噬菌體等機制的外源DNA整合到產(chǎn)丁醇梭菌基因組的方式。所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，可通過將所述次級醇脫氫酶的編碼基因整合到所述產(chǎn)丁醇梭菌的染色體中的如下位點實現(xiàn)尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因(UPP)位點或16S rDNA位點。但不限于這幾個位點，包括基因組中任何可以整合外源基因的DNA位點。所述產(chǎn)丁醇梭菌具體可為丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌，但不限于這兩株菌，也包括其它可以生產(chǎn)丁醇的梭菌。產(chǎn)丁醇梭菌可以是野生型菌株，也可以是經(jīng)過誘變或遺傳改造后的菌株。所述產(chǎn)丁醇梭菌包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌 (Clostridium bei jerinckii) >C. saccharoperbutylacetonicum禾口C. saccharobutylicum, 不僅包括野生型菌株，也包括經(jīng)過誘變和基因工程方法改造后的產(chǎn)丁醇梭菌。所述拜氏梭菌(C. bei jerinckii)具體可為拜氏梭菌(C. bei jerinckii) NCIMB8052，所示丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)具體可為丙酮丁醇梭菌 SMB009。所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，可通過將如下片段導入所述產(chǎn)丁醇梭菌中實現(xiàn)由所述次級醇脫氫酶的編碼基因和啟動所述次級醇脫氫酶的編碼基因轉錄的啟動子組成的DNA片段；所述啟動子具體可為丙酮丁醇梭菌硫解酶啟動子(Pthl)，序列為序列表中序列2或序列8的第287至436位，但不限于Pthl，也包括其它在產(chǎn)丁醇梭菌可以行使功能的啟動子。由所述次級醇脫氫酶的編碼基因和啟動所述次級醇脫氫酶的編碼基因轉錄的啟動子組成的DNA片段的核苷酸序列具體可為序列8的第觀7-1498位。
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所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，可通過將 pEK18-upp (8052)-sadh導入所述產(chǎn)丁醇梭菌中實現(xiàn)。所述pEK18_upp (805 -sadh是將如下DNA片段插入pEK18-upp(8052)的多克隆位點得到的重組載體由序列1所示的次級醇脫氫酶編碼基因sadh和啟動sadh轉錄的序列8的第287至436位或序列2所示的丙酮丁醇梭菌硫解酶啟動子(Pthl)組成的DNA片段；所述pEK18-upp (805 是將序列4所示的尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因(upp)上游片段和序列5所示的尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因(upp) 下游片段插入PEK18的多克隆位點得到的中間重組載體；所述pEK18-upp (805 中，所述尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因(upp)上游片段位于所述尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因(upp)下游片段的上游；所述PEK18為將紅霉素抗性基因插入pKlSmobsacB的多克隆位點得到的另一中間重組載體。所述紅霉素抗性基因的核苷酸序列具體可為序列3。所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，還可通過將 PEK18-16S (8052)-sadh導入所述產(chǎn)丁醇梭菌中實現(xiàn)。所述pEK18_16S (8052)-sadh按照如下方法構建1)利用引物 16S(8052)-1(CGCGAATTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACG)、16S(8052 )-2 (TATCTGCAGTACTTTCCTCTCCTGCACTCTAG)從拜氏梭菌 NCIMB8052 基因組中擴出 0. 7kb 的 16S rDNA 基因上游片段，利用引物 16S (8052) -3 (CGACTCGAGCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATTAG)和 16S (8052) -4 (GCGAAGCTTAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGG)擴出 0. 9kb 的 16S rDNA 基因下游片段。先利用EcoRI和I3StI位點，將0. 7kb的片段連接到pEK18_upp (8052)-sadh中，得到的質粒再用XhoI和HindIII位點連入0. 9kb片段，得到pEK18_16S(8052)-sadh。所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，還可通過將 pMTL009-upp-sadh導入所述產(chǎn)丁醇梭菌中實現(xiàn)。