專利名稱：重組人凝血因子ix小基因及其ptc突變體穩(wěn)定細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)，基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)，具體涉及一種重組人凝血因子IX小基因及其PTC突變體穩(wěn)定細(xì)胞株的建立方法和依照該方法建立的重組人凝血因子IX小基因及其PTC突變體穩(wěn)定細(xì)胞株。
背景技術(shù)：
血友病(haemophilia)是一種X染色體連鎖隱性遺傳性疾病。分為HA、HB兩型， 分別是由于編碼凝血因子VIII(FS)和凝血因子IX(F9)基因突變引起的血液中兩個(gè)因子的活性降低或含量減少導(dǎo)致的先天性凝血機(jī)制障礙性疾病。社會(huì)人群發(fā)病率5-10/10萬，嬰兒發(fā)病率約1/5000，屬于高發(fā)病性遺傳疾病。在血友病患者中約有80%為重型。血友病目前仍沒有理想的治療方案，以替代療法為主，輸注新鮮血漿、從血漿中提取的或基因工程制備的凝血因子，治療費(fèi)用昂貴，而且輸注后有可能產(chǎn)生抗體，給血友病患者及其家庭造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力。對血友病數(shù)據(jù)網(wǎng)立占(http://europium, csc. mrc. ac. uk, HAMSTeRS database 禾口 http://www. kcl. ac. uk)登記的突變基因序列分析結(jié)果顯示，血友病的凝血因子缺陷主要是錯(cuò)義或無義、刪除或插入突變導(dǎo)致。對于F8因子基因，在沈個(gè)外顯子中共有781個(gè)突變位點(diǎn)，其中無義突變達(dá)到了 145，占到總突變的18. 6%，無義突變發(fā)生的熱點(diǎn)區(qū)域位于第14 個(gè)外顯子的719-1709，共有56個(gè)無義密碼子出現(xiàn)；對于F9因子基因，630已報(bào)道的點(diǎn)突變中，70個(gè)為無義突變，占到突變總數(shù)的11.1%。基因無義突變后由于產(chǎn)生PTC，很有可能弓I 發(fā)機(jī)體mRNA檢測系統(tǒng)NMD途徑的發(fā)生，從而降解這種含有PTC的mRNA，進(jìn)而導(dǎo)致其蛋白水平很低。目前基因內(nèi)PTC的通讀和NMD途徑機(jī)制研究是分子細(xì)胞生物學(xué)的熱點(diǎn)之一，對由此導(dǎo)致的遺傳疾病的治療具有潛在應(yīng)用價(jià)值。研究表明在體外，氨基糖甙類(gentamicine 和geneticine)化合物能夠結(jié)合到核糖體的識別中心(decoding center)，降低密碼子和反密碼子配對的準(zhǔn)確性，引起mRNA中密碼子的錯(cuò)讀，在培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞和人體細(xì)胞中都得到了實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。對NMD途徑的抑制與藥物促PTC通讀表達(dá)已經(jīng)用于基因無義突變導(dǎo)致的癌癥、腫瘤和部分遺傳疾病的機(jī)理研究，并且取得了長足的進(jìn)展，取得了一系列有意義的分子學(xué)數(shù)據(jù)和試驗(yàn)結(jié)果。目前國內(nèi)外尚無一細(xì)胞株可用于由于無義突變導(dǎo)致的血友病的藥物篩選，因此急需建立相應(yīng)的細(xì)胞株供體外篩選由于無義突變導(dǎo)致的血友病的潛在藥物，更可用于篩選由于無義突變引發(fā)的遺傳性疾病的臨床治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組人凝血因子IX小基因及其PTC突變體的穩(wěn)定細(xì)胞株，該穩(wěn)定細(xì)胞株可以用于體外篩選由于無義突變導(dǎo)致的血友病及其他遺傳性疾病的臨床治療藥物。本發(fā)明提供的一種重組人凝血因子IX小基因，含有外顯子1+部分內(nèi)含子1 (699bp)、部分內(nèi)含子5+外顯子6+部分內(nèi)含子6 (2115bp)、部分內(nèi)含子6+外顯子7+內(nèi)含子 7+外顯子 8+HA 標(biāo)簽(1536bp)；其中 7 124、1599 1801、3059 3173、3842 4371 位為外顯子，4372 4401位為HA標(biāo)簽序列；其核苷酸序列為SEQ ID NO :1。本發(fā)明提供的一種重組人凝血因子IX小基因PTC突變體，其是由所述的重組人凝血因子IX小基因通過PCR定點(diǎn)突變技術(shù)將其核苷酸序列中3092位由g突變?yōu)閠。本發(fā)明提供的一種穩(wěn)定細(xì)胞株，其含有上述重組人凝血因子IX小基因。本發(fā)明提供的一種穩(wěn)定細(xì)胞株，其含有上述重組人凝血因子IX小基因PTC突變體。