專利名稱：預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量pcr微陣列芯片試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，屬于診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)是全球最常見的惡性腫瘤之一，在中國肝癌的發(fā)病率為腫瘤發(fā)病率的第三位，其死亡率為第二位。手術(shù)切除仍是其最主要的治療方法，但術(shù)后長期生存尚不能令人滿意。術(shù)后預(yù)后的準(zhǔn)確評估，可以使一部分病人得到及時的輔助治療， 從而延長術(shù)后生存。目前研究認(rèn)為腫瘤發(fā)生及進展是一個多因素，多步驟參與并相互作用的復(fù)雜過程，涉及癌細(xì)胞本身及其與癌周微環(huán)境和宿主免疫狀態(tài)間的相互作用，但其確切機制尚不清楚，近年來癌周微環(huán)境在腫瘤發(fā)生及進展中的作用成為腫瘤研究的熱點。目前常用的預(yù)后預(yù)測標(biāo)記包括腫瘤分期和組織病理學(xué)指標(biāo)。其中組織病理學(xué)指標(biāo)往往不能提供足夠的預(yù)后信息，而腫瘤分期，如TNM分期，雖是目前最常用的腫瘤預(yù)后標(biāo)記，但對腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測尚顯不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒， 用于對術(shù)后肝癌患者生存預(yù)后風(fēng)險進行準(zhǔn)確的預(yù)測和評估，對高風(fēng)險患者進行重點監(jiān)測和有效干預(yù)，改善患者預(yù)后。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，其特征在于，包括IL6基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針、HLA_DRA基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針、CSFl基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針、SPPl基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針以及TNF基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針。所述的IL6基因擴增引物序列正義鏈為GCGGCTACATCTTTGGAATCT、擴增引物序列反義鏈為TTCGGTCCAGTTGCCTTCTC、熒光標(biāo)記探針序列為CCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTC 所述的HLA_DRA基因擴增引物序列正義鏈為CATTTCGAAGCCACGTGACA、 擴增引物序列反義鏈為CACAAACAGCCCTGTGGAAC、熒光標(biāo)記探針序列為 TGAGAGAGCCCAACGTCCTCATCTG。所述的CSFl基因擴增引物序列正義鏈為CGAGGAGGTGTCGGAGTACTGT、擴增引物序列反義鏈為TTGGCACGAGGTCTCCATCT、熒光標(biāo)記探針序列為CCACATGATTGGGAGTGGACACCT。所述的SPPl基因擴增引物序列正義鏈為TCGCAGACCTGACATCCAGT、擴增引物序列反義鏈為GGCCTTGTATGCACCATTCA、熒光標(biāo)記探針序列為TGCTACAGACGAGGACATCACCTCAC。
所述的TNF基因擴增弓丨物序列正義鏈為GCTCCGTGTCTCAAGGAAGTCT、擴增弓丨物序列反義鏈為GCCAGAATGCTGCAGGACT、熒光標(biāo)記探針序列為CAGAATGCTGCAGGACTTGA。
優(yōu)選地，所述的預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒中還包括反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、擴增系統(tǒng)和384微孔板組成。所述的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由5X反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、脫氧核糖核酸混合物以及隨機的6核苷酸引物組成。所述的擴增系統(tǒng)由含Taq酶的信使核糖核酸表達定量檢測混合液組成。本發(fā)明的優(yōu)點為
1、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 IL6基因、HLA_DRA基因、CSFl基因、SPPl基因以及TNF基因可以作為標(biāo)志物來預(yù)測肝癌術(shù)后生存率，并提供了一個預(yù)測模型，經(jīng)過大樣本量獨立驗證，證明該預(yù)測模型可對肝癌患者轉(zhuǎn)移潛能進行準(zhǔn)確的預(yù)測和評估，從而可對患者術(shù)后生存進行準(zhǔn)確的預(yù)測，將有助于早期識別或預(yù)測高?；颊?，對其進行重點檢測和有效干預(yù)，為臨床個體化干預(yù)治療提供有效的依據(jù)。2、本發(fā)明提供了相應(yīng)的試劑盒及熒光標(biāo)記探針和引物，通過實時定量PCR微陣列芯片技術(shù)對原發(fā)性肝癌病人術(shù)后的組織mRNA水平的檢測，具有高通量、高敏感性和高均一性等特征。相對于芯片技術(shù)或者分子雜交(Northern Blot)，該方法簡便、快速且經(jīng)濟實用。


圖1為肝癌轉(zhuǎn)移預(yù)測模型對380例行根治性切除術(shù)的肝癌患者無瘤生存預(yù)測分析結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和附圖來具體說明本發(fā)明。 實施例1、一種預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，由以下試劑組成
(1)反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由5X反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、脫氧核糖核酸混合物以及隨機的6核苷酸引物組成。所用試劑組分來源于I^rimeScript RT reagent kit perfect Real time反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司生產(chǎn)，型號DDR037A)；