所述pMTL009-upp-sadh按照包括如下步驟的方法構建1) upp基因敲除質粒pMTL009_upp的構建引物uppl20/121s-IBS AAAAAAGCTTATAATTATCCTTAGCAATGCTAATGGTGCGCCCAGATAGGGTG聊120/12 ls-EBS2 TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTATTGCTCGATAGAGGAAAGTGTCTupp120/12Is-EBSld CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCCTAATGGCTAACTTACCTTTCTTTGTEBS Universal CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAAAC以 pMTL009 質粒為模板，分別以 uppl20/121s_IBS 和 ^S Universal 為一對引物，以upp 120/12Is-EBSld ^P uppl20/121s_EBS2為另一對引物，進行PCR擴增，將得到的兩段PCR產(chǎn)物進行融合PCR(融合PCR的模板為兩段產(chǎn)物，引物為uppl20/121s-IBS和 uppl20/121s-EBSld)，得到!353bp 的 PCR 產(chǎn)物，隨后用 HindIII 和 BsrGI 對該!353bp 的 PCR 產(chǎn)物和pMTL009質粒進行酶切連接，得到pMTL009-upp。2)構建sadh基因的基因組插入載體pMTL009_upp-sadh使用引物uppl20/121s-IBS 和引物 59Hntron_2
(ATCGACTAGTCGCCACGTAATAAATATCTGGACG)以 pMTL009_upp 為模板，擴增出內含子片段 intron，用引物 592-Pthl-sadh-l(ATCGACGCGTTCTAGACTCGAGTATATTGATAAAAATAATAATAGTGGG)禾口593-Pthl-sadh-2 (ATCGACTAGTTTATAATATAACTACTGCTTTAATTAAGTC)從 pSADH 質粒中擴增Pthl-sadh片段，將上述兩個PCR產(chǎn)物與pMTL009-upp載體混合，用HindIII、SpeI、 MluI 二型限制性內切酶進行酶切后連接得到pMTL009-upp-Sadh ；所述pSADH是將如下DNA 片段插入PlTF多克隆位點得到的重組質粒由序列1所示的次級醇脫氫酶編碼基因sadh 和啟動sadh轉錄的序列8的第287至436位或序列2所示的丙酮丁醇梭菌硫解酶啟動子 (Pthl)組成的DNA片段；該DNA片段的核苷酸序列具體可為序列8的第觀7_1498位。由上述方法得到的工程菌具體可為將pEK18-upp (8052) -sadh導入拜氏梭菌 (C. beijerinckii)NCIMB8052,得到的所述次級醇脫氫酶的編碼基因(sadh)整合到拜氏梭菌(C. beijerinckii)NCIMB8052的基因組中的重組菌；所述工程菌具體還可為將 PEK18-16S(8052)-sadh 導入拜氏梭菌(C. beijerinckii)NCIMB8052,得到的所述次級醇脫氫酶的編碼基因(sadh)整合到拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052的基因組中的重組菌；所述工程菌具體還可為將pMTL009-upp-Sadh導入丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetObutylicum)SMB009，得到的所述次級醇脫氫酶的編碼基因(sadh)整合到丙酮丁醇梭菌SMB009的基因組中的重組菌，如保藏號為CGMCC No. 47 的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB312。丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum) SMB312 已于 2011 年 3 月 31 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)。上述工程菌可在如下條件下發(fā)酵生產(chǎn)醇發(fā)酵溫度為35°C -40°C，所述發(fā)酵溫度具體為351、371或401；發(fā)酵時間可為55h_65h，所述發(fā)酵時間具體為5^i、60h或65h ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5-6. 95，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH具體為6. 5,6. 75或 6. 95。實驗證明本發(fā)明的工程菌可以穩(wěn)定地生產(chǎn)丁醇、異丙醇和乙醇。


圖1為將次級醇脫氫酶的編碼基因(sadh)通過同源重組方法整合到拜氏梭菌 NCIMB8052基因組upp位點示意2為將次級醇脫氫酶的編碼基因(sadh)通過二型內含子插入方法整合到丙酮丁醇梭菌SMB009基因組upp位點圖 2 中，pEK-upp-sadh 表示 pEK18_upp (8052) -sadh圖3為菌株SMB310測序驗證結果圖3中，有下橫線部分表示插入的Pthl-sadh片段(粗體部分表示酶切位點)，其它序列為UPP基因上、下游的染色體序列圖4為菌株SMB311測序驗證結果圖4中，有下橫線部分表示插入的Pthl-sadh片段(粗體部分表示酶切位點)，其它序列為染色體上16s rDNA基因序列
