專利名稱：一種米爾頓姬小蜂分子檢測引物、檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種米爾頓姬小蜂分子檢測引物、檢測方法及其應(yīng)用。屬于農(nóng)作物害蟲檢測、鑒定及防治技術(shù)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
米爾頓姬小錢Anselmella miltoni Girault隸屬于昆蟲目，小蜂總科 Chalcidoidea,姬小蜂禾斗 Eu 1 ophidae, Anselmella 屬。米爾頓姬小蜂幼蟲是植食性的，以取食蒲桃屬類的種子發(fā)育。該類型水果是無核的，遭受危害后，形成一個看起來像核桃模樣的蟲癭，不僅影響水果的產(chǎn)量，而且使其失去食用價值。該蟲繁殖速度快、量大、危害嚴(yán)重。當(dāng)前，我國的海南、廣東、廣西、福建等地都有種植蓮霧，因此，受米爾頓姬小蜂危害的影響顯然易見。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用PCR技術(shù)對昆蟲進(jìn)行特異、靈敏的快速分子檢測的成功例子已越來越多(竇向梅，200幻。國內(nèi)外有學(xué)者利用基于ITS堿基序列設(shè)計引物對昆蟲的分子檢測開展研究(Gallego，2001，劉玉娣，2009)。rDNA中的ITS區(qū)段以中性的方式進(jìn)化，速度大約與物種形成的進(jìn)程相仿(李正西，2001)。rDNA-ITS2在種內(nèi)相當(dāng)保守，而在種間表現(xiàn)出一定的變異，是區(qū)分種或種下階元的理想分子標(biāo)記。由于小蜂類昆蟲的個體小，約2 mm，利用傳統(tǒng)形態(tài)分類特征難以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，而且也需要鑒定者具有良好的經(jīng)驗和專業(yè)背景知識，而基于PCR方法的分子鑒定只要求工作者有簡單的分子操作技能。目前，還沒有米爾頓姬小蜂的分子檢測鑒定方法。本申請發(fā)明人在國際上首次測定了米爾頓姬小蜂ITS序列，設(shè)計特異性引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction, PCR)建立了米爾頓姬小蜂的PCR檢測方法，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種米爾頓姬小蜂分子檢測引物、檢測方法及其應(yīng)用。 本發(fā)明針對米爾頓姬小蜂個體小(大小約2 mm)，利用傳統(tǒng)形態(tài)分類特征難以與其它小蜂區(qū)分，為米爾頓姬小蜂提供一種特異分子檢測引物，方法結(jié)果可靠、易于操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高，可用于米爾頓姬小蜂的快速檢測。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是
一種米爾頓姬小蜂分子檢測引物，所述米爾頓姬小蜂分子檢測引物的DNA序列為 上游引物(MITS2F) 5' -TCGGAAGTGTCAATAGGCG-3‘； 下游引物(MITS2R) 5' -TCCATCTCGCATTACCCTC-3‘。一種米爾頓姬小蜂分子的檢測方法，包括如下步驟提取昆蟲基因組DNA ；以該總 DNA為模板用上述的一對引物MITS2F和MITS2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增；反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，當(dāng)能特異性地擴(kuò)增出317 bp的產(chǎn)物，即可判斷該昆蟲為米爾頓姬小蜂。
所述的PCR反應(yīng)體系為25μ 1，其中2.5 μ IOXDream Taq 緩沖液(含20 mmol / L MgCl2)(立陶宛 Fermentas 公司)，dNTP 混合物 mmol / L) 2 μ (立陶宛 Fermentas 公司)，10 Mmol / L的上游引物MITS2F 1.5 μ , 10 Mmol / L的下游引物MITS2R 1. 5μ ,5 U/μ 的 Dream Taq DNA 聚合酶 0.2 μΚ立陶宛 Fermentas 公司)，模板 DNA 4μ , 加滅菌雙蒸水至25 μ 1。PCR反應(yīng)程序如下95 °C預(yù)變性;3min;94 °C變性45s，58°C退火 lmin，72°C延伸lmin，運(yùn)行35個循環(huán)；最后72°C延伸7min。一種米爾頓姬小蜂分子檢測引物的應(yīng)用，所述米爾頓姬小蜂分子檢測引物能應(yīng)用于米爾頓姬小蜂檢測用引物的試劑盒。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明根據(jù)米爾頓姬小蜂ITS序列設(shè)計引物，該引物可用于米爾頓姬小蜂的PCR檢測。而且本發(fā)明引物及相關(guān)試劑可組裝成試劑盒，以方便使用。本發(fā)明檢測方法能夠快速準(zhǔn)確地判斷樣品是否為米爾頓姬小蜂，為進(jìn)出口安全提供了保證。


