專利名稱：以粘蛋白1和生存素為靶點的腫瘤基因工程疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤DNA疫苗、病毒載體疫苗及蛋白疫苗領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及重組DNA載體CpVR-MS和CpDV-IL2-MS ;重組蛋白疫苗S8和9M以及DNA疫苗、病毒載體疫苗、蛋白疫苗以及這三種形式疫苗之間免疫方式的優(yōu)化組合在制備抗腫瘤疫苗中的用途。
背景技術(shù)：
生存素(survivin)是抑制凋亡蛋白(IAP)家族成員，具有抗凋亡和調(diào)控細(xì)胞分裂的雙重功能，廣泛表達(dá)于各種胚胎組織和癌細(xì)胞中，但在正常終末分化細(xì)胞中不表達(dá)。這些特點使生存素成為腫瘤發(fā)生，發(fā)展和治療等領(lǐng)域中的一個新靶點。目前的研究表明生存素在腫瘤基因治療中具有潛在價值它的腫瘤特異性表達(dá)，及其與預(yù)后不良、藥物抗性和病人生存期縮短等呈正相關(guān)。針對生存素及其突變體等進(jìn)行 的腫瘤免疫治療已成為人們關(guān)注的熱點。目前國內(nèi)外策略有(參見Li，F(xiàn)，et al.，2006 ；Li，F(xiàn). ,2003 ；Altieri, D. C.，2008) :(1)利用生存素啟動子的腫瘤特異性表達(dá)進(jìn)行的腫瘤靶向基因治療；(2)針對生存素本身的治療策略a)生存素的反義或全長的cDNA或反義核苷酸表達(dá)載體策略，比較適合生存素的功能研究和前臨床研究，但用全長的生存素可能有潛在的危險；b)生存素功能陰性突變體(dominant negative mutant, DNM)策略,主要是SurvT34A和SurvC84A，但此方案可能不適用于直接的癌癥治療；c)生存素核酶方案，即用生存素mRNA特異性核酶剪切生存素mRNA以降低生存素的表達(dá)，此方案也是一種有效的研究工具，但不適用于癌癥臨床治療；d)生存素RNAi技術(shù)，目前的研究表明RNAi能有效的使哺乳動物基因表達(dá)沉默，可用于基因功能研究，但昂貴的費用限制其臨床應(yīng)用；e)用小分子有機物或小肽抑制生存素的表達(dá)或干擾其功能；f)用生存素特異性表位的免疫治療，這是一個很吸引人的領(lǐng)域，但只用生存素的小肽，免疫原性可能不高。因為生存素具有抗凋亡的功能，如果用其全長來設(shè)計疫苗可能存在安全隱患，根據(jù)國內(nèi)外策略的優(yōu)點和弊端擬采用生存素抗凋亡功能缺失剪切體來設(shè)計疫苗，在保證其抗凋亡功能缺失的情況下盡量保存長度以提高免疫原性。因此本發(fā)明采用生存素的抗凋亡功能缺失剪切體來設(shè)計疫苗。生存素在體內(nèi)是以二聚體形式起作用的，它N-端第6、第7和第10位的三個氨基酸是形成二聚體的關(guān)鍵氨基酸(參見Shi，Y. et al. ,2000);生存素的第5位至第14位氨基酸是HLA-A2的特異性抗原表位(參見Andersen, M. H. et al.，2001)，基于這兩點本發(fā)明首次設(shè)計了剪切體S8(即切去生存素N-端7個氨基酸)，希望可以破環(huán)它的二聚體結(jié)構(gòu)，從而使其缺失抗凋亡的功能。因此以S8為靶點來設(shè)計疫苗可能會提高疫苗的安全性。粘蛋白I(MUCl)是粘蛋白家族成員，是跨膜糖蛋白，存在于正常腺管上皮細(xì)胞及其來源的腫瘤細(xì)胞表面，由多肽核心和側(cè)枝糖鏈構(gòu)成。其核心肽胞外段含有數(shù)目不等的串聯(lián)重復(fù)區(qū)(VNTR)。正常組織中MUCl分布于腺管上皮細(xì)胞分泌極，與免疫細(xì)胞相對隔離，糖基化豐富；而在腫瘤組織，其廣泛分布并異常豐富地表達(dá)于細(xì)胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情況下隱蔽的表位，成為免疫細(xì)胞攻擊的靶點，并且表達(dá)增強，可達(dá)正常細(xì)胞的100倍以上，因此MUCl是較理想的抗腫瘤靶分子。MUC1VNTR中的PDTRP序列是B細(xì)胞及T細(xì)胞共同識別的表位，可與MUCl特異性抗體及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)相結(jié)合，故稱這個最具免疫原性的部位為免疫顯性結(jié)構(gòu)域，因此，目前大部分利用MUCl研究免疫治療的都是集中在VNTR區(qū)域(參見Singh，R. et al.，2007 ；Persson, J. et al. , 2006 ；Xing, P. X. et al. , 1992 ；Tang, C. K. et al. , 2008 ；Tang,C. K. et al. ,2008)。從發(fā)現(xiàn)MUCl到現(xiàn)在已用其進(jìn)行了很多的疫苗研究工作，并有一些疫苗已經(jīng)進(jìn)入人類臨床研究階段，但大多數(shù)都是傳統(tǒng)的多肽類、蛋白類或樹突狀細(xì)胞(DC)類疫苗，這些疫苗大多都存在免疫原性差或制備困難等問題；進(jìn)入臨床的基因疫苗主要是重組痘病毒疫苗，雖然沒有檢測到毒性，但直接用重組痘病毒疫苗初免-加強還是存在較大的安全隱患，而且產(chǎn)生的臨床效果也不是很理想；DNA載體疫苗由于免疫原性較弱目前還基本處于臨床前研究階段。本發(fā)明發(fā)明人的前期研究表明增加VNTR的數(shù)目可在一定程度上增強MUCl的免疫效果(參見Zhang S et al.，2008)，如33個拷貝的MUC1VNTR串聯(lián)重復(fù)序列引起的免疫應(yīng) 答明顯強于2個拷貝的MUCl VNTR串聯(lián)重復(fù)序列引起的免疫應(yīng)答，因此本發(fā)明選用含有33個的串聯(lián)重復(fù)序列MUCl VNTR作為抗原來設(shè)計疫苗，并將其與S8融合表達(dá)來構(gòu)建融合表達(dá)疫苗以增強疫苗免疫的廣譜性和有效性，目前將生存素和MUC1VNTR聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行腫瘤治療還未見報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先以S8為靶點進(jìn)行腫瘤基因疫苗的研究，分別構(gòu)建DNA載體疫苗(VR-S8)和腺病毒載體疫苗(Ad-S8)，采用DNA初免-重組腺病毒加強免疫(DNA prime-rAdboost)免疫策略，同時采用表達(dá)白細(xì)胞介素2 (IL2)的質(zhì)粒(VR-IL2)作為免疫佐劑，通過免疫小鼠檢測S8基因疫苗的免疫原性及抗腫瘤活性，結(jié)果表明小鼠可產(chǎn)生針對S8的特異性抗體(見圖4)和CTL(見圖5);該疫苗具有一定的抗腫瘤活性，在預(yù)防性實驗中，與PBS組比較，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫組模型小鼠腫瘤生長抑制率為68. 