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一種驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1的方法

文檔序號:395168閱讀:437來源:國知局
專利名稱:一種驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域,尤其涉及一種驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl的方法。
背景技術(shù)
炭疽桿菌是一種桿狀、能形成芽胞的革蘭氏陽性桿菌,能夠引起人畜的炭疽病,如果不及時治療,死亡率極高。炭疽桿菌含有兩個致病相關(guān)的毒力大質(zhì)粒pX01(181. 6kb)和pX02(96. 2kb)。質(zhì)粒pXOl編碼保護性抗原、致死因子和水腫因子等炭疽毒素蛋白及他們的調(diào)控基因。質(zhì)粒PX02編碼參與莢膜形成和降解的基因。這兩個質(zhì)粒對于炭疽桿菌的致病性至關(guān)重要,丟失任何一個質(zhì)粒都會導(dǎo)致炭疽菌的毒力極大的減低。因此對于炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒的研究一直是研究的熱點。構(gòu)建驅(qū)除毒力質(zhì)粒的突變菌株對于研究質(zhì)粒在炭疽桿菌致病中的作用及染色體的相關(guān)調(diào)控非常重要。驅(qū)除細菌的大質(zhì)??梢允褂抿?qū)除化學(xué)試劑,比如吖啶橙、新霉素、溴化乙啶等。高 溫培養(yǎng)或紫外照射等方法。但是這些方法都有潛在的問題,第一是特異性差,即在驅(qū)除目的質(zhì)粒的過程中可能驅(qū)除目的質(zhì)粒以外的其他質(zhì)粒,第二是可能在處理過程中宿主細胞產(chǎn)生隨機突變的可能性。質(zhì)粒不相容是兩個不同的但是相關(guān)的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地在同一個細胞中遺傳。這些質(zhì)粒被放在一個相同的不相容群。這種不相容性主要是由于互相競爭相同的復(fù)制位點或分離位點,或者是由于復(fù)制起始的抑制。使用這個原理可以模擬自然機制使用一個小的、高拷貝的質(zhì)粒來去除毒力大質(zhì)粒。這種方法驅(qū)除質(zhì)??梢蕴禺惖臉?gòu)建質(zhì)粒缺失菌株而避免了誘導(dǎo)突變的危險。在一些細菌中已經(jīng)應(yīng)用質(zhì)粒不相容原理成功的驅(qū)除了目的質(zhì)粒,證明這是一種高效、安全的方法。但是由于對炭疽桿菌大質(zhì)粒PXOl的復(fù)制相關(guān)序列還不是很清楚,因而該方法還未用來驅(qū)除炭疽桿菌的大質(zhì)粒pXOl。早在1881年,Pasteur首先采用高溫培養(yǎng)減毒方法,獲得兩株具有莢膜的弱毒菌株(pX01_pX02+),用以制備巴氏I苗和II苗。主要用于歐洲和其它國家的畜群免疫;2006年展德文等采用42°C高溫培養(yǎng)法,驅(qū)除了炭疽桿菌人用減毒疫苗株A16R(pX01+pX02_)中的大質(zhì)粒pXOl,獲得一株無質(zhì)粒的炭疽菌A16RP(pX0rpX02-) ;2007年韓國的Sung-Ha Park等人,采用42°C高溫培養(yǎng)法從炭疽桿菌H9401 (pX01+pX02+)株中驅(qū)除了大質(zhì)粒pXOl,獲得了一株衍生菌H9401(pX0rpX02+)。這些驅(qū)除pXOl的方法中,pXOl的丟失是隨機的,必須經(jīng)過大量的篩選過程,有時甚至得不到所需要的菌株,另外,在篩選的過程中可能導(dǎo)致宿主菌染色體的隨機突變。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種重組載體。本發(fā)明提供的重組載體,為將DNA分子插入穿梭質(zhì)粒的SmaI位點得到的載體;所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I。所述穿梭質(zhì)粒為溫敏型穿梭質(zhì)粒,
所述溫敏型穿梭質(zhì)粒具體為pKSV7。所述重組載體在驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl的方法。本發(fā)明提供的方法,包括如下步驟將所述的重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌,得到重組菌;將所述重組菌傳代培養(yǎng),至所述重組菌中的炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl被驅(qū)除,得到驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl的重組菌。所述驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl方法中,在將所述的重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌前,還包括將所述重組載體去甲基化的步驟,
