專利名稱：三重熒光定量rt-pcr檢測試劑盒及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，具體涉及一種三重 (三種探針)實時熒光定量RT-PCR在一個反應管內同時檢測胃腸炎腹瀉患者的糞便樣本中札如病毒、星狀病毒和腺病毒核酸及檢測方法，可應用于札如病毒、星狀病毒和腺病毒引起暴發(fā)疫情的實驗室應急檢測。
背景技術：
腹瀉病是世界范圍內影響人類健康的常見病和多發(fā)病，特別是引起嬰幼兒發(fā)病和死亡的主要原因之一。研究表明每年超過200萬嬰幼兒死于腹瀉有關疾病及其并發(fā)癥，其中超過80%的患者來于欠發(fā)達國家。雖然至少25種不同的細菌和病原微生物能引起胃腸炎，但是超過75%的病例是由病毒所引的。隨著分子生物檢測技術的提高，由病毒感染引起的腹瀉病越來越受到人們的關注。特別是秋冬季節(jié)嬰幼兒腹瀉80%以上由病毒引起。病毒性胃腸炎(又稱病毒性腹瀉)，是一組由多種病毒引起的急性腸道傳染病， 臨床特點是起病急、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉，排水樣便或稀便，也可有發(fā)病或全身不適等癥狀，病程短，死亡率低。病毒性胃腸炎是引起全世界特別是發(fā)展中國家兒童發(fā)病和死亡的主要原因之一。輪狀病毒(Rotavirus)、諾如病毒(Norovirus)、札如病毒(Human Calicivirus)、腺病毒(Adenovirus)40型和41型以及星狀病毒(Astrovirus)被認為是急性胃腸炎的常見病原。輪狀病毒是引起嬰幼兒重癥腹瀉的主要病原。幾乎每個兒童在5歲以前都感染過輪狀病毒，初次感染通常引起急性腹瀉，癥狀較重，全世界每年大約有1億多的5歲以下兒童患輪狀病毒腹瀉，其中2500萬兒童需要門診治療，200萬兒童需要住院治療，而且每年約有35萬 59萬兒童死于輪狀病毒腹瀉，82%的死亡兒童發(fā)生在發(fā)展中國家，目前輪狀病毒的方法學研究比較成熟，如RT-PCR、ELISA和膠乳凝集分析等方法。人類星狀病毒(Astrovirus，AstV)于1975年首次由Appleton等在急性胃腸炎患兒的糞便中用電鏡觀察到，此后，相繼在貓、鴨、羊、豬等動物的糞便中也發(fā)現了該類病毒。盡管發(fā)現AstV較早，但對其致病作用及其地位未引起重視，尤其是與腹瀉的關系在很長一段時間里認為其只會引起散發(fā)的、較輕微的腹瀉。隨著分子生物學技術的發(fā)展，對AstV 的各項研究逐步深入，認識至UAstV的感染率、發(fā)病率均高出預期結果，尤其在嬰幼兒人群中。一些國家的同類調查均發(fā)現AstV感染相當普遍，其致病性越來越不容忽視?，F已證實， AstV是引起嬰幼兒、老年人及免疫功能低下者腹瀉的重要原因之一，AstV急性胃 腸炎既可散發(fā)感染也可引起暴發(fā)流行，同時也是醫(yī)源性感染的重要病原。星狀病毒占兒童住院腹瀉病例的2. 5%-9%。20世紀50年代初，Rowe等在切除的兒童腺體細胞培養(yǎng)物的自發(fā)性退行性病變中，首次發(fā)現腺病毒(Adenovirus，AdV)，1975年Flewett等首次應用電鏡技術，從急性胃腸炎患兒糞便中發(fā)現與嬰幼兒胃腸炎直接相關的腺病毒。這些在電鏡下觀察到的大多數腺病毒，均不能在常規(guī)應用的腺病毒細胞培養(yǎng)系統中培養(yǎng)，這些腺病毒稱之為腸道腺病毒(Enteric Adenovirus，EAdv)。腸道腺病毒是一種新的導致嬰幼兒腹瀉的主要病原，主要感染5歲以下的嬰幼兒，特別是3歲以下的。腺病毒感染呈全球性分布，世界各地均有報道， 暴發(fā)流行的報道亦多見。腸道腺病毒可通過人與人接觸傳播，也可通過糞_ 口途徑和呼吸道傳播。腸道腺病40/41型引起超過7. 9%的兒童腹瀉病例。國內沒有暴發(fā)流行的報道，近年來北京、天津、鄭州等地有少量散發(fā)報道。