圖1是米爾頓姬小蜂PCR方法的特異性試驗結(jié)果。M為100 bp的DNA Marker, 1為桉樹枝癭姬小蜂的檢測結(jié)果，2為刺桐姬小蜂的檢測結(jié)果，3為米爾頓姬小蜂的檢測結(jié)果。圖2是單只米爾頓姬小蜂PCR方法的試驗結(jié)果。
具體實施例方式實施例1
1)總DNA的提取
方法一多只昆蟲總DNA的提取
采用TaKaRa公司生產(chǎn)的通用基因組DNA提取試劑盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 3. 0)提取基因組DNA，包括如下步驟:
(1)將30只昆蟲放入研缽中，加入500μ 的SolutionA (TaKaRa公司的試劑盒提供)和1. Ομ 的RNase Al (TaKaRa公司的試劑盒提供)碾磨，將勻漿收集至Collection Tube (TaKaRa公司的試劑盒提供)中；
(2)用200 μ 的 Solution A 沖洗研缽并轉(zhuǎn)移至 Collection Tube 中，65 °C保溫 5-10
min ；
(3)向CollectionTube中加入400 μ 的Solution B (TaKaRa公司的試劑盒提供)，振蕩混合；再加入1 mL的4°C預(yù)冷的Solution C (TaKaRa公司的試劑盒提供)，充分混勻后， 12000 rpm 離心 2 min ；
(4)棄去上層的有機(jī)相，再加入1mL的4 °C預(yù)冷的Solution C，充分混勻后，12000rpm 離心2 min ；
(5)棄去上層的有機(jī)相，然后將水相溶液(無色下層)轉(zhuǎn)移到置于CollectionTube上的Filter Cup (TaKaRa公司的試劑盒提供)中，12000 rpm離心1 min ；
(6)棄FilterCup，在濾液中加入400μ 的DB Buffer (TaKaRa公司的試劑盒提供)，混合均勻；
(7)將試劑盒中的SpinColumn(TaKaRa公司的試劑盒提供)安置于Collection Tube 上，將上述步驟6得到的混合溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000 rpm離心1 min，棄濾液；(8)將500μ 的Rinse A(TaKaRa公司的試劑盒提供)加入至Spin Column中，12000 rpm離心30 s，棄濾液；
(9)將700μ 的Rinse B(TaKaRa公司的試劑盒提供)加入至Spin Column中，12000 rpm離心30 s，棄濾液；
(10)重復(fù)操作步驟(9)；
(11)將SpinColumn安置于新的1. 5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入 50 μ 的65 ！滅菌蒸餾水，室溫靜置1 min ；
(12)12000 rpm離心1 min洗脫后得到DNA ；
(13)將提取好的總DNA放于-20V保存，備用。方法二 單只昆蟲總DNA的提取
將單只昆蟲用研缽搗碎，用100 μι 10 X TE緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/ L EDTA，pH 8.0)沖洗至1.5 mL離心管中；浸泡lh，蓋緊離心管蓋并用封口膜密封，振蕩，置于微波爐中700 W加熱2 min ；重復(fù)3次，立即將離心管轉(zhuǎn)入冰浴2 min, 12000 r/min離心1 min，吸取10 PL上清液作為PCR模板。2)引物設(shè)計和合成
通過測定米爾頓姬小蜂的ITS序列的基礎(chǔ)上，應(yīng)用I^rimer premier 5軟件比對設(shè)計特異引物，獲得米爾頓姬小蜂分子檢測特異引物序列。所述米爾頓姬小蜂分子檢測引物的DNA 序列為
上游引物(MITS2F) 5' -TCGGAAGTGTCAATAGGCG-3‘； 下游引物(MITS2R) 5' -TCCATCTCGCATTACCCTC-3‘ 3) PCR擴(kuò)增方法的建立