所述去甲基化的方法包括如下步驟I)、將所述重組載體轉(zhuǎn)入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中,得到重組菌I ;2)、提取步驟I)得到的所述重組菌I的質(zhì)粒,得到去甲基化的重組載體;所述驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl方法中,還包括將所述驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl的重組菌去除所述重組載體的步驟,所述將驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl的重組菌去除所述重組載體的方法包括如下步驟將所述驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl的重組菌分別接種在無所述重組載體抗性篩選標記物培養(yǎng)基和含所述重組載體抗性篩選標記物的培養(yǎng)基中培養(yǎng),選取在無所述重組載體抗性篩選標記物培養(yǎng)基生長且在含所述重組載體抗性篩選標記物的培養(yǎng)基上不生長的菌,得到驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和所述重組載體的重組菌。所述出發(fā)菌為炭疽桿菌(Bacillus anthracis);所述甲基化酶缺陷的大腸桿菌為大腸桿菌SCSllO ;所述抗性篩選標記物為氯霉素。所述傳代培養(yǎng)的溫度為不高于30°C,所述傳代培養(yǎng)的溫度具體為30°C ;所述將驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl的重組菌去除所述重組載體的方法中,所述培養(yǎng)溫度為37°C -42°C,所述培養(yǎng)溫度具體為37°C。所述方法制備的驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl的重組菌和/或驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和所述重組載體的重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。所述重組載體、所述的重組菌在制備疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍;所述疫苗具體為炭疽疫苗。本發(fā)明的第三個目的是提供一種炭疽疫苗。本發(fā)明提供的炭疽疫苗,其活性成分為所述的重組菌。本發(fā)明的實驗證明,本發(fā)明根據(jù)質(zhì)粒不相容原理構(gòu)建一個不相容質(zhì)粒,特異地從炭疽桿菌A16R(pX01+pX02_)中驅(qū)除了毒力大質(zhì)粒pXOl,然后在37°C培養(yǎng),驅(qū)除導(dǎo)入的外源質(zhì)粒,從而獲得了一株驅(qū)除PXOl的菌株A16R0。該方法具有簡單、快速、特異性好、安全性高的特點。該方法對于構(gòu)建炭疽桿菌的質(zhì)粒缺失株,從而研究大質(zhì)粒PXOl與染色體的相互作用具有極其重要的意義,對于構(gòu)建新的疫苗株提供了新的實驗手段,為炭疽桿菌的防治提供了新的思路。


圖I為外源重組質(zhì)粒pKS5K的酶切鑒定2為驅(qū)除pXOl的初步篩選圖3為驅(qū)除pXOl的PCR方法鑒定圖4為Western Blotting方法檢測PA蛋白圖5為外源重組質(zhì)粒pKS5K從A16R中驅(qū)除鑒定
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、驅(qū)除pXOl的重組菌的獲得及鑒定I、驅(qū)除質(zhì)粒構(gòu)建I. I溫敏型質(zhì)粒線性化將溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKSV7(6.9Kb)用限制性內(nèi)切酶SmaI酶切線性化,之后