隨著對AstV研究的不斷深入，其流行病學意義日益受到重視。國外有關AstV感染的報道已經有很多，目前我國相關報道還比較少。要全面認識我國AstV感染的臨床及流行病學特點，還有待進行深入研究。1995年程緒杰等首次在我國從腹瀉患兒糞便中分離到腸道腺病毒。EAdv感染呈全球性分布，世界各地均有報道， 暴發(fā)流行的報道亦多見。國內曹衛(wèi)中等報道崇明縣一起EAdv弓1起的感染性腹瀉暴發(fā)。 人類杯狀病毒包括諾如病毒(Norovirus)和札如病毒(Sapovirus)，是引起非菌性急性胃腸炎暴發(fā)的主要病因，也是僅次于輪狀病毒引起嬰幼兒急性腹瀉的常見病原之一。諾如病毒可在所有年齡段、不同場所(幼兒園、學校、餐館、夏令營、醫(yī)院、護嬰室、養(yǎng)老院、航海艦隊和部隊單位等)引起暴發(fā)。由于該病毒傳染性很強，?？蓪е峦话l(fā)性公共衛(wèi)生事件，美國已將其列為乙類生物恐怖因子。美國、日本、法國等國都爆發(fā)流行過諾如病毒，該病毒引起了世界各國的高度重視，我國衛(wèi)生部2007年特別制定了關于諾如病毒感染性腹瀉的防治方案。1995年方肇寅等首次在我國嬰幼兒腹瀉糞便標本中檢測到杯狀病毒，自此以后我國北京、廣州等地區(qū)陸續(xù)報導檢出杯狀病毒。近年來的研究顯示我國兒童中不僅有諾如感染，也有札如感染。札如病毒的檢出率雖然低于諾如病毒，但已有的研究顯示它已呈全球性分布，常引起暴發(fā)流行。國外對于札如病毒的研究較早，1977年在日本札幌通過電鏡進行檢測被發(fā)現以來，美國、英國、加拿大、日本、肯尼亞、南非和我國等世界大部分國家和地區(qū)陸續(xù)進行了流行病學研究，證明了札如病毒在世界范圍內普遍存在，并提示它已成為腹瀉散發(fā)病例和引起暴發(fā)疫情的重要病原。病毒性腹瀉在世界范圍內的影響不容忽視，嬰幼兒病毒性腹瀉給世界各國帶來沉重的經濟和社會負擔。由于嬰幼兒年齡太小，無法很好的與醫(yī)生和父母進行交流，因此對腹瀉的嬰幼兒患者進行快速的診斷顯得尤為重要。鑒于包括人輪狀病毒、札如病毒、腺病毒、星狀病毒和諾如病毒在公共衛(wèi)生中的重要性與日俱增，所以在腹瀉監(jiān)測工作中同時要進行多種腹瀉病毒的檢測，費時費力而且浪費臨床標本與試劑。病毒培養(yǎng)相對PCR方法比較費時費力且花費較大，且札如病毒和諾如病毒目前世界上還沒有建立成熟的的培養(yǎng)方法。在目前由于輪狀病毒和諾如病毒的檢測方法研究的相對比較多而且比較成熟，而札如病毒、腺病毒、星狀病毒的方法研究比較少，特別是多重熒光定量PCR的方法。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學研究中的廣泛應用，特別是最近幾年興起的熒光定量PCR技術，該方法具有準確性高、重現性好等特點，已廣泛用于基因表達研究、病原體檢測、SNP分析及基因分型等諸多領域。該方法采用完全閉管檢測，省去了對PCR 產物后處理，避免了交叉污染，結果判斷由計算機完成，簡化了操作步驟，并加強了結果的可靠性。隨著熒光定量技術、儀器以及材料科學的發(fā)展，熒光定量技術不僅僅在定量上發(fā)揮它的優(yōu)勢，而且運用TaqMan或TaqMan — MGB探針的5、末端標記上不同的熒光染料(FAM、 HEX等)技術可以進行基因分型、基因突變檢測和SNP分析等方面研究。因此建立關于札如病毒、腺病毒、星狀病毒的多重熒光定量RT-PCR的分子生物學快速、特異、準確、靈敏的基因診斷方法與診斷試劑 盒尤為重要。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包含定量RT-PCR 反應液、札如病毒標準品、星狀病毒標準品、腺病毒標準品、對照品，盒體7設有容器孔，分別放置定量RT-PCR反應液管、札如病毒標準品管、星狀病毒標準品管、腺病毒標準品管、陽性對照品管、陰性對照品管。其中熒光定量RT-PCR反應液管包含RT-PCR反應緩沖液管(含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物等)、三種病毒通用引物管(上下游引物同管裝)、相應的三種熒光探針管和酶混合物管(含RNA酶抑制劑、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶和耐熱DNA聚合酶等)。三重熒光定量RT-PCR檢測用上游引物和下游引物以及相應的特異性熒光探針序列如下