54%，生存期延長了 35. 6% (見圖6)。在治療性實驗中，與PBS組比較，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫組模型中小鼠腫瘤生長受到了明顯的抑制(抑制率為23. 42%)，但并沒有明顯延長模型小鼠的生存期(見圖7)。本發(fā)明采用生存素和MUCl為靶點設(shè)計融合表達(dá)基因疫苗。由于MUCl基因的多態(tài)性決定了不同個體間VNTR數(shù)目的不同，最常見的為含有30-90個連續(xù)重復(fù)序列，根據(jù)自行構(gòu)建MUCl VNTR基因的特點選擇以33個重復(fù)區(qū)序列(簡稱為33M，該序列含有33個VNTR的串聯(lián)重復(fù)序列，每個重復(fù)序列之間有6個由于構(gòu)建引入的酶切位點的堿基序列，)來構(gòu)建MUC1DNA載體疫苗(VR-33M)，同時構(gòu)建33M與S8融合表達(dá)的DNA載體疫苗(VR-MS)。通過免疫模型小鼠檢測融合表達(dá)基因疫苗的免疫效果和抗腫瘤活性與二者單獨表達(dá)的疫苗相比是否有明顯的提高，結(jié)果表明生存素和MUCl融合表達(dá)基因疫苗的免疫效果明顯強于二者單獨表達(dá)的疫苗的免疫效果，例如在對腫瘤的預(yù)防性研究中，融合表達(dá)疫苗免疫組與生存素疫苗單獨免疫組相比抑瘤率提高了 134%，生存期延長了 166%;與MUCl單獨免疫組比較，抑瘤率提高了 25%，生存期延長了 73% (見圖12)。為了進(jìn)一步加強MS疫苗的免疫效果又構(gòu)建了其病毒載體疫苗(Ad-MS和MVA-MS)，采用DNA初免-重組腺病毒加強免疫的免疫策略，同時采用表達(dá)IL2的質(zhì)粒作為免疫佐劑，通過免疫模型小鼠檢測融合表達(dá)基因疫苗的免疫效果和抗腫瘤活性，結(jié)果表明DNA初免-重組腺病毒加強的免疫策略能明顯抑制模型小鼠腫瘤的生長，并有效延長小鼠的生存期；IL2也顯示出了明顯的佐劑增強作用(見圖 13)。本發(fā)明采用CpG motif作為免疫佐劑進(jìn)一步構(gòu)建DNA載體疫苗。根據(jù)文獻(xiàn)報道，選用能同時增強細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)的C型CpGmotif作為免疫佐劑，選取的核心序列為“TCgTCgTCgTTCgAACgACgTTgAT”，根據(jù)文獻(xiàn)報道擬構(gòu)建含有16個核心序列的重復(fù)序列，然后將其克隆到VR-MS質(zhì)粒骨架的非編碼區(qū)，獲得CpVR-MS疫苗，考察加入CpG是否能提高疫苗的免疫效果及安全性。為了提高腫瘤基因疫苗的安全性、降低制備成本，構(gòu)建含有CpG motif的MS和IL-2共表達(dá)的雙順反子載體疫苗CpDV-IL-2-MS，并與CpVR-MS/VR-IL-2 (參見吉林大學(xué)2008屆碩士畢業(yè)生楊萍的碩士學(xué)位論文《HBV DNA疫苗和重組痘病毒聯(lián)合疫苗的免疫原性研究》中關(guān)于pVR1012-hIL-2的相關(guān)記載)共免疫形式對比，考察加入CpG的雙順反子載體疫苗的免疫效果，結(jié)果表明CpDV-IL-2-MS的免疫效果略高于CpVR-MS/VR-IL-2的免疫效果(見圖16)。
本發(fā)明除了構(gòu)建了 DNA載體疫苗和病毒載體疫苗外，還制備了重組蛋白疫苗(S8和9M)并對其免疫效果進(jìn)行了評價。結(jié)果表明采用S8/9M聯(lián)合免疫佐劑DDA+MPL進(jìn)行初免，采用重組腺病毒疫苗AD-MS進(jìn)行加強免疫，可以產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)(見圖19)，同時具有很好的抑制模型小鼠腫瘤生長的作用(見圖20)。具體而言，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒CpVR-MS，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為VR-MS，在所述VR-MS的非編碼區(qū)插入CpG motif序列，在一個優(yōu)選的實施方案中，非編碼區(qū)中的插入位點為Stul位點。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種雙順反子表達(dá)載體DV，其特征在于所述表達(dá)載體的骨架載體為VR1012，在所述VR1012多克隆酶切位點插入了 BGH、CMV-intronA序列，使其在VR1012本身的第一表達(dá)框架之外，含有一個第二表達(dá)框架。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述表達(dá)框架中的第一表達(dá)框架的多克隆位點包括Pstl、Sail、notl、XbaU池61、8&!11111，第二表達(dá)框架的多克隆酶切位點包括8812、4 &13(301 1。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種帶有CpG motif的雙順反子表達(dá)載體CpDV，其特征在于所述表達(dá)載體的骨架載體上文所述述的DV，在所述DV的非編碼區(qū)插入CpG motif序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，非編碼區(qū)中的插入位點為Stul位點。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒CpDV-IL2_MS，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為上文所述的CpDV，在所述CpDV的第一表達(dá)框的多克隆位點插入IL-2序列，在所述CpDV的第二表達(dá)框的多克隆位點插入MS序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述第一表達(dá)框的多克隆位點為BamHl，第二個表達(dá)框的多克隆位點為Bgl2。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒pRSET B-9M，其特征在于在pRSET B原核表達(dá)載體的多克隆位點中插入一個含有9個拷貝的MUCl VNTR的序列9M。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述多克隆位點為BamH I/EcoR I。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒pRSET B-S8，其特征在于在pRSET B原核表達(dá)載體的多克隆位點中插入一個SEQ IDNO :8所述的序列S8。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述多克隆位點為BamH I/EcoR I。