0.6%瓊脂糖凝膠電泳分離,從凝膠上切下目標條帶,用DNA凝膠回收試劑盒回收線性化載體pKSV7片段,操作步驟按照說明書進行。骨架質(zhì)粒pKSV7質(zhì)粒(其上既沒有轉(zhuǎn)座子也沒有插入序列)Smith K, YoungmanP. Use of a new integrational vector to investigate compartment-specificexpression of the Bacillus subtilis spoIIM gene[J] Biochimie,1992,74 :705-711.,公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所獲得。1.2.驅(qū)除片段的PCR獲得以炭疽桿菌(Bacillus anthracis) A16R(購自蘭州生物制品研究所)基因組為模板,使用引物對5K_F和5K_R (表1),進行PCR擴增。PCR的體系為IOOul (I y L PyrobestDNA polymerase, 10 u L 10 X polymerase buffer, 8 u L dNTP mixture, 2 u L模板DNA, 2 u Lprimer 5K_F, 2 u L primer 5K_R,用去離子水補足IOOuL體系);PCR的條件為先94°C變性5min,接著進行30個循環(huán)反應(yīng)94°C變性40s,56°C退火40s,72°C延伸6min,最后在結(jié)束前在在72°C延伸5min。之后用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(博邁德公司)回收PCR片段,操作按照說明書進行。I. 3驅(qū)除片段與線性化載體連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定使用CloneEZ連接試劑盒(南京金斯瑞公司)進行I. I得到的線性化載體pKSV7與I. 2得到的PCR片段的連接反應(yīng)。方法按照試劑盒說明書進行。連接體系熱激轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細胞DH5a,之后在ImL不含抗生素的LB培養(yǎng)基中在200rpm搖床上30°C培養(yǎng)3小時;在含氨芐青霉素(100ug/mL)的LB瓊脂板上涂布,在30°C孵箱中培養(yǎng)12小時。挑取單克隆進行菌落PCR,引物為5K_F和5K_R,得到4848bp的為陽性克隆,提取陽性克隆的質(zhì)粒,用SmaI酶切,結(jié)果如圖I所示,I和2分別為質(zhì)粒酶切前和酶切后的圖,M為DNA標準,得到約6900bp和4848bp的片段為陽性質(zhì)粒,將該陽性質(zhì)粒送去測序,該陽性質(zhì)粒含有序列表中序列I所示的核苷酸,通過比對,即為炭疽桿菌質(zhì)粒pXOl (GenBank accession no. AF065404)上的一段序列,范圍包括第19072到23919位,長度為4848bp,該陽性質(zhì)粒為將序列表中的序列I插入PKSV7的SmaI酶切位點間得到的載體,將該質(zhì)粒命名為pKS5K。
2.驅(qū)除炭疽炭疽A16R中的pXOl質(zhì)粒A、轉(zhuǎn)化將I得到的質(zhì)粒PKS5K先電轉(zhuǎn)入大腸桿菌SCSllO (購自TransGen公司,電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備參照Shatalin KY, Neyfakh AA(2005)Efficient gene inactivation inBacillus anthracis. FEMS Microbiol Lett 245:315-319;)去甲基化后(將電轉(zhuǎn)化的菌株再次提取質(zhì)粒后,電轉(zhuǎn)入A16R,因為非去甲基化的質(zhì)粒進入炭疽后,將會被降解,影響質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化),再將其電轉(zhuǎn)入炭疽桿菌A16R感受態(tài)細胞中(制備參照Shatalin KY,NeyfakhAA(2005)Efficient gene inactivation in Bacillus anthracis. FEMS Microbiol Lett245 :315-319),電轉(zhuǎn)化炭疽桿菌時的電擊條件是電壓,0.6kv ;電阻,500 Q ;電容,25yF ;所用電擊儀為產(chǎn)自美國的Bio-RAD GenePulser II electroporator ;電擊杯規(guī)格為
0.1cm。B、篩選過程電轉(zhuǎn)完畢后加ImL不含抗生素的LB培養(yǎng)基,在200rpm搖床上30°C培養(yǎng)3小時;在含氯霉素(5y g/mL)的LB瓊脂平板上涂布(炭疽芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌,在 革蘭氏陽性菌中使用氯霉素進行篩選),在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時。然后對平板上長出的單克隆進行PCR鑒定,鑒定引物采用pKSV7-F/pKSV7-R(表I),得到約4900bp (AF065404第19072到23919位)的片段為陽性克隆,提取陽性克隆的質(zhì)粒送去測序,結(jié)果為該質(zhì)粒為PKS5K,將含有該質(zhì)粒的克隆命名為pKS5K/A16R。C.