(2)擴增系統(tǒng)由含Taq酶的信使核糖核酸(mRNA)表達定量檢測混合液(Applied Biosystems 公司生產(chǎn)，型號TaqMan Gene expression Master mix 4369016)組成；
(3)384微孔板；
(4 ) IL6基因、HLA_DRA基因、CSF1基因、SPP1基因以及TNF基因的擴增引物和Taqman 熒光標(biāo)記探針混合液，溶劑為DEPC (焦碳酸二乙酯)處理過的水，引物和探針的具體序列如下
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，其特征在于，包括IL6基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針、HLA_DRA基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針、CSFl基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針、SPPl基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針以及TNF基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針。
2.如權(quán)利要求1所述的預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，其特征在于，所述的IL6基因擴增引物序列正義鏈為GCGGCTACATCTTTGGAATCT、擴增引物序列反義鏈為TTCGGTCCAGTTGCCTTCTC、熒光標(biāo)記探針序列為CCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTC
3.如權(quán)利要求1所述的預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，其特征在于，所述的HLA_DRA基因擴增引物序列正義鏈為CATTTCGAAGCCACGTGACA、擴增引物序列反義鏈為CACAAACAGCCCTGTGGAAC、熒光標(biāo)記探針序列為TGAGAGAGCCCAACGTCCTCATCTG。
4.如權(quán)利要求1所述的預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，其特征在于，所述的CSFl基因擴增引物序列正義鏈為CGAGGAGGTGTCGGAGTACTGT、擴增引物序列反義鏈為TTGGCACGAGGTCTCCATCT、熒光標(biāo)記探針序列為CCACATGATTGGGAGTGGACACCT。
5.如權(quán)利要求1所述的預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，其特征在于，所述的SPPl基因擴增引物序列正義鏈為TCGCAGACCTGACATCCAGT、擴增引物序列反義鏈為GGCCTTGTATGCACCATTCA、熒光標(biāo)記探針序列為TGCTACAGACGAGGACATCACCTCAC。
6.如權(quán)利要求1所述的預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，其特征在于，所述的TNF基因擴增引物序列正義鏈為GCTCCGTGTCTCAAGGAAGTCT、擴增引物序列反義鏈為GCCAGAATGCTGCAGGACT、熒光標(biāo)記探針序列為CAGAATGCTGCAGGACTTGA。
7.如權(quán)利要求1所述的預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，其特征在于，還包括反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、擴增系統(tǒng)和384微孔板組成。
8.如權(quán)利要求7所述的預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，其特征在于，所述的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由5X反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、脫氧核糖核酸混合物以及隨機的6核苷酸引物組成。
9.如權(quán)利要求7所述的預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，其特征在于，所述的擴增系統(tǒng)由含Taq酶的信使核糖核酸表達定量檢測混合液組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)測肝癌術(shù)后生存的實時定量PCR微陣列芯片試劑盒，其特征在于，包括IL6基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針、HLA_DRA基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針、CSF1基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針、SPP1基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針以及TNF基因擴增引物及熒光標(biāo)記探針。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了IL6基因、HLA_DRA基因、CSF1基因、SPP1基因以及TNF基因可以作為標(biāo)志物來預(yù)測肝癌術(shù)后生存率，并提供了相應(yīng)的試劑盒，通過實時定量PCR微陣列芯片技術(shù)對原發(fā)性肝癌病人術(shù)后的組織mRNA水平的檢測，具有高通量、高敏感性和高均一性等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102191323SQ20111009107
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者葉青海, 周海君, 周闖, 張曉飛, 王冠, 董瓊珠, 賈戶亮, 鄭燕, 欽倫秀 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院