專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)土臭素的菌株及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種結(jié)合聞香手段從制曲過(guò)程中篩選白酒中微生物代謝相關(guān)的香氣物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選及運(yùn)用該方法篩選土霉味物質(zhì)土臭素(geosmin)產(chǎn)生菌的篩選鑒定及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
白酒是我國(guó)特有的一種蒸餾酒，并深得消費(fèi)者的喜愛(ài)。白酒香味成分復(fù)雜是眾所周知的，每種白酒都是由幾百種香味成分組分的集合體。而這些呈香物質(zhì)的來(lái)源，與白酒的生產(chǎn)過(guò)程是離不開(kāi)的。白酒中香味物質(zhì)的形成，不僅是微生物將淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)化而生成醇、醛、 酸、酮、酯等物質(zhì)，同時(shí)與釀制過(guò)程中的原料選擇、制曲工藝、釀酒工藝及操作過(guò)程密切相關(guān)。不同的白酒所采用的原料和輔料各有差異，而不同的原料的組分也有很大的差異，這就為白酒香味物質(zhì)提夠了豐富的前驅(qū)物。如大米中富含醇、醛、酮、酸、酯、酚、內(nèi)酯類(lèi)、乙縮醛類(lèi)、呋喃類(lèi)、吡嗪類(lèi)、噻吩、噻唑類(lèi)等化合物；玉米中富含芳香族化合物；豌豆中富含吡嗪類(lèi)化合物等。糧谷原料中的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、單寧、果膠質(zhì)及輔料中的木質(zhì)素等成分經(jīng)微生物發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物基本上都是白酒的香味成分。乳酸、乙酸和高級(jí)醇類(lèi)等來(lái)自糧谷中淀粉的降解和轉(zhuǎn)化，高級(jí)脂肪酸乙酯來(lái)源于糧谷中脂肪酸的酯化，甲醇由果膠質(zhì)酶解而得，等寸。相對(duì)于同是蒸餾酒的威士忌(whiskey)、白蘭地(brandy)和蘭姆酒(rum)而言，我國(guó)的白酒屬多菌種發(fā)酵，微生物包括大曲微生物、窖泥微生物還有空氣微生物，所以白酒的香味成分是數(shù)量眾多的霉菌、酵母菌和細(xì)菌等微生物相互作用形成的特定微生態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的結(jié)果。這就造就了白酒的香味成分不但種類(lèi)繁多，含量微少，且每種白酒中的香味成分的種類(lèi)和含量都不相同。含量微少、種類(lèi)繁多的香味物質(zhì)在每種白酒的酒體中有自己一套既復(fù)雜又微妙的香和味的關(guān)系。因此，確定每種白酒典型風(fēng)格最重要的風(fēng)味構(gòu)成組分，明確各香味組成成分在白酒釀造過(guò)程中的來(lái)源及產(chǎn)生條件，從而在源頭控制白酒中的各香氣的含量及比例，對(duì)提高白酒風(fēng)味品質(zhì)具有深遠(yuǎn)影響。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)難點(diǎn)及存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)合聞香手段，從制曲過(guò)程中篩選白酒中微生物代謝產(chǎn)生的香氣物質(zhì)的相關(guān)菌株的篩選及鑒定方法。該方法可快速有效地從白酒生產(chǎn)過(guò)程中，如制曲過(guò)程及其周?chē)h(huán)境中篩選產(chǎn)白酒中目的香氣物質(zhì)的菌株。應(yīng)用該方法，成功從清香型白酒廠(chǎng)生產(chǎn)的大曲中篩選得到四株產(chǎn)geosmin的菌株， 分別命名為L(zhǎng)BG-FXJ、FJ-HX、QC-I和QC-2，根據(jù)其菌落、細(xì)胞形態(tài)和生理生化特征以及16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果，該四菌株均為鏈霉菌(份^6·/7 0 _7 ^)，其中LBG-FXJ為白色鏈霉 lif iStreptomyces albus), FJ-HX %% 1 !]! lif iStreptomyces fradiae\ 這四菌株在土豆-葡萄糖培養(yǎng)基中均能大量積累土霉味物質(zhì)geosmin。解決了清香型白酒中土霉味物質(zhì) geosmin來(lái)源的問(wèn)題。篩選得到的四株鏈霉菌可以作為模式菌，用于白酒生產(chǎn)中產(chǎn)geosmin 菌株的檢測(cè)及其產(chǎn)生機(jī)理的研究。本發(fā)明的技術(shù)方案產(chǎn)土臭素的菌株，共四株，分別為
