專利名稱：12+2高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因領(lǐng)域，具體是一種12+2高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)自20世紀70年代末到20世紀80 年代初發(fā)現(xiàn)與宮頸癌相關(guān)以來，一直受人們的關(guān)注。大量的研究結(jié)果表明HPV在宮頸細胞異常以及宮頸癌的病理學(xué)上具有最為重要的作用。目前，100多種HPV基因型已被鑒定，其中約40種與生殖道感染相關(guān)。高危型主要與宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN) ΙΙ,ΙΙΙ級和宮頸癌的發(fā)生相關(guān)。低危型一般與惡性病變無關(guān)，主要引起尖銳濕疣和低級別CIN(CINI)。宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，在女性惡性腫瘤中居第二位。據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)每年大約有46. 6萬左右的宮頸癌新發(fā)病例，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。上世紀50年代，我國就開始積極開展宮頸癌的防治工作，使得宮頸癌的死亡率由上世紀70年代的10. 28/10萬下降到了上世紀90年代的3. 25/10萬。盡管在過去的20年間，我國宮頸癌的死亡率大幅下降，但是每年仍然有新發(fā)病例13. 15萬，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的28. 2%。特別是中西部的部分地區(qū)，宮頸癌的死亡率與發(fā)病率幾十年卻始終居高不下，如甘肅武都、山西陽城等縣，宮頸癌死亡率高達36. 00/10萬，超過全國宮頸癌死亡率的10倍，遠高于世界平均水平8. 00/10萬。造成這種現(xiàn)象的原因除與當?shù)氐慕?jīng)濟水平等因素有關(guān)外，同時與宮頸癌的篩查有關(guān)，目前臨床上常用的宮頸細胞學(xué)檢查方法主要有兩種巴氏涂片法(即宮頸刮片)和液基薄層細胞學(xué)檢查法(TCT)，由于主觀因素的影響，這兩種方法的假陰性較高，容易造成漏診。因此，采用合理、廉價的篩查方法， 對提早預(yù)防、診斷和治療宮頸癌有非常重要的意義。早在1977年，Laverty在電鏡中觀察到宮頸癌活檢組織中有人乳頭狀瘤病毒 (HPV)顆粒的存在，以及^ir Hausen提出HPV病毒與宮頸癌發(fā)病相關(guān)聯(lián)的假設(shè)后，國內(nèi)外學(xué)者進行了大量的研究，并在1995年的IARC專題討論會上通過HPV感染是宮頸癌的主要原因，即HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件。臨床證明95-99. 7%的宮頸癌病例和高危型HPV 病毒感染有關(guān)。在過去10年的研究中，通過DNA檢測技術(shù)已持續(xù)發(fā)現(xiàn)90%以上的宮頸癌病人都有HPV感染。至今發(fā)現(xiàn)的HPV病毒約有100多種，但并非所有的病毒都會引起宮頸癌， 根據(jù)HPV感染人體后可致宮頸癌的相關(guān)性，分為低危型HPV以及高危型HPV，低危型HPV可導(dǎo)致生殖器尖銳濕疣，影響生活質(zhì)量；高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宮頸癌及高度宮頸上皮內(nèi)瘤，其已明確的病毒亞型主要有HPV 16、18、31、33、 35、39、45、51、52、56、58、59型和HPV68型等。來自世界范圍的宮頸癌組織標本的研究發(fā)現(xiàn)， HPV16和HPV18型感染率最高，在檢出的所有型別中，HPV16占50%，HPV18占14%, HPV45 占8%，HPV31占5%，其他型別的HPV占23%。HPV16、18型感染很普遍，沒有明顯的地區(qū)差異。但是有些HPV型別的感染有地區(qū)差異，如HPV45型在非洲西部很常見，而HPV39和59 型僅在美洲的中部和南部出現(xiàn)，HPV52，58則在中國婦女中檢出率較高。HPV的型別還與宮
3頸癌的病理類型有關(guān)，在宮頸鱗狀上皮細胞癌中以HPV16為主(占51%)，而在宮頸腺癌和宮頸腺鱗細胞癌中HPV18分別占56%和39%。高危型HPV導(dǎo)致癌癥的機會較高，在99. 8%的宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)HPV的感染，現(xiàn)已知至少有13種高危型HPV與95%的早期浸潤和浸潤性子宮頸癌有關(guān)。HPV感染使得宮頸癌的相對危險性增加250倍，因此提早診斷HPV感染，防止其向?qū)m頸癌演變有著非常重要的