上游引物札如病毒-FP: 5，- CAACTATGACCAGGCTCTCGC-3，
下游引物札如病毒-RP: 5，- GCCCTCCATYTCRAACACTA-3‘
特異性探針札如病毒-P: 5，- FAM - CTTGGTTYATAGGYGGTACA -BHQ1-3'
上游引物星狀病毒-FP: 5，-AATACGGACGCAACAAACGTC-3，
下游引物星狀病毒-RP: 5’ -GTCCTGTGACACCCTGTTTCC-3’
特異性探針星狀病毒-P 5’ -VIC -AGTCTAATCAACGTGTCCGTAACATTGTC-BHQ1-3’
上游引物腺病毒-FP: 5' -CCCTGCTTTATCTTCTTTTCGAAG-3’
下游引物腺病毒-RP: 5，-GAGAACGGTGTGCGCAGG-3，
特異性探針腺病毒-P 5，-ROX -CACCAGCCACACCGCGGC-BHQ1-3，
上述標準品包括札如病毒、星狀病毒和腺病毒基因標準品，其序列如下
札如病毒標準品序列為
CAACTATGAC CAGGCTCTCG CCACCTACGA ATCTTGGTTC ATAGGTGGTA CAGGCCTGGT ACAAGGTAGC CCCAGTGAAG AGACCACCAA ATTAGTGTTT GAAATGGAG GGC 星狀病毒標準品序列為
aatacggacg caacaaacgt cagtctaatc aacgtgtccg taacattgtc aataagcaac tcaggaaaca gggtgtcaca ggac 腺病毒標準品序列為
CCCTGCTTTA TCTTCTTTTC GAAGTCTTCG ACGTGGTCAG AGTGCACCAG CCACACCGCG GCGTCATCGA GGCCGTCTAC CTGCGCACAC CGTTCTC
陰性對照為高溫高壓滅菌的高壓后DEPC (焦碳酸二乙酯)處理水，陽性對照為札如病毒、星狀病毒和腺病毒的陽性質粒樣品。本發(fā)明提供的定量試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復凍融。本發(fā)明的另一個目的是提供所述的三重熒光定量RT-PCR檢測試劑盒在檢測札如病毒、星狀病毒和腸道腺病毒中的應用。本發(fā)明試劑盒的使用方法
每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照。標準品用無菌去離子水稀釋為IXlO2 — IX IO7 拷貝 /ml。
糞便樣品核酸RNA/DNA提取該取0. 2克或200ul糞便樣本加到EP管中，加入 1. 5ml的生理鹽水，震蕩混勻3次，每次10秒，然后靜置10分鐘，以8000轉/分鐘離心5 分鐘，吸取200ul-400ul上清加到EP管中，采用德國QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或 Geneaid公司的Viral Nucleic Acid Extraction Kit II試劑盒，按照試劑盒說明書進行提取，取5ul已抽提的待測樣品核酸RNA/DNA為模板。核酸的檢測取5ul已抽提的待測樣品核酸RNA/DNA為模板，RT-PCR緩沖液為一步法RT-PCR (one stepRT-PCR)緩沖液，其終濃度為1 X，是指緩沖液各組分在反應體系中的終濃度與IXone step RT-PCR緩沖液中各組分的濃度相同。