(1)分類(lèi)命名為白色鏈霉菌(份Wtos)LBG-FXJ，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 4206；
(2)分類(lèi)命名為弗氏鏈霉菌(份fradiaeWyWl,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 4205；
(3)分類(lèi)命名為鏈霉菌(份r印sp.) QC-I,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 4535 ；
(4)分類(lèi)命名為鏈霉菌(份r印sp.) QC-2，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 4536。所述產(chǎn)土臭素的菌株的篩選方法，結(jié)合聞香手段從制曲過(guò)程中篩選白酒中微生物代謝相關(guān)的香氣物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選方法，以風(fēng)味為導(dǎo)向，結(jié)合嗅覺(jué)感官，篩選能夠代謝白酒中相關(guān)香氣物質(zhì)的微生物；
所采取的篩菌策略為將大曲的菌懸液稀釋涂布到分離培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)4天后，挑取單菌落接入滅菌后加水量為麩皮質(zhì)量50%-150%的麩皮管中，30°C培養(yǎng)7天后，經(jīng)過(guò)2-3 個(gè)事先經(jīng)培訓(xùn)，熟知目的香氣的聞香人員聞香檢測(cè)，初步篩選從中發(fā)現(xiàn)有目的香氣的管子； 將該管中的一部分發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜-聞香儀(GC-O)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)檢測(cè)，進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，確定具有目的香氣化合物后，將該管中的微生物進(jìn)行分離，得到產(chǎn)目的香氣物質(zhì)的目的菌株；
所述產(chǎn)目的香氣物質(zhì)的目的菌株為上所述產(chǎn)土臭素的菌株；
選取麥芽汁瓊脂為分離培養(yǎng)基，選取PH為6. 0的麥芽汁瓊脂用于霉菌、酵母的篩選；選取PH為8. 0的麥芽汁瓊脂用于放線(xiàn)菌、細(xì)菌的篩選；
添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 1%的Triton-IOO到分離培養(yǎng)基中，防止菌絲擴(kuò)散，從而形成單菌落， 易于挑取。所述產(chǎn)土臭素的菌株的應(yīng)用，篩選得到的四株產(chǎn)土臭素的鏈霉菌可以作為模式菌，用于白酒生產(chǎn)中產(chǎn)geosmin菌株的檢測(cè)及其產(chǎn)生機(jī)理的研究。為了模擬制曲過(guò)程的培養(yǎng)條件，使分離到的純種菌株盡可能再現(xiàn)曲中的生長(zhǎng)狀態(tài)，制作了“固體麩皮管”。從而避免由于培養(yǎng)條件不同導(dǎo)致微生物代謝產(chǎn)物不同的因素。固體麩皮管制備50g麩皮，25-75g水，混合均勻。裝入試管中，壓實(shí)至試管約2/3處。115°C 下，滅菌15min。為確定該培養(yǎng)方式是否能夠使曲中產(chǎn)geosmin的微生物在該培養(yǎng)條件下產(chǎn) geosmin,做以下試驗(yàn)