以上述提取的總DNA為模板，用引物MITS2F和MITS2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為 25 μ 1，其中 2.5 μ IOXDream Taq 緩沖液(含 20 mmol / L MgCl2)(立陶宛 Fermentas 公司)，dNTP 混合物 mmol / L) 2μ (立陶宛!^ermentas 公司)，ΙΟμπιοΙ / L 的上游引物 MITS2F 1. 5μ , IOMmol / L 的下游引物 MITS2R 1.5 μ , 5\]/μ ^ Dream Taq DNA Polymerase 0.2 μ (立陶宛Fermentas公司)，多只昆蟲總DNA 4 μ (單只昆蟲總DNA 10 PL)，加滅菌雙蒸水至終體積。PCR反應(yīng)程序如下95°C預(yù)變性3 11^11;941變性458，58 V 退火lmin，72°C延伸1 min，運(yùn)行；35個循環(huán)；最后72°C延伸7min。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)是否擴(kuò)增到317 bp的DNA片段判定昆蟲樣品是否為米爾頓姬小蜂。本實施例檢測方法能夠快速準(zhǔn)確地判斷昆蟲樣品是否為米爾頓姬小蜂，為進(jìn)出口安全提供了保證。實施例2
米爾頓姬小蜂PCR方法的特異性檢測
分別取30只的米爾頓姬小蜂、桉樹枝癭姬小蜂、刺桐姬小蜂，按實施例1方法分別提取總DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。結(jié)果在米爾頓姬小蜂中檢出317 bp的 DNA片段，而桉樹枝癭姬小蜂、刺桐姬小蜂中均未檢出317 bp的DNA片段。檢測結(jié)果如圖1 所示。表明建立的PCR方法具有良好的特異性，可用于米爾頓姬小蜂的快速檢測。實施例3
單只米爾頓姬小蜂的PCR檢測取單只米爾頓姬小蜂，按實施例1方法提取總DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。結(jié)果在單只米爾頓姬小蜂中檢出317 bp的DNA片段。檢測結(jié)果如圖2所示。表明建立的PCR方法具有良好的靈敏性，可用于單只米爾頓姬小蜂的快速檢測。
權(quán)利要求
1.一種米爾頓姬小蜂分子檢測引物，其特征在于由正反向引物組成，所述米爾頓姬小蜂分子檢測引物的DNA序列為上游引物(MITS2F) 5' -TCGGAAGTGTCAATAGGCG-3‘；下游引物(MITS2R) 5' -TCCATCTCGCATTACCCTC-3‘。
2.一種如權(quán)利要求1所述的米爾頓姬小蜂分子的檢測方法，其特征在于包括如下步驟以提取的昆蟲總RNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果，米爾頓姬小蜂能檢出317 bp的DNA片段。
3.如權(quán)利要求2所述的一種米爾頓姬小蜂分子的檢測方法，其特征在于所述的PCR 反應(yīng)包括總DNA提取和PCR擴(kuò)增兩個過程。
4.如權(quán)利要求3所述的一種米爾頓姬小蜂分子的檢測方法，其特征在于所述的PCR 反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性3 11^11;然后941變性458，58 °C退火lmin，72°C延伸1 min，運(yùn)行 35個循環(huán)；最后72°C延伸7min。
5.一種如權(quán)利要求1所述的米爾頓姬小蜂分子檢測引物的應(yīng)用，其特征在于所述米爾頓姬小蜂分子檢測引物能應(yīng)用于米爾頓姬小蜂檢測用引物的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種米爾頓姬小蜂分子檢測引物、檢測方法及其應(yīng)用，所述米爾頓姬小蜂分子檢測引物的DNA序列為上游引物(MITS2F)5′-TCGGAAGTGTCAATAGGCG-3′；下游引物(MITS2R)5′-TCCATCTCGCATTACCCTC-3′。本發(fā)明方法結(jié)果可靠、易于操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高，可用于米爾頓姬小蜂高靈敏度快速分子檢測，為進(jìn)出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/68GK102181542SQ20111008708
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者廖富榮, 林石明, 黃蓬英 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心