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，包括上文所述的重組質(zhì)粒CpVR-MS。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物還包括免疫佐劑。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述免疫佐劑選自細(xì)胞因子白介素2(IL-2)、細(xì)胞因子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，包括包括上文所述的重組質(zhì)粒CpDV-IL2-MS。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物，還包括免疫佐劑。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述免疫佐劑選自細(xì)胞因子白介素2(IL-2)、細(xì)胞因子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，包括S8蛋白和/或9M蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物還包括免疫佐劑。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述的免疫佐劑選自DDA、MPL、AD11SM。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了所述重組質(zhì)粒CpVR-MS、所述重組質(zhì)粒CpDV-IL2-MS或者S8蛋白和/或9M蛋白在制備用于治療腫瘤的疫苗中的用途。在一個優(yōu) 選的實施方案中，所述疫苗中還包含化療藥物。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述疫苗中還包含化療藥物。在一個甚至更有選的實施方案中，所述化療藥物選自卡鉬、順鉬、奧沙利波和紫杉醇。


圖I. DNA載體及重組DNA載體疫苗圖譜。A為VR1012載體圖譜；B為重組質(zhì)粒VR-S8圖譜；C為重組質(zhì)粒VR-33M圖譜；D為重組質(zhì)粒VR-MS圖譜；E為重組質(zhì)粒CpVR-MS圖譜；F為重組質(zhì)粒CpDV-IL2-MS圖譜；G為PRSET B載體圖譜；H為重組質(zhì)粒PRSET B-9M圖譜為重組質(zhì)粒PRSET B-S8圖譜。圖2.重組腺病毒載體圖譜及制備流程。A為AdMax 腺病毒載體及重組病毒制備流程；B為穿梭載體PDC316圖譜；C為重組穿梭載體PDC316-S8圖譜；D為重組穿梭載體PDC316-MS 圖譜。圖3. MVA重組原理及相關(guān)載體圖譜。A為MVA重組示意圖；B為穿梭載體pSCll圖譜；C為重組穿梭載體pSCll-MS圖譜，MS結(jié)構(gòu)基因表達(dá)框架重組到MVA的TK基因中，基因表達(dá)的啟動子采用P7. 5。圖4.小鼠免疫血清抗S8抗體的檢測。C57/BL小鼠經(jīng)PBS (2)、VR-IL2 (3)、VR-S8 (4)，VR-S8/VR-IL2 (5)，VR-S8/VR-IL2/Ad_S8 (6)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以表達(dá)S8的C0S-7細(xì)胞裂解上清作為檢測小鼠血清的抗原，以S8單克隆抗體作為陽性對照(I)，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(Western-blot)檢測的結(jié)果。圖5.以不同形式S8基因疫苗免疫后，小鼠脾淋巴細(xì)胞的特異性CTL殺傷活性檢測。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用特異性抗原肽(H-2d限制性)標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞株B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋放法檢測免疫鼠的CTL應(yīng)答。圖6.不同形式S8基因疫苗對MS/B16 (參見吉林大學(xué)2009屆博士畢業(yè)生張海紅的博士學(xué)位論文《以Survivin和MUCl VNTR為靶點的腫瘤基因疫苗研究》中關(guān)于MS+B16的相關(guān)記載)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的免疫預(yù)防作用。C57BL/6小鼠經(jīng)PBS對照組、VR-IL2、VR-S8、VR-S8/VR-IL2以及VR-S8/VR-IL2/Ad-S8在經(jīng)隔周免疫四次后一周，接種MSf+B16腫瘤細(xì)胞，測量腫瘤大小(A)至26天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天(B)。圖7.不同形式S8基因疫苗對MS/B16腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的免疫治療作用。在給C57BL/6小鼠皮下接種MSf+B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS對照組、卡鉬(Carboplatin)、VR-S8/VR-IL2/Ad-S8和VR-S8/VR-IL2/Ad_S8/卡鉬疫苗，測量腫瘤大小(A)至27天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天(B)。圖8.小鼠免疫血清抗S8、33M及MS抗體的檢測。C57/BL小鼠經(jīng)PBS⑴、VR_S8⑵、VR-33M(3) ,VR-MS (4)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以表達(dá)MS的C0S-7細(xì)胞裂解物作為抗原，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測的結(jié)果。圖9. MS疫苗與單獨表達(dá)生存素和MUCl的疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性CTL殺傷活性的比較。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用生存素(A)和MUCl (B)特異性抗原肽(H-2d限制性)標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋放法檢測免疫鼠的CTL應(yīng)答。 圖10.小鼠免疫血清抗MS抗體的檢測。