眉、ο世界衛(wèi)生組織明確提出13 種 HPV 高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、 58、59、68)應(yīng)該單獨或聯(lián)同細胞學(xué)應(yīng)用于宮頸癌篩查。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)宮頸癌篩查實踐指南及美國陰道鏡檢查與子宮頸病理學(xué)會(ASCCP)另外指出，檢測13種高危型 HPV時，HPV16和HPV18必須特別重視。它們明確指出即使宮頸細胞學(xué)無異常而HPV陽性的 30歲以上女性，如其為HPV16、HPV18感染者，應(yīng)立即進行陰道鏡檢查。因此，HPV分型檢測， 特別是HPV16、HPV18的分型檢測比13種高危型綜合籠統(tǒng)歸類檢測更具臨床指導(dǎo)意義?，F(xiàn)有產(chǎn)品HPV核酸擴增分型檢測試劑盒，如凱普人乳頭狀瘤病毒核酸擴增分型檢測試劑盒，廣泛應(yīng)用于宮頸疾病的診治全過程，臨床中發(fā)揮重要作用，降低宮頸病變漏診和避免過度診斷治療，目前已成為宮頸疾病后續(xù)的隨訪指標。但是，如果用于大規(guī)模人群篩查即嫌成本較高，且操作要求嚴格復(fù)雜而費事。至于美國HC2捕獲雜交法13種高危型檢測試劑盒及國內(nèi)“13種高危型HPV核酸擴增熒光檢測試劑盒”具有操作簡單，自動化程度高的優(yōu)點，但都無法區(qū)分具體HPV型，無法鑒定HPV16和HPV18。所以，無論作為臨床還是篩查，也存在較明顯的缺陷與不足。為此，如果在熒光PCR(Real-Time PCR)核酸檢測技術(shù)平臺，開發(fā)一種能同一反應(yīng)管就可以將高危型HPV檢測又能將HPV16、HPV18分型的高效產(chǎn)品，既滿足篩查要求又更好提供臨床指導(dǎo)。另外，根據(jù)學(xué)術(shù)界最新的共識，認為HPV66也是高危型，雖然在宮頸癌病人中感染比例較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，提供一種12+2高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒，包括(1)具有僅與 12 種高危型 HPV(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的 DNA 互補的核甘酸序列的SEQ ID No 1 12的探針及SEQ ID No 13 36的引物；(2)與高危型HPV16的DNA互補的核甘酸序列的SEQ ID No 37的探針及SEQ ID No 38 39的引物；(3)與高危型HPV18的DNA互補的核甘酸序列的SEQ ID No 40的探針及SEQ ID No 41 42的引物；(4)與細胞內(nèi)β -globin基因的DNA互補的核甘酸序列的SEQ ID No 43的探針及SEQ ID No 44 45的引物；其中，上述每組探針分別標記最大發(fā)射波長518nm、538 553nm、574 575、 607 615、640、666 667、690染料的其中一種并且不同。具體探針和引物的核苷酸排列順序如下
權(quán)利要求
1. 一種12+2高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒，包括(1)具有僅與12種高危型HPV的DNA互補的核甘酸序列的SEQID No :1 12的探針及SEQ ID No 13 36的引物；(2)與高危型HPV16的DNA互補的核甘酸序列的SEQID No 37的探針及SEQ ID No 38 39的引物；(3)與高危型HPV18的DNA互補的核甘酸序列的SEQID No 40的探針及SEQ ID No 41 42的引物；(4)與細胞內(nèi)β-globin基因的DNA互補的核甘酸序列的SEQID No :43的探針及SEQ ID No 44 45的引物；其中，上述每組探針分別標記最大發(fā)射波長518nm、538 553nm、574 575、607 615,640,666 667、690染料的其中一種并且不同。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種12+2高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒，包括(1)具有僅與12種高危型HPV的DNA互補的核甘酸序列的SEQ ID No1～12的探針及SEQ ID No13～36的引物；(2)與高危型HPV16的DNA互補的核甘酸序列的SEQ ID No37的探針及SEQ ID No38～39的引物；(3)與高危型HPV18的DNA互補的核甘酸序列的SEQ ID No40的探針及SEQ ID No41～42的引物；(4)與細胞內(nèi)β-globin基因的DNA互補的核甘酸序列的SEQ ID No43的探針及SEQ ID No44～45的引物；其中，上述每組探針分別標記最大發(fā)射波長518nm、538～553nm、574～575、607～615、640、666～667、690染料的其中一種并且不同。本發(fā)明的試劑盒可以最大限度減輕我國HPV基因檢測所帶來的巨額費用，同時保護人民的身體健康。
文檔編號C12Q1/68GK102154524SQ201110087008
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月3日
發(fā)明者李烈軍, 謝龍旭 申請人:潮州凱普生物化學(xué)有限公司