本發(fā)明提供的一種穩(wěn)定細(xì)胞株的建立方法，包括如下步驟1)利用基因重組技術(shù)將人凝血因子IX小基因(mini hF9A)克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCMV-Tag;3B中，構(gòu)建成pCMV-TagiBB-mini hF9A，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定；2)利用PCR快速定點(diǎn)突變方法，得到3092位由g突變?yōu)閠，人凝血因子IX小基因的 PTC 突變質(zhì)粒 pCMV-Tag;3B-mini hF9A_N ；3)培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞H印G2，培養(yǎng)液為DMEMj^W 10%胎牛血清，不添加任何抗生素培養(yǎng)，胰酶消化細(xì)胞，按2X IO5CelVmL密度種于6孔板；4)利用脂質(zhì)體 LipofectamineTM 2000 將質(zhì)粒 pCMV-Tag3B_mini hF9A 和 PCMV-Tag3B-minihF9A-N分別轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染M小時(shí)后，胰酶消化細(xì)胞，按1 10稀釋接種于6孔板，加G418 (500 μ g/mL)篩選，每3 5天更換一次含有G418的篩選培養(yǎng)液；5)篩選3周左右，6孔板出現(xiàn)陽性細(xì)胞簇，顯微鏡下挑取細(xì)胞簇，采用有限稀釋法在96孔板中進(jìn)行單克隆化；6)96孔板中單細(xì)胞增殖過程中，用胰酶消化吹散使其重新貼壁生長，待長至80% 以上，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并通過RT-PCR進(jìn)行鑒定；7)對于RT-PCR鑒定陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取基因組，進(jìn)行PCR鑒定，最終獲得兩種細(xì)胞穩(wěn)定株H印G2-WT和H印G2-N ；8)將兩種細(xì)胞穩(wěn)定株H印G2-WT和H印G2-N凍于液氮中保藏。本發(fā)明建立的穩(wěn)定細(xì)胞株!fepG2-WT基因組整合野生型的人凝血因子IX小基因； H印G2-N基因組整合含有PTC突變并發(fā)生NMD途徑的人凝血因子IX小基因。本發(fā)明建立的H印G2-WT、HepG2-N細(xì)胞株，可用于無義突變導(dǎo)致血友病的治療藥物的篩選、PTC通讀藥物的篩選等。此外本發(fā)明建立的穩(wěn)定細(xì)胞株還可用于對NMD途徑的抑制與藥物促PTC通讀表達(dá)進(jìn)而用于基因無義突變導(dǎo)致的癌癥、腫瘤和部分遺傳疾病的機(jī)理研究。


圖1是重組人凝血因子IX小基因組成示意圖。該小基因含有外顯子1+部分內(nèi)含子1 (699bp)、部分內(nèi)含子5+外顯子6+部分內(nèi)含子6 QlMbp)、部分內(nèi)含子6+外顯子7+內(nèi)含子7+外顯子8+HA標(biāo)簽(1536bp)。圖2是重組人凝血因子IX小基因真核表達(dá)載體鑒定圖及示意圖。A為鑒定圖，泳道1為重組質(zhì)粒；泳道2為PCR鑒定；泳道3為雙酶切鑒定。B為示意圖。圖3是重組人凝血因子IX小基因轉(zhuǎn)染IfepG2細(xì)胞的RT-PCR鑒定圖。泳道1為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞陰性對照；泳道2為重組人凝血因子IX小基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
圖4是重組人凝血因子IX小基因PTC突變體測序鑒定圖譜。圖5是重組人凝血因子IX小基因及其PTC突變體轉(zhuǎn)染!fepG2細(xì)胞M小時(shí)后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR圖。A, Real-time PCR檢測結(jié)果；B，Real-time PCR基因擴(kuò)增曲線；C， Real-timePCR基因溶解曲線，黃色為目的基因重組人凝血因子IX小基因，粉色為內(nèi)參照基因。圖6是本發(fā)明的穩(wěn)定細(xì)胞株H印G2-WT在倒置顯微鏡下QOO X)的細(xì)胞形態(tài)照片。圖7是本發(fā)明的穩(wěn)定細(xì)胞株!fepG2-N在倒置顯微鏡下QOO X)的細(xì)胞形態(tài)照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、重組人凝血因子IX小基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建利用BamH I和HindIII對人凝血因子IX小基因進(jìn)行雙酶切得到4. 4kb的基因片段，電泳回收。哺乳動(dòng)物高效表達(dá)載體PCMV-TagIBB也使用BamH I和HindIII雙酶切成線性載體，電泳回收。將其與回收的人凝血因子IX小基因片段使用T4DNA連接酶連接，得到重組質(zhì)粒pCMV-Tag;3B-mini hF9A，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定。2、重組人凝血因子IX小基因PTC突變體的構(gòu)建設(shè)計(jì)一對完全互補(bǔ)的突變引物，使3092位堿基由g突變?yōu)閠，使用高保真酶以重組質(zhì)粒pCMV-Tag;3B-mini hF9A為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)Dpn I消化模板，取10 μ L產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌，挑取克隆提取質(zhì)粒，測序鑒定，得到突變質(zhì)粒pCMV-TagiBB-mini hF9A_N。