C57/BL小鼠經(jīng)PBS (I)、VR-IL2 (2)、VR-MS (3)、VR-MS/VR-IL2 (4)、VR-MS/VR-IL2/Ad-MS (5)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以表達(dá)MS的C0S-7細(xì)胞裂解物作為抗原，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測的結(jié)果。圖11.基于MS基因疫苗不同形式免疫后，小鼠脾淋巴細(xì)胞的特異性CTL殺傷活性檢測。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用生存素(A)和MUCl (B)特異性抗原肽(H-2d限制性)標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋放法檢測免疫鼠的CTL應(yīng)答。圖12. MS疫苗與單獨表達(dá)生存素和MUCl的疫苗對模型小鼠免疫預(yù)防效果比較。C57BL/6小鼠經(jīng)PBS對照組、VR-S8、VR-33M以及VR-MS在經(jīng)隔周免疫三次后一周，接種MSf+B16腫瘤細(xì)胞，測量腫瘤大小(A)至26天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天(B)。圖13.不同形式MS基因疫苗對MS/B16腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的免疫治療作用。在給C57BL/6小鼠皮下接種MSf+B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS對照組、卡鉬、VR-MS/VR-IL2/Ad-MS, VR-MS/VR-IL2/MVA-MS 以及 VR-MS/VR-IL2/Ad_MS/ 卡鉬組，測量腫瘤大小(A)至 27天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天(B)。圖14.小鼠免疫血清抗MS抗體的檢測，評價免疫佐劑CpG motif對疫苗體液免疫反應(yīng)的增強作用。C57/BL 小鼠經(jīng) PBS (I)，VR-MS/VR-IL-2/AD-MS (2)，CpVR-MS/VR-IL-2/Ad5-MS(3)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以表達(dá)MS的C0S-7細(xì)胞裂解物作為抗原，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測的結(jié)果。圖15.免疫佐劑CpG motif增強了疫苗免疫小鼠⑶8+T淋巴細(xì)胞分泌IFN- y的能力。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞，并用生存素蛋白、MUCl蛋白和MUC1VNTR20肽刺激淋巴細(xì)胞，采用Elispot法檢測免疫鼠產(chǎn)生IFN- y的量。圖16.1^與112共表達(dá)載體疫苗與二者聯(lián)合免疫疫苗免疫效果比較。在給0578176小鼠皮下接種MS/B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS、CpDV-IL2-MS和CpVR-MS/VR-IL-2，測量腫瘤大小(A)至26天，處死小鼠后測量瘤重(B)。圖17.蛋白疫苗表達(dá)純化及鑒定圖譜。A為pRset B-9M和pRsetB_S8純化后的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。I為pRset B-9M純化前的全菌蛋白染色結(jié)果，2為pRset B-9M純化后的染色結(jié)果。3為pRset B-S8純化后的染色結(jié)果，4為pRset B-S8純化前的全菌蛋白染色、結(jié)果。B為pRsetB_9M蛋白純化后的Western blot結(jié)果，I為陰性對照。C為pRset B-S8蛋白純化后的Western blot結(jié)果，I為陰性對照。圖18.以蛋白疫苗S8為例探討免疫佐劑(DDA+MPL)的免疫增強作用及蛋白疫苗初免-病毒疫苗加強的免疫策略。A為體液免疫，以小鼠血清作為一抗，采用雙抗原夾心法檢測各實驗組小鼠血清中生存素抗體B為細(xì)胞免疫，以生存素蛋白，MUCl蛋白分別刺激各實驗組淋巴細(xì)胞，采用Elispot法檢測免疫鼠產(chǎn)生IFN-Y的量。圖19.為增加蛋白疫苗的廣譜性，將S8和9M聯(lián)合使用并對其免疫原性進(jìn)行考察。Balb/c小鼠經(jīng)PBS，佐劑，9M+S8，9M+S8+佐劑分別免疫后，采集最后一次免疫10天后小鼠的血清及脾淋巴細(xì)胞對該疫苗的體液及細(xì)胞免疫進(jìn)行檢測。A為體液免疫,即以小鼠血清作為一抗，采用雙抗原夾心法檢測小鼠血清中生存素和MUCl抗體，其中Al為生存素抗體A2為Mucl抗體。B為細(xì)胞免疫，即從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞，采用Elispot法檢測免疫鼠產(chǎn)生IFN-Y的量。BI刺激物為生存素蛋白，B2刺激物為Mucl蛋白。
圖20. S8與9M蛋白疫苗聯(lián)合佐劑使用及與卡鉬聯(lián)用之后對MSf+B16腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的免疫治療作用比較。在給C57BL/6小鼠皮下接種MS/B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS、CpDV-IL2-MS和CpVR-MS/VR-IL-2，測量腫瘤大小(A)至26天，處死小鼠后測量瘤重(B)。
具體實施例方式一 .上述片段33M、S8和CpG motif的制備方法和條件I. 33M 的制備MUC1VNTR 為一個含有 60 個堿基的重復(fù)片段，GenBank 號為 NM_002456 (SEQ ID NO:
I)。根據(jù)一個VNTR的堿基序列設(shè)計了兩對引物，采用重疊延伸PCR技術(shù)(SOE PCR)合成I個VNTR(Im)重復(fù)區(qū)片段，然后利用限制性內(nèi)切酶SalI和XhoI酶切產(chǎn)生相同粘性末端的特性，依次進(jìn)行連接，構(gòu)建33M基因片段。具體方法如下I)重疊延伸PCR技術(shù)PCR 反應(yīng)條件為95°C 20s,55°C 20s、72°C 30s，進(jìn)行 30 個循環(huán)，利用引物 Pl (SEQID N0:2)和P2(SEQ ID NO :3)擴(kuò)增出無ATG 的 I 拷貝MUCl VNTR(簡寫為m)，以P2和P3 (SEQID NO 4)為引物擴(kuò)增出含ATG的I拷貝MUCl VNTR(簡寫為Am)片段。