通常采用反應體系1/2體積的2 X one st印RT-PCR緩沖液。IXone step RT-PCR Master Mix緩沖液的組成參見上海輝睿生物科技有限公司的一步法RT-PCR標準混合液(one step RT-PCR Master Mix)，編號(Code) :HR-RT04-100。反應總體積為 50 μ ，其中 2XOne Step RT-PCR Reaction Buffer 25 ul，Enzyme Mix 5 ul，三種引物(20ymol/L)各 1 μ ,三種探針(20 μ mol/L)各 1 μ ，模板 RNA/DNA 2飛μ , DEPC水補足50 μ )在三色(或以上)熒光定量PCR儀上進行檢測，反應參數為反應條件為50°C 30min,95°C 5min進行逆轉錄，然后95°C 10s，55°C 40s，在55°C進行三重熒光檢測，共進行45個循環(huán)。熒光定量結果報告①札如病毒、星狀病毒和腸道腺病毒探針各自CT值 (threshold cycle,每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環(huán)數)均等于 40. 0的標本為陰性，②札如病毒、星狀病毒和腸道腺病毒各探針CT值< 35的標本，檢測結果為該相應病毒的核酸為陽性，則待測樣品含有札如病毒、星狀病毒和腺病毒，如其中一個出現熒光檢測結果呈陽性，則待檢樣本中含有陽性熒光對應的靶病毒。③CT值在35 40 之間為灰值區(qū)域，重做后大于37值為陰性。根據所獲得的標準曲線，計算待測標本各革蘭陰、陽性菌量值(拷貝數/ml)。本發(fā)明的有益之處是運用實時熒光定量RT-PCR技術，采用三種病毒(札如病毒、 星狀病毒和腺病毒)特異引物和特異熒光探針，開發(fā)研制用于札如病毒、星狀病毒和腺病毒三重熒光定量檢測試劑盒。該發(fā)明是通過一個PCR反應，可以從標本中檢測出札如病毒、星狀病毒和腺病毒的存在，比傳統的普通PCR和單重熒光定量PCR方法更簡便、快速和準確， 而且對檢測的病毒進行實時準確定量，對臨床上疑似病毒性感染的患兒提供早期明確診斷，區(qū)分陽性病毒感染及感染的滴度數量水平，以便早期及時制定治療方案，減少死亡率及后遺癥。


圖1是試劑盒結構示意圖。圖2是三個標本混合同時進行三重RT-PCR檢測的實例。圖3為熒光RT-PCR法檢測札如病毒的靈敏度，6至1 (從左到右)依次為10000000、 1000000、100000、10000、1000、lOOcopy。圖4為札如病毒標準品熒光定量RT-PCR標準曲線。圖5為熒光RT-PCR法檢測星狀病毒的靈敏度；5至1(從左到右)依次為1000000、 100000、10000、1000、lOOcopy。
圖6為星狀病毒標準品熒光定量RT-PCR標準曲線。圖7為熒光RT-PCR法檢測腺病毒的靈敏度；5至1 (從左到右)依次為1000000、 100000、10000、1000、IOOcopy。圖8為腺病毒標準品熒光定量RT-PCR標準曲線。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。實施例1
參見圖1，一種三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包含定量RT-PCR反應液、札如病毒標準品、星狀病毒標準品、腺病毒標準品、陽性對照品、陰性對照品，盒體7設有容器孔，分別放置定量RT-PCR反應液管1、札如病毒標準品管2、星狀病毒標準品管3、腺病毒標準品4、陽性對照品管5、陰性對照品管6，其中定量RT-PCR反應液單管分裝，矩陣排列，標準品為札如病毒、星狀病毒和腺病毒基因標準品，其中熒光定量RT-PCR反應液包含RT-PCR反應緩沖液(含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物等)3管(標記為(g))、三種病毒通用引物(上下游引物同管裝)為3管(標記為 )、相應的三種熒光探針為3管(標記為 )、酶混合物(含RNA酶抑制劑、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶和耐熱DNA聚合酶等)為3管(標記為 ◎)。實施例2