鑒定結(jié)果I)菌落PCR初步篩選將pKS5K/A16R接入含氯霉素(5 u g/mL)的Luria-Bertani (LB)液體培養(yǎng)基中,在30°C搖床上225rpm培養(yǎng)12小時,吸取50uL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到5mL新鮮的LB肉湯中(含氯霉素5 ii g/mL),在30°C搖床上225rpm培養(yǎng)12小時,如此轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)5次,吸取部分菌液適當(dāng)稀釋后,涂LB平板(含氯霉素5 u g/mL)。挑取單克隆進行菌落PCR,對質(zhì)粒pXOl上的特異的幾個基因(pagA, lef,cya和atxA)進行PCR檢測,以A16R作為陰性對照,以菌落為模板,pagA的特異引物pag_F、pag_R, Ief的特異引物lef_F、lef_R, cya的特異引物cya_F、cya_R,atxA的特異引物atxA_F、atxA_R分別作為引物(引物的序列見表I),結(jié)果如圖2所示,2為pKS5K/A16R,I為A16R,從圖中可以看出,A16R菌均含有質(zhì)粒pXOl上的特異的幾個基因(pagA (pag, 1627bp), Ief (2086bp), cya (1354bp)和 atxA (1202bp),而 pKS5K/A16R 菌株單菌落卻沒有陽性擴增條帶,表明PXOl質(zhì)??赡芤呀?jīng)丟失。菌落鑒定沒有擴增條帶的菌株為陽性pKS5K/A16R。傳代5次,即可篩選出陽性菌株,傳代10次,篩選率可達到91 %。2)使用另外16對引物進一步確定的結(jié)果為了進一步確認pXOl的丟失情況,提取初步篩選為陽性PKS5K/A16R的基因組DNA JfpXOl質(zhì)粒上的16個特異基因(16個特異基因比較均勻的分布在整個pXOl質(zhì)粒上)進行檢測,pX01_07的特異引物為pX01_07F和pX01_07R、pX01_13的特異引物為pX01_13F 和 pX01_13R、pX01_16 的特異引物為 pX01_16F 和 pX01_16R、pX01_23 的特異引物為 pX01_23F 和 pX01_23R、pX01_32 的特異引物為 pX01_32F 和 pX01_32R、pX01_42 的特異引物為 pX01_42F 和 pX01_42R、pX01_51 的特異引物為 pX01_51F 和 pX01_51R、pX01_59 的特異引物為 pX01_59F 和 pX01_59R、pX01_67 的特異引物為 pX01_67F 和 pX01_67R、pX01_70 的特異引物為 pX01_70F 和 pX01_70R、pX01_90 的特異引物為 pX01_90F 和 pX01_90R、pX01_95 的特異引物為 pX01_95F 和 pX01_95R、pX01_98 的特異引物 pX01_98F 和 pX01_98R、pX01_116的特異引物 pX01_116F 和 pX01_116R、pX01_133 的特異引物 pX01_133F 和 pX01_133R、pX01_142的特異引物pX01_142F和pX01_142R,引物具體序列如下表I中所示,以A16R為對照;結(jié)果如圖3A-3C所示,I為A16R,2為pKS5K/A16R,以A16R基因組DNA為模板時,16對特異引物都能擴增出特異條帶,具體如下pX01_07(1104bp,AF065404第8352到6544) ;pX01_13(787bp,AF065404 第 19002 到 15040) ;pX01_16 (742bp,AF065404 第 22188 到23897) ;pX01_23(1286bp,AF065404 第 33006 到 31621) ;pX01_32 (733bp,AF065404 第 40152到 39169) ;pX01_42(890bp, AF065404 第 53370 到 52012) ;pX01_51 (718bp, AF065404 第65012 到 66490) ;pX01_59 (783bp,AF065404 第 74068 到 75501) ;pX01_67 (1072bp, AF065404第 79684 到 81432) ;pX01_70 (757bp, AF065404 第 84298 到 85611) ;pX01_90 (1250bp,AF065404 第 106772 到 108730) ;pX01_95(1076bp, AF065404 第 113430 到 114761);pX01_98(767bp, AF065404 第 118950 到 117718) ;pX01_116 (799bp, AF065404 第 143333 到146110) ;pX01_133(981bp,AF065404 第 170713 到 169256) ;pX01_142 (1012bp,AF065404 第179399到176736)(這里的位置是閱讀框全長的位置,標示的長度為實際擴增的閱讀框中的一部分序列,引物的位置見引物列表),而當(dāng)以PKS5K/A16R的基因組DNA為模板時,16對特異引物都沒有擴增出特異條帶,這進一步確定了 PXOl確實從炭疽桿菌A16R中丟失了。