2)pGEM-T-33M的構(gòu)建、酶切鑒定及序列分析將上述PCR產(chǎn)物m和Am分別和pGEM-T-easy (Promega公司)載體進(jìn)行連接，分別獲得含有所述m和Am片段的pGEM-T-m和pGEM-T_Am兩個質(zhì)粒，然后利用限制性內(nèi)切酶SalI和XhoI酶切產(chǎn)生相同粘性末端的特性，依次進(jìn)行連接獲得含有所述33M片段的PGEM-T-33M質(zhì)粒，經(jīng)SalI和XhoI酶切鑒定后進(jìn)行序列分析，測序結(jié)果正確。具體過程即先將pGEM-T-m用SalI和XhoI雙酶切得目的片斷m，然后再將其插入pGEM-T_m的XhoI位點，即得到pGEM-T-2m。然后再將pGEM-T_2m用SalI和XhoI雙酶切得目的片斷2m，然后再將其插入pGEM-T-2m的XhoI位點，即得到pGEM-T_4m，同理得pGEM-T_32m，然后再將pGEM-T_Am用SalI和XhoI雙酶切得目的片斷Am，然后再將其插入pGEM-T_32m的SalI位點，即得到了質(zhì)粒 pGEM-T-33m。2. S8 的制備生存素，GenBank號為NM_001168，根據(jù)生存素的序列設(shè)計了兩對引物，采用RT-PCR技術(shù)從293細(xì)胞的總RNA中擴(kuò)增出了 S8的基因片段，序列為SEQ ID NO 8所示的堿基序列。具體方法如下I) RT-PCR 技術(shù)采用TRIzol RNA提取試劑盒(Gibco公司)提取293細(xì)胞的總RNA，采用Super-Script反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Gibco公司)從中獲得293細(xì)胞的cDNA，然后以其為模板，以P4(SEQ ID N0:5)和P5(SEQ ID NO :6)為引物進(jìn)行PCR(反應(yīng)條件為:95°C 30s、55°C 30s、72°C lmin，進(jìn)行30個循環(huán))擴(kuò)增生存素cDNA。2)pGEM-T-S8的構(gòu)建、酶切鑒定及序列分析將生存素cDNA的PCR產(chǎn)物與pGEM-T-easy載體進(jìn)行連接得到含有生存素cDNA的pGEM-T-Surv質(zhì)粒。經(jīng)序列分析證實正確后，以pGEM_T_Surv為模板，以P6 (SEQ ID NO 7)和P5為引物通過PCR擴(kuò)增S8片段(SEQ ID NO :8)，正向引物P6引入EcoRI、XbaI和SalI的酶切位點，反向引物P5引入了 BamHI的酶切位點。將S8 PCR產(chǎn)物連入pGEM-T-easy載 體獲得含有所述S8片段的pGEM-T-S8質(zhì)粒，經(jīng)SalI和BamHI酶切鑒定后進(jìn)行序列分析，測序結(jié)果正確。3. CpG motif 的制備I)本發(fā)明委托上海生物工程公司合成了一段CpG序列，序列的主要部分是4個串聯(lián)重復(fù)的 C 型 CpG 代表序列 TCGTCGTCGITCGAACGACGITGAT (SEQ ID NO :10)，序列的 5’ 端引入Stu I和Sal I兩個酶切位點，3’端引入Stu I和Xho I兩個酶切位點。然后利用XhoI和Sal I具有相同粘性末端的性質(zhì)，依次進(jìn)行兩次酶切連接獲得含有16個C型CpG的序列。二.重組疫苗的獲得方法及相應(yīng)的條件I. DNA載體疫苗1)VR-33M 的構(gòu)建VR1012載體(VR1012是Vieal公司開發(fā)的經(jīng)美國FDA正式批準(zhǔn)的可以用于人體基因疫苗臨床試驗的載體，已經(jīng)完成的臨床試驗表明其在人體的應(yīng)用是安全的，該載體的構(gòu)建過程參見文獻(xiàn)(Human Gene Therapy 1996，7 :1205-1217))含有CMV啟動子，卡那霉素抗性基因，內(nèi)含子A和BGH PolyA翻譯終止信號等常規(guī)部件組成，共4913bp，圖譜見圖1A。將上述制得的pGEM-T-33M質(zhì)粒經(jīng)Sall/Xhol雙酶切后用膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收33M基因片段，將真核表達(dá)載體VR1012載體經(jīng)SalI單酶切后用膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收載體片段，利用經(jīng)SalI和XhoI酶切后具有相同粘性末端這一性質(zhì)將所回收的目的基因片段和載體片段，以T4DNA連接酶，在16°C下連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO (invitrogen公司)，涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，l，2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，用Sall/BamHI進(jìn)行雙酶切和測序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-33M，圖譜見圖1C。2)VR_S8 的構(gòu)建將pGEM-T-S8和真核表達(dá)載體VR1012載體分別經(jīng)Sall/BamHI雙酶切，用膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收目的基因片段S8和VR1012載體片段，用T4DNA連接酶，16°C連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO (invitrogen公司)，涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，I, 2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，用Sall/BamHI進(jìn)行雙酶切和測序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-33M，圖譜見圖IB03) VR-MS 的構(gòu)建將pGEM-T-33M經(jīng)Sall/Xhol雙 切后回收目的基因片段33M，將VR-S8載體經(jīng)SalI單酶切后回收載體片段，利用經(jīng)SalI和XhoI酶切后具有相同粘性末端這一性質(zhì)將回收目的基因片段和載體片段用T4DNA連接酶，16度連接3h。獲得VR-33M-S8，簡稱VR-MS質(zhì)粒，用Sall/BamHI進(jìn)行雙酶切和測序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-MS，圖譜見圖ID0MS序列為如SEQ ID NO 9所示的堿基序列。4) CpVR-MS 的構(gòu)建將上述獲得的含有串聯(lián)重復(fù)的CpG的序列采用Stu I進(jìn)行單酶雙切，獲得外源片段CpG(Stu I+Stu I)，將其與質(zhì)粒VR-MS (經(jīng)Stu I酶切并膠回收)連接，獲得質(zhì)粒CpVR-MS。