3、哺乳動(dòng)物細(xì)胞H印G2的培養(yǎng)與傳代細(xì)胞來源于山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，復(fù)蘇好的細(xì)胞培養(yǎng)于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 37°C,5% CO2，培養(yǎng)液為DMEM，添加胎牛血清至終濃度為10%，不添加任何抗生素。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%以上即可傳代，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，棄去PBS，加入0. 25%胰酶消化液lmL，將培養(yǎng)瓶置于37°C培養(yǎng)箱預(yù)熱，待細(xì)胞變圓但尚未成片脫落時(shí)棄去胰酶，加入含 10%胎牛血清的DMEM終止消化，并輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，而后按照1 3分裝于3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加適量培養(yǎng)液培養(yǎng)。4、!fepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及篩選(1)轉(zhuǎn)染第一天，將H印G2細(xì)胞按2 X IO5ceIVmL密度種于6孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)使得次日細(xì)胞匯合度達(dá)到90-95%。(2)轉(zhuǎn)染第二天，在無菌離心管中配置下列質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合液，用于轉(zhuǎn)染6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)的H印G2細(xì)胞。溶液A :4 μ g質(zhì)粒DNA溶于250 μ L無血清培養(yǎng)基中。溶液B 10 μ LLipofectamine 2000溶于250 μ L無血清培養(yǎng)基中，室溫放置5_15分鐘?；旌先芤?A和溶液B，輕輕混勻，室溫放置20分鐘以上。將混勻的溶液500 μ L加至6孔培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻，37°C，5% CO2培養(yǎng)M小時(shí)。(3)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選轉(zhuǎn)染M小時(shí)后，胰酶消化細(xì)胞，按1 10稀釋接種于6孔培養(yǎng)板中，加 G418 (500 μ g/mL)篩選，每3 5天更換一次含有G418的篩選培養(yǎng)液，篩選3周左右，可見陽性細(xì)胞簇。(4)細(xì)胞株的單克隆化及擴(kuò)大培養(yǎng)
篩選3周左右，6孔板出現(xiàn)陽性細(xì)胞簇，顯微鏡下挑取細(xì)胞簇，采用有限稀釋法在 96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行單克隆化。96孔板中單細(xì)胞增殖過程中，用胰酶消化吹散使其重新貼壁生長，待長至80%以上，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并通過RT-PCR進(jìn)行鑒定。對于RT-PCR鑒定陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取基因組，PCR鑒定，最終獲得兩種細(xì)胞穩(wěn)定株H印G2-WT和H印G2-N，并凍存于液氮中。5、人凝血因子IX小基因及其PTC突變體在穩(wěn)定細(xì)胞株中的表達(dá)(1)人凝血因子IX小基因的PCR根據(jù)人凝血因子IX小基因序列兩端分別帶myc、HA標(biāo)簽，設(shè)計(jì)一對特異標(biāo)簽引物， 擴(kuò)增片段應(yīng)為4449bp大小。pCMV-Tag3B-mini hF9A質(zhì)粒作為陽性對照，未轉(zhuǎn)染的H印G2細(xì)胞作為陰性對照，以穩(wěn)定細(xì)胞株H印G2-WT和H印G2-N的基因組DNA為模板擴(kuò)增，經(jīng)30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析?？梢妰蓸悠贩謩e在4000多bp處有一特異條帶，與陽性對照條帶大小相同，而未轉(zhuǎn)染的H印G2細(xì)胞基因組DNA中無擴(kuò)增條帶。說明凝血因子IX小基因及其突變體已分別成功導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。(2)人凝血因子IX小基因的RT-PCR根據(jù)人凝血因子IX小基因序列兩端分別帶myc、HA標(biāo)簽，設(shè)計(jì)一對特異標(biāo)簽引物， 擴(kuò)增片段應(yīng)為1041bp大小。