取Ig曲粉，加到20mL無(wú)菌生理鹽水，玻璃珠打勻。將菌懸液按十倍比例逐次稀釋至不同濃度梯度。取0.5mL各梯度菌懸液至不同固體麩皮試管中，30°C靜置培養(yǎng)。菌懸液濃度較高的在5-7天出現(xiàn)該氣味，菌懸液濃度較低的在10-15天出現(xiàn)該氣味。說(shuō)明該培養(yǎng)方式能夠使產(chǎn)geosmin的微生物生長(zhǎng)并產(chǎn)生該物質(zhì)，可以作為篩選驗(yàn)證方法。同時(shí)，在篩菌過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，涂布平板后，最先長(zhǎng)出的是羽絨狀的絲狀菌，并且迅速生長(zhǎng)，覆蓋其他類(lèi)型菌落。從而不能將涂布產(chǎn)生的單菌落挑取，限制了可分離菌株的數(shù)量。 為去除霉菌蓬松的菌絲體的干擾，添加0. 1%的Triton-100，可以有效防止防止菌絲擴(kuò)散。 從而形成單菌落，易于挑取。生物材料樣品保藏
從清香型白酒廠(chǎng)生產(chǎn)的大曲中篩選得到四株產(chǎn)土臭素geosmin的菌株，分別命名為L(zhǎng)BG-FXJ、FJ-HX, QC-I和QC-2，根據(jù)其菌落、細(xì)胞形態(tài)和生理生化特征以及16S rRNA 基因序列比對(duì)結(jié)果，該四菌株均為鏈霉菌(份re/7to _F ^)，其中LBG-FXJ為白色鏈霉菌 iStreptomyces albus), FJ-HX ^Hj 1 1]! lif (Streptomyces fradiae) 在申i青日之前己送往中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，
LBG-FXJ保藏編號(hào)CGMCC No. 4206，保藏日期2010年10月8日。FJ-HX保藏編號(hào)CGMCC No. 4205，保藏日期2010年10月8日。QC-I保藏編號(hào)CGMCC No. 4535，保藏日期2011年1月11日。QC-2保藏編號(hào)CGMCC No. 4536，保藏日期2011年1月11日。


圖1麩皮中添加水的比例對(duì)微生物代謝產(chǎn)生geosmin的影響。圖2產(chǎn)geosmin菌株FXJ發(fā)酵麩皮后風(fēng)味質(zhì)譜圖。圖3四株產(chǎn)geosmin菌的菌落形態(tài)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
篩選方案確定
將大曲的菌懸液稀釋涂布到分離培養(yǎng)基(麥芽汁瓊脂)中。30°C培養(yǎng)4天后，挑取單菌落接入滅菌后加水50%-150%的麩皮管中，30°C培養(yǎng)7天后，經(jīng)過(guò)2-3個(gè)事先經(jīng)培訓(xùn)，熟知目的香氣的聞香人員聞香檢測(cè)。初步篩選從中發(fā)現(xiàn)有土霉味的管子。將該管中的一部分發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行GC-O和GC-MS檢測(cè)，進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。確定具有目的香氣化合物后，將該管中的微生物進(jìn)行分離。實(shí)施例2: 分離培養(yǎng)基的確定
由于在麥芽中各種微生物生長(zhǎng)較快，利于縮短篩菌周期。且麥芽汁易于大量制備，從而可以保證篩菌培養(yǎng)基的穩(wěn)定性。所以，選取麥芽汁瓊脂為篩菌培養(yǎng)基。選取PH為6.0的麥芽汁瓊脂用于霉菌，酵母的篩選。選取PH為8. 0的麥芽汁瓊脂用于放線(xiàn)菌，細(xì)菌的篩選。添加0. 1%的Triton-100，防止菌絲擴(kuò)散。從而形成單菌落，易于挑取。實(shí)施例3
篩選產(chǎn)geosmin菌株培養(yǎng)基確定
為了模擬制曲過(guò)程的培養(yǎng)條件，使分離到的純種菌株盡可能再現(xiàn)曲中的生長(zhǎng)狀態(tài)，制作了“固體麩皮管”。從而避免由于培養(yǎng)條件不同導(dǎo)致微生物代謝產(chǎn)物不同的因素。同時(shí)在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)發(fā)霉麩皮中會(huì)有g(shù)eosmin產(chǎn)生，所以考察了向麩皮中不同水的添加量對(duì)微生物產(chǎn)geosmin濃度的影響，從而確定最適合產(chǎn)geosmin的水添加量。由圖1可知，向麩皮添加509Γ150%的水均可以導(dǎo)致麩皮在自然條件下產(chǎn)生明顯含量的geosmin，說(shuō)明添加 50% 150%的水是適合微生物geosmin的產(chǎn)生，所以確定添加50% 150%的水到麩皮中作為篩選培養(yǎng)基。實(shí)施例4