5)CpVR-IL2_MS 的構(gòu)建①雙順反子載體DV的構(gòu)建將上述VR1012載體改造成具有兩個表達(dá)框架的真核表達(dá)載體。具體構(gòu)建方法如下以 VR1012 載體為模板，以 5’ -AGATCTGCTAGCGGATCCGATCTGCTGTGCCTTCTA-3 ' (SEQIDNO 11)和 5' -AGATCTCTATGAITTCTCTCATTACTTC-3' (SEQ ID NO 12)為引物，通過 PCR擴(kuò)增BGH序列，使其5 ’端帶有Bgl II、Nhe I和BamHl，3 ’端帶有Bgl 11酶切位點；以VRlO 12載體為模板，5，-GGATCCATTGGCTATTGGCCATTGC-3' (SEQ ID NO : 13)和 5’ -GGATCCGAATTCGGGCCCAGATCTCTGCAGAAAAGACCCATGG-3' (SEQ ID NO 14)通過 PCR擴(kuò)增 CMV-intronA 序列，使其5’端帶有BamHl，3’端帶有Bgl IKApaUEcoRl和BamHl酶切位點；以上PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性95°C 5min，變性94°C lmin，退火55°C lmin，延伸72°C lmin，30個循環(huán)后，72°C延IOmin0利用BglII和BamHl具有相同粘性末端的特點，BGH可以通過Bgl II聯(lián)入VR1012的BamHl位點獲得VR1012-BGH質(zhì)粒，然后再通過BamHl將CMV-intronA連入VR1012-BGH的Bgl II位點，獲得VR1012-CMV-intronA-BGH質(zhì)粒，簡稱雙順反子載體DV。②CpDV的構(gòu)建將上述獲得的CpG的序列采用Stu I進(jìn)行單酶雙切，獲得外源片段CpG (Stu I/Stu
I)，將其與質(zhì)粒DV(經(jīng)Stu I酶切并膠回收)連接，獲得質(zhì)粒CpDV。③CpDV-IL2_MS 的構(gòu)建首先采用BamH I和BglII對質(zhì)粒VR-IL-2進(jìn)行酶切，獲得外源片段IL_2(BamHI/Bgl II)，然后將其與雙順反子載體CpDV(經(jīng)BamH I酶切并膠回收)連接，獲得質(zhì)粒CpDV-IL-2。然后采用Bgl II對質(zhì)粒VR-MS進(jìn)行單酶雙切，獲得外源片段MS (Bgl II/Bgl
II)，然后將其與質(zhì)粒CpDV-IL-2(經(jīng)BglII酶切并膠回收)連接，獲得質(zhì)粒CpDV-IL-2-MS。2.重組腺病毒疫苗(Ad_S8、Ad-MS)的獲得腺病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長約36kb，衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu),直徑約80-110nm。腺病毒基因組的兩端各有一段IOObp的反向末端重復(fù)序列(ITR)，是復(fù)制的起始位點。在左端ITR的3'側(cè)有一段長約300bp的包裝信號(HO介導(dǎo)腺病毒基因組包裝入病毒衣殼。對腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號(HO的約0.5kb的序列是順式作用元件，即必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過輔助病毒(或細(xì)胞)反式補足。本實驗中米用的腺病毒系統(tǒng)是AdMax Adenovirus載體系統(tǒng)(Microbix公司)，該系統(tǒng)是位點特異性重組系統(tǒng)，位點特異性重組是發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點上的重組，重組的發(fā)生需一段同源序列即特異性位點和位點特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。重組酶只能催化特異性位點間的重組，不能催化其它任何兩條同源或非同源序列之間的重組，因而重組具有特異性和高度保守性。據(jù)此，位點特異性重組又稱保守重組，該重組過程不需RecA酶參與。目前應(yīng)用較多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系統(tǒng)，其中Cre、FLP和BP均為特異性重組酶，屬重組酶\整合酶家族，它們催化的反應(yīng)類型、靶位點及重組機制十分相似，loxP、FRT和attBP為特異性位點，也有相似的結(jié)構(gòu)。AdMaxTMAdenovirus載體應(yīng)用的是Cre/loxP系統(tǒng)，Cre基因表達(dá)產(chǎn)物為343個氨基酸的單聚體蛋白，分子量為38kDa，它是位點特異性重組發(fā)生所需的特異性重組酶，其識別位點被稱為IoxP (locus ofcrossing-over PI),為一段34bp的DNA序列，由兩個13bp的反向重復(fù)序列和一個8bp的不對稱間隔序列(又稱為核心序列)組成5' -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'。 IoxP位點堿基重排后形成十字形的結(jié)構(gòu)，核心序列形成一單鏈環(huán)，它為Cre重組酶切割的底物，也是DNA識別與重組的位點，對稱的13bp反向重復(fù)序列是Cre重組酶結(jié)合的序列。AdMaxTM Adenovirus載體系統(tǒng)是由穿梭載體和骨架載體(pBHGlox A El, 3Cre)構(gòu)成，各含有一個同向排列的LoxP位點，其中骨架載體還含有由CMV啟動子調(diào)控的Cre基因。將穿梭載體與骨架載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞株293，骨架載體所攜帶的Cre基因開始表達(dá)，介導(dǎo)兩個LoxP位點之間的重組，剪切掉骨架載體上的細(xì)菌內(nèi)復(fù)制元件、抗性基因以及Cre基因，同時完成目的基因的插入。由于骨架載體雖然攜帶有大部分的腺病毒基因組DNA卻缺少形成有感染能力腺病毒顆粒所必需的包裝信號(HO，而穿梭載體則含有V，因此只有在兩個載體之間發(fā)生了重組，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重組腺病毒顆粒 ’另夕卜，骨架載體缺失El基因，因此需要轉(zhuǎn)染組成型表達(dá)El蛋白的293細(xì)胞。將骨架載體和穿梭載體(本研究選用的穿梭載體為pDC316，圖譜見圖2B)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，利用293細(xì)胞中的El蛋白，10左右天就可以產(chǎn)生出含有外源基因的重組腺病毒噬斑(見圖2A)，挑取噬斑，進(jìn)行PCR(反應(yīng)條件為95°C 30s,53°C 30s,72°C lmin，進(jìn)行30個循環(huán))鑒定，選取正確的克隆進(jìn)行大量擴(kuò)增、純化和滴度測定。