未轉(zhuǎn)染的!fepG2細(xì)胞作為陰性對照，以穩(wěn)定細(xì)胞株H印G2-WT 和!fepG2-N的mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，經(jīng)30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳分析?？梢妰蓸悠贩謩e在1000多bp處有一特異條帶，而未轉(zhuǎn)染的IfepG2細(xì)胞基因組DNA 中無擴(kuò)增條帶。說明穩(wěn)定細(xì)胞株H印G2-WT和H印G2-N分別存在凝血因子IX小基因和其突變體在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種重組人凝血因子IX小基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :1。
2.一種重組人凝血因子IX小基因PTC突變體，其是由權(quán)利要求1所述的重組人凝血因子IX小基因通過PCR定點(diǎn)突變技術(shù)將其核苷酸序列中3092位由g突變?yōu)閠。
3.一種穩(wěn)定細(xì)胞株，其含有權(quán)利要求1所述的重組人凝血因子IX小基因。
4.一種穩(wěn)定細(xì)胞株，其含有權(quán)利要求2所述的重組人凝血因子IX小基因PTC突變體。
5.一種穩(wěn)定細(xì)胞株的建立方法，包括如下步驟1)利用基因重組技術(shù)將人凝血因子IX小基因(minihF9A)克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體 pCMV-Tag3B中，構(gòu)建成pCMV-TagiBB-mini hF9A，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定；2)利用PCR快速定點(diǎn)突變方法，得到3092位由g突變?yōu)閠，人凝血因子IX小基因的 PTC 突變質(zhì)粒 pCMV-Tag;3B-mini hF9A_N ；3)培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞H印G2，培養(yǎng)液為DMEMd^W10%胎牛血清，不添加任何抗生素培養(yǎng)，胰酶消化細(xì)胞，按2X IO5CelVmL密度種于6孔板；4)利用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000 將質(zhì)粒 pCMV-Tag3B_mini hF9A 和 PCMV-Tag3B-minihF9A-N分別轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染M小時(shí)后，胰酶消化細(xì)胞，按1 10稀釋接種于6孔板，加G418 (500 μ g/mL)篩選，每3 5天更換一次含有G418的篩選培養(yǎng)液；5)篩選3周左右，6孔板出現(xiàn)陽性細(xì)胞簇，顯微鏡下挑取細(xì)胞簇，采用有限稀釋法在96 孔板中進(jìn)行單克隆化；6)96孔板中單細(xì)胞增殖過程中，用胰酶消化吹散使其重新貼壁生長，待長至80%以上，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并通過RT-PCR進(jìn)行鑒定；7)對于RT-PCR鑒定陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取基因組，進(jìn)行PCR鑒定，最終獲得兩種細(xì)胞穩(wěn)定株H印G2-WT和H印G2-N ；8)將兩種細(xì)胞穩(wěn)定株H印G2-WT和H印G2-N凍于液氮中保藏。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含重組人凝血因子IX(F9)小基因和一種含重組人F9小基因PTC(premature termination codon，PTC)無義突變體的穩(wěn)定細(xì)胞株的建立方法以及依照該方法建立的含重組人F9小基因和其PTC突變體的兩種穩(wěn)定細(xì)胞株，屬于動(dòng)物細(xì)胞株領(lǐng)域。該細(xì)胞株的建立方法是將人凝血因子IX小基因(mini hF9A)和其PTC突變體(mini hF9A-N)分別導(dǎo)入HepG2細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選，得到穩(wěn)定細(xì)胞株。依照該方法建立的重組人凝血因子IX小基因及其PTC突變體穩(wěn)定細(xì)胞株命名為HepG2-WT和HepG2-N，由山西大學(xué)生物技術(shù)研究所保藏。其特點(diǎn)在于HepG2-WT基因組整合mini hF9A小基因；HepG2-N基因組整合含有PTC突變并發(fā)生NMD途徑的mini hF9A-N小基因。本發(fā)明建立的HepG2-WT、HepG2-N細(xì)胞株，可用于無義突變導(dǎo)致血友病的治療藥物的篩選、PTC通讀藥物的篩選等。
文檔編號C12N15/12GK102199607SQ20111008502
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者付月君, 張志云, 柴寶峰, 梁愛華, 王偉, 王剛, 申泉 申請人:山西大學(xué)