1材料與方法病毒株與臨床標本
腸道腺病毒40/41、星狀病毒和札如病毒的陽性核酸(均通過基因測序鑒定)來源于浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院。臨床樣本來源于患者的糞便標本，樣本采集后帶冰運送到實驗室。1. 2 引物與探針
從美國的NCBI基因庫上下載了世界各地的札如病毒、星狀病毒、腺病毒基因序列。對其進行了同源性比較，在對應病毒基因組的保守基因區(qū)設計特異性引物與Taqman探針，序列如下
上游引物札如病毒-FP: 5，- CAACTATGACCAGGCTCTCGC-3，
下游引物札如病毒-RP: 5，- GCCCTCCATYTCRAACACTA-3‘
特異性探針札如病毒-P: 5，- FAM - CTTGGTTYATAGGYGGTACA -BHQ1-3'
上游引物星狀病毒-FP: 5，-AATACGGACGCAACAAACGTC-3，
下游引物星狀病毒-RP: 5’ -GTCCTGTGACACCCTGTTTCC-3’
特異性探針星狀病毒-P 5’ -VIC -AGTCTAATCAACGTGTCCGTAACATTGTC-BHQ1-3’
上游引物腺病毒-FP: 5' -CCCTGCTTTATCTTCTTTTCGAAG-3’
下游引物腺病毒-RP: 5，-GAGAACGGTGTGCGCAGG-3，
特異性探針腺病毒-P 5，-ROX -CACCAGCCACACCGCGGC-BHQ1-3，
引物和探針委托上海輝睿生物科技有 限公司合成。1. 3病毒定量標準與病毒RNA的提取病毒RNA的提取采用德國QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按試劑盒說明書提取，得到病毒 RNA (102ng/μ L)，并根據 TranscriptAidTM Τ7 High Yield Transcription Kit 的操作說明書將RNA進行逆轉錄，利用NanoDrop ND-IOOO Spectrophotometer在260nm測量逆轉錄產物的濃度，從而確定RNA的拷貝數以備用。1. 4熒光RT-PCR反應體系和條件的優(yōu)化
試劑盒選用上海輝睿生物科技有限公司的one step RT-PCR Master Mix, Code HR-RT04-100，按說明書操作，反應總體積為50 μ 其中2X0ne Step RT-PCR Reaction Buffer 25 ul，Enzyme Mix 5 ul，三種引物(20 μ mol/L)各 1 μ ，三種探針(20 μ mol/L)各 1 μ ,模板 RNA/DNA 2 5 μ ，DEPC 水補足 50 μ 。)反應條件為 50°C 30min,95°C 5min 進行逆轉錄，然后95°C 10s,55°C 40s，在55°C進行三重熒光檢測，共進行45個循環(huán)，結果判斷選擇熒光檢測模式FAM、VIC、R0X，熒光基線調整取3-15個循環(huán)的熒光信號平均值，閾值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照品的最高點，樣本呈典型的擴增曲線，判斷為陽性。無典型的擴增曲線，判斷為陰性。體系的優(yōu)化試驗，在以相同濃度陽性核酸為模板的反應體系中，引物濃度從0. 10 1. 00 μ Μ,探針濃度從0. 10 0. 50 μ Μ,采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，根據最低Ct值和最高熒光強度增加值(ARn)選擇最佳引物和探針濃度。1.5熒光RT-PCR特異性、敏感性和重復性試驗