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、將次級醇脫氫酶的編碼基因sadh通過同源重組方法整合到拜氏梭菌 NCIMB8052基因組upp位點1)次級醇脫氫酶編碼基因sadh的克隆及表達元件構建采用細菌基因組提取試劑盒提取拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B593(購自ARS(NRRL)Culture Collection)的基因組DNA，以此為模板，用以下引物進行 PCR擴增 B593-1 :CGCGGATCCATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGGTATTAATAA B593-2 :CCGGAATTCTTATAATATAACTACTGCTTTAATTAAGTC 使用的DNA聚合酶為TAKARAPrimerSTAR HS高保真酶，PCR擴增程序為
權利要求
1.一種工程菌的構建方法，包括如下步驟將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，得到的重組菌即為所述工程菌。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述次級醇脫氫酶是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有如下功能由(a)衍生的蛋白質將丙酮催化成異丙醇。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述次級醇脫氫酶的編碼基因為如下1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼所述次級醇脫氫酶的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或幻限定的DNA序列雜交且編碼所述次級醇脫氫酶的DNA分子。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，通過下述任一種方法實現(xiàn)同源重組法、二型內含子整合法、特異位點整合法和隨機位點整合法。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，通過將所述次級醇脫氫酶的編碼基因整合到所述產(chǎn)丁醇梭菌的染色體中的如下位點實現(xiàn)尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因位點或16SrDNA位點。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)丁醇梭菌為丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，通過將如下片段導入所述產(chǎn)丁醇梭菌中實現(xiàn)由所述次級醇脫氫酶的編碼基因和啟動所述次級醇脫氫酶的編碼基因轉錄的啟動子組成的DNA片段；所述啟動子具體可為丙酮丁醇梭菌硫解酶啟動子；所述丙酮丁醇梭菌硫解酶啟動子的序列具體可為序列表中序列2或序列8的第287至436位；由所述次級醇脫氫酶的編碼基因和啟動所述次級醇脫氫酶的編碼基因轉錄的啟動子組成的DNA片段的核苷酸序列具體可為序列8的第觀7-1498位。
8.權利要求1-7中任一所述的方法得到的工程菌。
9.根據(jù)權利要求8所述的工程菌，其特征在于所述工程菌為下述a或b或c所述的重組菌a、將pEK18-upp(8052)-sadh 導入拜氏梭菌(C. bei jerinckii)NCIMB8052，得到的所述次級醇脫氫酶的編碼基因整合到拜氏梭菌(C. bei jerinckii) NCIMB8052的基因組中的重組菌；b、將pEK18-16S(8052)-sadh 導入拜氏梭菌(C. bei jerinckii) NCIMB8052，得到的所述次級醇脫氫酶的編碼基因整合到拜氏梭菌(C. bei jerinckii) NCIMB8052的基因組中的重組菌；c、將 pMTL009-upp-sadh 導入丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) SMB009, 得到的所述次級醇脫氫酶的編碼基因整合到丙酮丁醇梭菌SMB009的基因組中的重組菌， 如保藏號為 CGMCC No. 4724 的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) SMB312。
10.權利要求9所述的工程菌在生產(chǎn)醇中的應用，所述醇為下述三種醇中的至少一種 丁醇、異丙醇和乙醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定聯(lián)產(chǎn)異丙醇和丁醇的工程菌及其構建方法與應用。該工程菌的構建方法，包括如下步驟將次級醇脫氫酶的編碼基因整合到產(chǎn)丁醇梭菌的基因組中，得到的重組菌即為所述工程菌。所述次級醇脫氫酶是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表中序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有如下功能由(a)衍生的蛋白質將丙酮催化成異丙醇。該工程菌可以穩(wěn)定地生產(chǎn)丁醇、異丙醇和乙醇。
文檔編號C12N15/63GK102199614SQ20111008426
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月2日 優(yōu)先權日2011年4月2日
發(fā)明者張延平, 戴宗杰, 李寅, 董紅軍 申請人:中國科學院微生物研究所