白酒大曲中產(chǎn)geosmin菌株的篩選
運(yùn)用上述方法，從各酒廠(chǎng)生產(chǎn)的白酒大曲中，共分離到867株單菌株，將這些菌株進(jìn)行單菌種麩皮管發(fā)酵，從中發(fā)現(xiàn)5株菌發(fā)酵后具有明顯土霉氣味。利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相質(zhì)譜(HS-SPME-GC-MS)和氣相色譜-聞香儀(GC-0)，將該發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)比對(duì)土霉未知化合物與 geosmin 在 NIST 05 a. L Database (Agilent Technologies Inc.) > AMDIS、Wiley 275. L database中標(biāo)準(zhǔn)離子碎片圖譜比對(duì)，直接添加geosmin標(biāo)準(zhǔn)品離子圖譜等方法來(lái)確認(rèn)檢測(cè)土霉異味化合物。發(fā)現(xiàn)這五株菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物譜中有明顯的 geosmin峰，說(shuō)明geosmin為這五株菌的主要產(chǎn)物。這五株菌分別為清香型白酒廠(chǎng)A清茬曲中和清香型白酒廠(chǎng)B紅心大曲中各分離得到一株產(chǎn)geosmin的菌株，分別命名為FXJ和 HX。從汾酒廠(chǎng)所用的清茬大曲中分離出三株產(chǎn)geosmin的菌株，分別命名為QC-1，QC-2， QC-3。實(shí)施例5
菌落形態(tài)特征觀察
為進(jìn)一步描述所篩選得到的五株菌，在PDA培養(yǎng)基中觀察該菌的菌落形態(tài)特征，其結(jié)果如附圖3。 表1 PDA培養(yǎng)基上的五株菌的菌落形態(tài)特征
菌株菌落形態(tài)LBG-FXJ氣絲白色,表面干燥?；z地衣?tīng)?灰黃色。FJ-HX暗粉色孢子,有零星白色次生菌絲(不產(chǎn)生孢子),表面干燥?；z中央深褐色,邊緣為白色。QC-I菌落較小，菌落表面中央有小孔，多褶,氣絲白色,基絲有裂痕，中央黃色,邊緣為白色,產(chǎn)棕黃色色素，菌絲不易挑取QC-2菌落火山口狀,表面粉狀,孢子墨綠色,基絲綠色QC-3氣絲淡粉色,表面干燥?；z地衣?tīng)?乳脂色。
對(duì)各菌株的菌落形態(tài)特征描述如表1。同時(shí)，所篩選得到的鏈霉菌在固體培養(yǎng)基上形成具有一定的共性菌落特征。一般在培養(yǎng)基表面形成相互交錯(cuò)纏繞形成質(zhì)地致密的小菌落， 干燥、不透明、難以挑取，當(dāng)大量孢子覆蓋于菌落表面時(shí)，就形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線(xiàn)菌菌落，由于基內(nèi)菌絲和孢子常有顏色，使得菌落的正反面呈現(xiàn)出不同的色澤。實(shí)施例5
五株產(chǎn)geosmin菌株的分子生物學(xué)鑒定
應(yīng)用放線(xiàn)菌/鏈霉菌特異分類(lèi)鑒定引物(S-20/A-19，Com2xf/Acll86r，atpD F/atpD R， recA F/recA R)分別擴(kuò)增從白酒大曲中篩選得到的5株產(chǎn)geosmin菌株的目的基因片段， 經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)。隨后進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。綜合考慮比對(duì)結(jié)果，確定所篩選得到的微生物的種屬。表2應(yīng)用放線(xiàn)菌/鏈霉菌特異分類(lèi)鑒定引物擴(kuò)增白酒大曲中篩選得到的五株產(chǎn) geosmin菌條帶結(jié)果
權(quán)利要求