I)穿梭重組質(zhì)粒pDC316-S8和pDC316_MS的獲得將pGEM-T-S8用EcoRI/BamHI雙酶切后回收得到S8目的片段，將pDC316用EcoRI/BglII雙酶切后回收作為載體，利用BamHI和BglII具有相同粘性末端的性質(zhì)，將回收目的基因片段和載體片段進(jìn)行用T4DNA連接酶，16度連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO (Invitrogen公司)，涂布卡那霉素抗性的LB平板,并于37°C下培養(yǎng)過夜,挑選陽性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，I, 2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，用EcoRI/Bglll進(jìn)行雙酶切和測序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒pDC316-S8(圖譜見圖2C)質(zhì)粒。將VR-MS用Bgin單酶切后回收得到MS目的片段，將pDC316用Bgl n單酶切后回收作為載體，將回收目的基因片段和載體片段進(jìn)行連接，經(jīng)雙酶切和測序鑒定結(jié)果正確，即獲得pDC316-MS(圖譜見圖2D)質(zhì)粒。
2) Ad-S8和Ad-MS重組病毒的獲得將pBHGlox A El,3Cre 和 pDC316_S8 或 pDC316_MS 共轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞后，經(jīng)過篩選、擴(kuò)增、純化后，獲得分別含有S8和MS片段的重組腺病毒Ad-S8或Ad-MS。3.重組MVA疫苗(MVA-MS)的獲得改良安卡拉痘苗(MVA，Modified Vaccinia Ankara)具有安全性高、外源基因容量大等優(yōu)點使其得以廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫治療中。MVA含有胸苷激酶基因(TK)(參見圖3A)；pSCll(參見圖3B)是它的穿梭質(zhì)粒，具有多克隆酶切位點可以插入外源基因、具有胸苷激酶的左臂和右臂(TKL、TKR)可以與MVA進(jìn)行同源重組，同時含有IacZ基因，可以用于重組MVA(rMVA)的藍(lán)斑篩選。所述MVA系統(tǒng)(含穿梭質(zhì)粒pSC 11)購自ATCC。I)穿梭重組質(zhì)粒pSCl I-MS的獲得
將VR-MS和pSCll經(jīng)Sall/Kpnl雙酶切后回收，將回收目的基因片段MS和PSCll載體片段用T4DNA連接酶，16度連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO (invitrogen公司),涂布卡那霉素抗性的LB平板,并于37°C下培養(yǎng)過夜,挑選陽性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，12000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，用Sall/Kpnl進(jìn)行雙酶切和測序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒pSCll-MS(見圖3C)。2) MVA-MS重組病毒的獲得首先以滴度0. 05pfu/cell 的 MVA 感染 tk_tsl3 細(xì)胞(購自 ATCC，ATCC號為CRL-1632 ，是不含有TK基因的BHK-21的突變株)。感染2小時后，利用Lipofection2000 (INVITROGEN)的方法將 pSCll-MS 轉(zhuǎn)染到感染了 MVA 的 tk_tsl3 細(xì)胞中。MVA在tk-tsl3細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過程中，由于pSClI-MS具有與MVA的TK基因同源的TKL和TKR,所以有一定比例的MVA病毒與pSCll-MS發(fā)生重組，結(jié)果MS和LacZ閱讀框架被重組到MVA病毒基因組中。形成如圖3C所示的MVA-MS重組病毒。以上被感染細(xì)胞培養(yǎng)三天后，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，超聲波處理，2000rpm離心IOmin除去細(xì)胞殘渣保留上清。取一定量上清，作為種毒，在6孔板中將病毒依次稀釋成lO'lO'lO'lO'lO—6，感染tk-tsl3細(xì)胞2h。將等體積的在45°C下預(yù)溫的2%低熔點瓊脂糖和2 X DMEM-10/BrdU (BrdU, 5-溴脲嘧啶，可被TK磷酸化，磷酸化的BrdU可摻入到野生型MVA中，產(chǎn)生致死性突變，從而可以使野生型MVA逐漸減少)培養(yǎng)基混勻，每孔加入3ml培養(yǎng)基，在室溫下凝固，在37°C下于含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。鋪上層選擇性培養(yǎng)基，成分比下層瓊脂多了 1/120體積的4%X-gal。培養(yǎng)過夜，挑選藍(lán)色單斑，反復(fù)凍融三次裂解釋放病毒，進(jìn)行下一輪的篩選，步驟相同，如此進(jìn)行6輪以上篩選，最后直至得到只含重組病毒MVA-MS的克隆株。4.重組蛋白疫苗(S8、9M)的獲得I)重組蛋白疫苗9M的制備在上述制備33M片段的過程中，我們運用同樣的方法獲得了 9M基因片段，通過PCR擴(kuò)曾使其5’端引入Sal I位點，3’端引入Xho I位點，然后將其克隆到原核表達(dá)載體pRsetB載體(購自invitrogen公司)的Sall/Xho I位點，即獲得了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pRsetB-9M。經(jīng)測序正確后,將pRset B-9M質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (invitrogen公司)，涂布氨芐霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜。次日將菌種以I : 250的比例轉(zhuǎn)接入500ml三角瓶，培養(yǎng)至菌液OD值達(dá)到0. 6 0. 8，加入IPTG使其終濃度為ImM，37°C，230rpm培養(yǎng)5h，4000rpm，20min離心收獲菌體。菌體可于_20°C保存。(每升菌液可收獲3g左右濕菌)。收獲的濕菌以50mM Tris溶液溶解,300M Hz超聲破碎20min, 12000rpm, 30min離心，收獲上清液。