3)表型鑒定因為pXOl上有編碼保護性抗原(PA)的基因,驅(qū)除了 pXOl后的菌株一定不能產(chǎn)生PA,所以通過Western Blotting來檢測PA的表達情況來進一步確認pXOl的丟失情況。pKS5K/A16R在含0. 9%碳酸氫鈉的LB瓊脂平板上劃線,在37°C,15% CO2條件下培養(yǎng)12h,從平板上刮去菌苔制成菌懸液,加上樣緩沖液(配方參見科學(xué)出版社《分子克隆實驗指南》第二版)沸水浴煮lOmin,離心,取上清,SDS-PAGE上樣,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,做WB檢測。一抗為PA抗體,二抗為IgG-HRP。醫(yī)用膠片,顯影液,定影液購自柯達公司。以A16R為對照(樣品制備方法同上所述)??贵w購自Santa Cruz公司,一抗PA抗體貨號sc-52123,二抗羊抗小鼠IgG-HRP sc-2031。結(jié)果如圖4所示,從圖中看出,顯示A16R的菌體蛋白能夠與PA抗體產(chǎn)生特異的Western雜交帶,而pKS5K/A16R的菌體蛋白與PA抗體沒有特異的Western雜交帶,這再次說明PXOl已經(jīng)從A16R中驅(qū)除。3、把不相容質(zhì)粒pKS5K從炭疽桿菌A16R中驅(qū)除的過程篩選因為構(gòu)建的外源質(zhì)粒的骨架質(zhì)粒pKSV7為溫敏性質(zhì)粒,在37°C _42°C下丟失,而37°C為炭疽桿菌的最佳生長溫度,為了避免炭疽菌在過高的溫度生長傳代,所以選擇在37°C丟外源重組質(zhì)粒。挑取去掉pXOl質(zhì)粒的pKS5K/A16R接5mL無抗性LB液體培養(yǎng)基在37°C的搖床上培養(yǎng)12h,然后按I %轉(zhuǎn)接到另一 5mL無抗性LB液體培養(yǎng)中于37°C搖床上培養(yǎng)12h,反復(fù)按I %轉(zhuǎn)接多次后,對菌液進行梯度稀釋,取10-4、10-5兩個稀釋度的菌液,涂布無抗平板。次日,挑取平板上的單克隆進行點板,每一個單克隆分別點板于LB無抗板和含氯霉素(Cm濃度為5 ii g/mL)的LB瓊脂平板,將點板后的平板置30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日,挑取在無抗性平板上生長而在Cm抗性瓊脂平板上不生長的單克隆進行菌落PCR鑒定(pKSV7P3_F 和 pKSV7P3_R,pKSV7P6_F 和 pKSV7P6_R)和 Cm 抗性試管(5 u g/mL)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)、(30°C,225rpm搖床培養(yǎng)),確定其在Cm抗性試管中不長,由此選出陽性克隆,記作pKS5K/A16R(-pKSV7)。對選出的陽性克隆pKS5K/A16R(_pKSV7)進行接種于無抗性試管培養(yǎng),然后提取它的基因組,以基因組做模板,以PKSV7P3的特異引物為pKSV7P3_F和pKSV7P3_R、pKSV7P6的特異引物為口1 ¥7 6_ 和pKSV7P6_R(pKSV7P3和pKSV7P6為pKSV7載體的特異片段),進行PCR鑒定,以pKS5K/A16R為對照,結(jié)果如圖5所示,其中,I為p KS5K/A16R,2為陽性克隆pKS5K/A16R(-pKSV7),可以看出,2陽性克隆中均未有片段擴增,I分別得到843bp pKSV7P3和535bp pKSV7P6的片段。將PCR鑒定無片段的陽性克隆命名為A16R0。該菌株A16R0為PXOl質(zhì)粒的缺失同時又不含外源質(zhì)粒的突變株。表I :實驗中使用的引物
權(quán)利要求
1.一種重組載體,為將DNA分子插入穿梭質(zhì)粒的多克隆位點得到的載體; 所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組載體,其特征在于 所述穿梭質(zhì)粒為溫敏型穿梭質(zhì)粒, 所述溫敏型穿梭質(zhì)粒具體為PKSV7。
3.權(quán)利要求I或2所述重組載體在驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl中的應(yīng)用。