1.產(chǎn)土臭素的菌株，共四株，分別為(1)分類(lèi)命名為白色鏈霉菌(份Wto1S)LBG-FXJ，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 4206；(2)分類(lèi)命名為弗氏鏈霉菌(份fradiaeWyWl,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 4205；(3)分類(lèi)命名為鏈霉菌(份r印sp.) QC-I,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 4535 ；(4)分類(lèi)命名為鏈霉菌(份r印sp.) QC-2，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 4536。
2.權(quán)利要求1所述產(chǎn)土臭素的菌株的篩選方法，其特征在于結(jié)合聞香手段從制曲過(guò)程中篩選白酒中微生物代謝相關(guān)的香氣物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選方法，以風(fēng)味為導(dǎo)向，結(jié)合嗅覺(jué)感官，篩選能夠代謝白酒中相關(guān)香氣物質(zhì)的微生物；所采取的篩菌策略為將大曲的菌懸液稀釋涂布到分離培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)4天后，挑取單菌落接入滅菌后加水量為麩皮質(zhì)量50%-150%的麩皮管中，30°C培養(yǎng)7天后，經(jīng)過(guò)2-3 個(gè)事先經(jīng)培訓(xùn)，熟知目的香氣的聞香人員聞香檢測(cè)，初步篩選從中發(fā)現(xiàn)有相關(guān)香氣的管子； 將該管中的一部分發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行GC-O和GC-MS檢測(cè)，進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，確定具有目的香氣化合物后，將該管中的微生物進(jìn)行分離，得到產(chǎn)目的香氣物質(zhì)的目的菌株；所述產(chǎn)目的香氣物質(zhì)的目的菌株為權(quán)利要求1所述產(chǎn)土臭素的菌株；選取麥芽汁瓊脂為分離培養(yǎng)基，選取PH為6.0的麥芽汁瓊脂用于霉菌、酵母的篩選；選取PH為8. 0的麥芽汁瓊脂用于放線(xiàn)菌、細(xì)菌的篩選；添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 1%的Triton-IOO到分離培養(yǎng)基中，防止菌絲擴(kuò)散，從而形成單菌落， 易于挑取。
3.權(quán)利要求1所述產(chǎn)土臭素的菌株的應(yīng)用，其特征在于篩選得到的四株產(chǎn)土臭素的鏈霉菌用作模式菌，用于白酒生產(chǎn)中產(chǎn)geosmin菌株的檢測(cè)及其產(chǎn)生機(jī)理的研究。
全文摘要
產(chǎn)土臭素的菌株及其篩選方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)了結(jié)合聞香手段，以風(fēng)味為導(dǎo)向，從制曲過(guò)程中篩選白酒中微生物代謝產(chǎn)生的香氣物質(zhì)的相關(guān)菌株的篩選及鑒定方法。應(yīng)用該方法，成功從清香型白酒廠(chǎng)生產(chǎn)的大曲中篩選得到四株產(chǎn)土臭素geosmin的菌株，分別命名為L(zhǎng)BG-FXJ、FJ-HX、QC-1和QC-2，根據(jù)其菌落、細(xì)胞形態(tài)和生理生化特征以及16SrRNA基因序列比對(duì)結(jié)果，該四菌株均為鏈霉菌(Streptomyces)。這四菌株在土豆-葡萄糖培養(yǎng)基中均能大量積累土霉味物質(zhì)geosmin。解決了清香型白酒中土霉味物質(zhì)geosmin來(lái)源的問(wèn)題。篩選得到的四株鏈霉菌可以作為模式菌，用于白酒生產(chǎn)中產(chǎn)geosmin菌株的檢測(cè)及其產(chǎn)生機(jī)理的研究。
文檔編號(hào)C12R1/47GK102181392SQ20111008761
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者徐巖, 杜海, 范文來(lái) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)