此上清液經(jīng)離子交換層析及親和層析(Ni柱)兩步純化，純化得到的蛋白純度可達(dá)85%以上(見圖17)。具體操作參照pRset B蛋白純化操作手冊進(jìn)行(invitrogen公司)。2)重組蛋白疫苗S8的制備將上述獲得的S8基因片段，通過PCR擴(kuò)曾使其5’端引入Nde I位點，3’端引入HindIII位點，然后將其克隆到原核表達(dá)載體pRset B載體的Nde I/HindIII位點，即獲得了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pRset B-S8。經(jīng)測序正確后,將pRset B-S (S8)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (invitrogen公司)，涂布氨芐霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜。次日將菌種以I : 250的比例轉(zhuǎn)接入500ml三角瓶，培養(yǎng)至菌液OD值達(dá)到0. 6 0. 8，加入IPTG使其終濃度為ImM，37°C，230rpm培養(yǎng)5h, 4000rpm, 20min離心收獲菌體。茵體可于_20°C保存。(每升菌液可收獲3g左右濕菌)。收獲的濕菌以50mM Tris,300mM NaCl溶液溶解，300M Hz超聲破碎20min，12000rpm, 30min離心，收獲沉淀。此沉淀經(jīng)8M尿素溶解過夜，次日以15000rpm, 30min離心，收取上清，此上清液經(jīng)親和層析(Ni柱)純化，純化得到的蛋白純度可達(dá)85%以上(見圖 17)。
三.疫苗免疫效果I. DNA疫苗及病毒載體疫苗免疫效果1.1 S8疫苗免疫效果I. I. I S8疫苗的免疫原性本部分實驗從體液免疫和細(xì)胞免疫兩個方面探討生存素DNA疫苗和重組腺病毒疫苗，以及其與IL-2質(zhì)粒共免疫誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答。實驗將C57/BL/6小鼠按表I進(jìn)行分組，I組在第0、2、4、6周注射PBS ；2-4組在第0、2、4、6周注射VR-S8疫苗及VR-IL2佐劑；5組在第0、2、4周注射VR-S8DNA疫苗及VR-IL2佐劑，在第6周注射重組腺病毒疫苗。考察生存素DNA單獨免疫的免疫效果、IL-2質(zhì)粒的佐劑效果，以及重組腺病毒的免疫增強作用。表I S8疫苗免疫原性
組別__第O、2、4周第6周__第8周
IPBS_ PBS_ PBS取脾、CTL

權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒CpVR-MS，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為VR-MS，在所述VR-MS的非編碼區(qū)插入CpG motif序列，優(yōu)選地，其中非編碼區(qū)中的插入位點為Stul位點。
2.一種雙順反子表達(dá)載體DV，其特征在于所述表達(dá)載體的骨架載體為VR1012，在所述VR1012多克隆酶切位點插入了 BGH、CMV-intron A序列，使其在VR1012本身的第一表達(dá)框架之外，含有一個第二表達(dá)框架；優(yōu)選地，其中所述表達(dá)框架中的第一表達(dá)框架的多克隆位點包括Pstl、Sail、notl、Xbal、Nhel、BamHl，第二表達(dá)框架的多克隆酶切位點包括Bgl2、Apal、EcoRl0
3.一種帶有CpG motif的雙順反子表達(dá)載體CpDV,其特征在于所述表達(dá)載體的骨架載體為權(quán)利要求2所述的DV，在所述DV的非編碼區(qū)插入CpG motif序列；優(yōu)選地，其中非編 碼區(qū)中的插入位點為Stul位點。
4.一種重組質(zhì)粒CpDV-IL2-MS，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為權(quán)利要求3所述的CpDV，在所述CpDV的第一表達(dá)框的多克隆位點插入IL-2序列，在所述CpDV的第二表達(dá)框的多克隆位點插入MS序列；優(yōu)選地，其中第一表達(dá)框的插入多克隆位點為BamHl，第二個表達(dá)框的插入多克隆位點為Bgl2。
5.一種重組質(zhì)粒pRSET B-9M，其特征在于在pRSET B原核表達(dá)載體的多克隆位點中插入一個含有9個拷貝的MUC1VNTR的序列9M ;優(yōu)選地，其中所述插入多克隆位點為BamH I/EcoRIo
6.一種重組質(zhì)粒pRSET B-S8，其特征在于在pRSET B原核表達(dá)載體的多克隆位點中插入一個SEQ ID N0:8所述的序列S8 ;優(yōu)選地，其中所述插入多克隆位點為BamH I/EcoR I。
7.一種疫苗組合物，包括權(quán)利要求I的重組質(zhì)粒CpVR-MS ;優(yōu)選地，還包括免疫佐劑；更優(yōu)選地，其中所述免疫佐劑選自細(xì)胞因子白介素2(IL-2)、細(xì)胞因子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列。
8.一種疫苗組合物，包括權(quán)利要求4的重組質(zhì)粒CpDV-IL2-MS ;優(yōu)選地，還包括免疫佐齊U ;更優(yōu)選地，其中所述免疫佐劑選自細(xì)胞因子白介素2 (IL-2)、細(xì)胞因子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列。
9.一種疫苗組合物，包括S8蛋白和/或9M蛋白；優(yōu)選地，還包括免疫佐劑；更優(yōu)選地，其中所述的免疫佐劑選自DDA、MPL、AD11SM。
10.權(quán)利要求I所述的重組質(zhì)粒、權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)?；蛘逽8蛋白和/或9M蛋白在制備用于治療腫瘤的疫苗中的用途；優(yōu)選地，其中所述疫苗還包含化療藥物；更優(yōu)選地，其中所述化療藥物選自卡鉬、順鉬、奧沙利鉬和紫杉醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤DNA疫苗、病毒載體疫苗及蛋白疫苗領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及以粘蛋白1和生存素為靶點的腫瘤基因工程疫苗，包括重組DNA載體CpVR-MS和CpDV-IL2-MS；重組蛋白疫苗S8和9M，以及DNA疫苗、病毒載體疫苗、蛋白疫苗以及這三種形式疫苗之間免疫方式的優(yōu)化組合在制備抗腫瘤疫苗中的用途。
文檔編號C12N15/63GK102732543SQ20111008636
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者于永慧, 于湘暉, 孔維, 張麗星, 張海紅, 王玉倩 申請人:吉林大學(xué), 長春百克生物科技股份公司