4.一種驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl的方法,包括如下步驟 將權(quán)利要求I或2所述的重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌,得到重組菌;將所述重組菌傳代培養(yǎng), 至所述重組菌中的炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl被驅(qū)除,得到驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl的重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于 所述驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl方法中,在所述將權(quán)利要求I或2所述的重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌前,還包括將權(quán)利要求I或2所述重組載體去甲基化的步驟, 所述去甲基化的方法包括如下步驟 1)、將權(quán)利要求I或2所述重組載體轉(zhuǎn)入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中,得到重組菌I; 2)、提取步驟I)得到的所述重組菌I的質(zhì)粒,得到去甲基化的重組載體; 所述驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl方法中,還包括將所述驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl的重組菌去除權(quán)利要求I或2所述重組載體的步驟, 所述將驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl的重組菌去除權(quán)利要求I或2所述重組載體的方法包括如下步驟 將所述驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl的重組菌分別接種在無所述重組載體抗性篩選標記物培養(yǎng)基和含所述重組載體抗性篩選標記物的培養(yǎng)基中培養(yǎng),選取在無所述重組載體抗性篩選標記物培養(yǎng)基生長且在含所述重組載體抗性篩選標記物的培養(yǎng)基上不生長的菌,得到驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和所述重組載體的重組菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法,其特征在于 所述出發(fā)菌為炭疽桿菌(Bacillus anthracis); 所述甲基化酶缺陷的大腸桿菌為大腸桿菌SCSllO ; 所述抗性篩選標記物為氯霉素。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法,其特征在于 所述傳代培養(yǎng)的溫度為不高于30°C,所述傳代培養(yǎng)的溫度具體為30°C ; 所述將驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl的重組菌去除權(quán)利要求I或2所述重組載體的方法中,所述培養(yǎng)溫度為37°C -42°C,所述培養(yǎng)溫度具體為37°C。
8.由權(quán)利要求4-7中任一所述方法制備的驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXOl的重組菌和/或驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒PXOl和所述重組載體的重組菌。
9.權(quán)利要求I或2所述重組載體、權(quán)利要求8所述的重組菌在制備疫苗中的應(yīng)用;所述疫苗具體為炭疽疫苗。
10.一種炭疽疫苗,其活性成分為權(quán)利要求8所述的重組菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種驅(qū)除炭疽桿菌毒力大質(zhì)粒pXO1的方法。本發(fā)明提供了的重組載體,為將DNA分子插入穿梭質(zhì)粒pKSV7的SmaI位點得到的載體;所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的實驗證明,本發(fā)明根據(jù)質(zhì)粒不相容原理構(gòu)建一個不相容質(zhì)粒,特異地從炭疽桿菌A16R(pXO1+pXO2-)中驅(qū)除了毒力大質(zhì)粒pXO1,然后在37℃培養(yǎng),驅(qū)除導(dǎo)入的外源質(zhì)粒,從而獲得了一株驅(qū)除pXO1的菌株A16RO。該方法具有簡單、快速、特異性好、安全性高的特點。該方法對于構(gòu)建炭疽桿菌的質(zhì)粒缺失株,從而研究大質(zhì)粒pXO1與染色體的相互作用具有極其重要的意義,對于構(gòu)建新的疫苗株提供了新的實驗手段,為炭疽桿菌的防治提供了新的思路。
文檔編號C12N1/21GK102732544SQ201110087128
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者馮爾玲, 劉先凱, 王東澍, 王華貴, 王恒樑 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所
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