選擇腸道腺病毒、星狀病毒和札如病毒的陽性核酸(均通過基因測序鑒定)和近期來源于源于近期浙江省腹瀉患者的臨床糞便標本，對上述臨床樣本提取核酸，用腸道腺病毒、 星狀病毒和札如病毒多重熒光RT-PCR方法進行檢測，驗證方法的特異性；對已標定拷貝數 (Copies/ml)的腸道腺病毒(2X 108Copies/ml)、星狀病毒(2X 108Copies/ml)和札如病毒 (2X108Copies/ml)分別稀釋后，平行進行熒光RT-PCR與RT-PCR反應，比較其靈敏度。此夕卜，對每一個濃度的病毒稀釋液作5次重復檢測，得到的Ct值計算標準差，驗證方法的重復性。2 結果
2. 1熒光RT-PCR反應體系及條件
選用上海輝睿生物科技有限公司的one step RT-PCR Master Mix, Code HR-RT04-100，按說明書操作，反應總體積為50 μ ，其中2X0ne Step RT-PCR Reaction Buffer 25 ul,Enzyme Mix 5 ul，三種引物(20 μ mol/L)各 1 μ 三種探針(20 μ mol/L)各 1 |ll，模板RNA/DNA 2 5 μ ，DEPC水補足50 μ ) 用Rotor_Gene6000熒光檢測系統進行檢測，反應參數為反應條件為50°C 30min,93C 5min進行逆轉錄，然后95°C 10s,55°C 40s，在55°C進行三重熒光檢測，共進行45個循環(huán)，可獲得最低Ct值和最高熒光強度。2. 2特異性試驗
本發(fā)明建立的多重熒光RT-PCR方法對腸道腺病毒、星狀病毒和札如病毒具有較好的特異性，近期采集的甲腹瀉患者的糞便標本也檢測出陽性反應。而與其他腸道病毒如輪狀病毒、諾如病毒(I型和II型)、腸道病毒EV71和CoxAie病毒等均無交叉反應，結果參見圖 2，圖中A為札如病毒樣品、B為腺病毒樣品、C為星狀病毒樣品。2.3敏感性試驗
對腸道腺病毒、星狀病毒和札如病毒，對已標定拷貝數(Copies/ml)的腸道腺病毒 (2 X 108Copies/ml )、星狀病毒(2 X 107Copies/ml)和札如病毒(4 X 107Copies/ml)分別稀釋100000、10000、1000、100、10倍后，用熒光RT-PCR方法進行檢測，結果熒光RT-PCR方法檢測敏感性，腸道腺病毒為2X10 Copies/ml，結果參見圖3，其標準曲線參見圖4 ；星狀病毒為 2X10 Copies/ml，結果參見圖5，其標準曲線參見圖6 ；札如病毒為4X10 Copies/ml，結果參見圖7，其標準曲線參見圖8。2. 4重復性試驗
分別取終濃度為腸道腺病毒(2 X 107Copies/ml )、星狀病毒(2 X 107Copies/ml)和札如病毒(2X107CopieS/ml)為混合后按10倍梯度稀釋成3個不同的濃度，對每一個濃度的樣本作5個重復檢測，結果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標準差在0. 10 0. 31之間，具有較好的重復性(表1)。
權利要求
1.一種三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含定量 RT-PCR反應液、札如病毒標準品、星狀病毒標準品、腺病毒標準品、陽性對照品、陰性對照品，盒體(7)設有容器孔，分別放置熒光定量RT-PCR反應液管(1)、札如病毒標準品管(2)、 星狀病毒標準品管(3)、腺病毒標準品(4)、陽性對照品管(5)、陰性對照品管(6)，其中熒光定量RT-PCR反應液管包含RT-PCR反應緩沖液管、上下游引物同管裝的三種病毒通用引物管、相應的三種熒光探針管和含RNA酶抑制劑、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶和耐熱DNA 聚合酶的酶混合物管，RT-PCR反應緩沖液管內含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物，三重熒光定量RT-PCR檢測用上游引物和下游引物以及相應的特異性熒光探針序列如下上游引物札如病毒-FP: 5，- CAACTATGACCAGGCTCTCGC-3，下游引物札如病毒-RP: 5，- GCCCTCCATYTCRAACACTA-3‘特異性探針札如病毒-P: 5，- FAM - CTTGGTTYATAGGYGGTACA -BHQ1-3'上游引物星狀病毒-FP: 5，-AATACGGACGCAACAAACGTC-3，下游引物星狀病毒-RP: 5’ -GTCCTGTGACACCCTGTTTCC-3’特異性探針星狀病毒-P 5’ -VIC -AGTCTAATCAACGTGTCCGTAACATTGTC-BHQ1-3’上游引物腺病毒-FP: 5' -CCCTGCTTTATCTTCTTTTCGAAG-3’下游引物腺病毒-RP: 5，-GAGAACGGTGTGCGCAGG-3，特異性探針腺病毒-P 5，-ROX -CACCAGCCACACCGCGGC-BHQ1-3，所述的札如病毒、星狀病毒和腺病毒基因標準品序列如下札如病毒標準品序列為CAACTATGAC CAGGCTCTCG CCACCTACGA ATCTTGGTTC ATAGGTGGTA CAGGCCTGGT ACAAGGTAGC CCCAGTGAAG AGACCACCAA ATTAGTGTTT GAAATGGAG GGC 星狀病毒標準品序列為aatacggacg caacaaacgt cagtctaatc aacgtgtccg taacattgtc aataagcaac tcaggaaaca gggtgtcaca ggac 腺病毒標準品序列為CCCTGCTTTA TCTTCTTTTC GAAGTCTTCG ACGTGGTCAG AGTGCACCAG CCACACCGCG GCGTCATCGA GGCCGTCTAC CTGCGCACAC CGTTCTC。
2.根據權利要求1所述的一種三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為高溫高壓滅菌的高壓后焦碳酸二乙酯處理水，陽性對照為札如病毒、星狀病毒和腺病毒的陽性質粒。
3.根據權利要求1所述的一種三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒保存于_20°C。
4.根據權利要求1所述的一種三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒在檢測札如病毒、 星狀病毒和腸道腺病毒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包含定量RT-PCR反應液、標準品、對照品，盒體設有容器孔，分別放置定量RT-PCR反應液管、札如病毒標準品管、星狀病毒標準品管、腺病毒標準品管、陽性對照品管、陰性對照品管，其中定量RT-PCR反應液單管分裝，矩陣排列，標準品為札如病毒、星狀病毒和腺病毒基因標準品，對照品為陽性和陰性對照品。本發(fā)明試劑盒運用實時熒光定量RT-PCR技術，采用三種病毒特異引物和特異熒光探針，設計合理，通過一個PCR反應，可以從標本中檢測出札如病毒、星狀病毒和腺病毒，檢測方法更簡便、快速和準確。
文檔編號C12Q1/70GK102206713SQ201110085320
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月6日 優(yōu)先權日2011年4月6日
發(fā)明者崔大偉, 李蘭娟, 陳瑜 申請人:浙江大學