專利名稱：乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒、檢測方法、引物及其探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒 及其檢測方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(h印atitis B virus,乙型肝炎病毒)屬嗜肝DNA病毒科 (hepadnaviridae)，基因組長約3. 2kb,為部分雙鏈環(huán)狀DNA。乙型肝炎病毒復(fù)制的特點(diǎn)是 肝細(xì)胞核內(nèi)有穩(wěn)定的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)存在；有一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄步驟。乙型肝炎病毒 基因組中已確定的開放讀框有4個(gè)，分別編碼病毒的核殼(C)和包膜( 蛋白，病毒復(fù)制酶 (聚合酶)及一種似乎與病毒基因表達(dá)有關(guān)的蛋白質(zhì)X。乙型肝炎病毒是目前發(fā)現(xiàn)最小的 DNA病毒。乙型肝炎病毒是急慢性病毒性肝炎的主要致病因素，感染后可導(dǎo)致不同程度的肝 臟損傷。由于乙肝病毒具有傳染性強(qiáng)、傳播途徑復(fù)雜、感染過程多樣化、流行面廣泛、發(fā)病率 高、治療困難等特點(diǎn)，多為無黃疸性且許多人為無癥狀的乙肝病毒攜帶者，不易被人重視， 人體感染后常可導(dǎo)致急、慢性乙型病毒性肝炎，長期的慢性感染可發(fā)展成肝硬化、甚至肝細(xì) 胞癌，是一種潛在的嚴(yán)重威協(xié)人類健康的傳染病。因此要求對乙型肝炎病毒感染盡快針對 不同病情給以恰當(dāng)?shù)闹委煛ｋS著科技的進(jìn)步，各種各樣新的檢測方法都應(yīng)用到致病菌的檢 測。現(xiàn)有技術(shù)中乙型肝炎病毒的快速檢測方法如下1、電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)有常規(guī)電鏡法和免疫電鏡法?？捎秒娮语@微鏡直接觀察到乙型肝 炎病毒顆?；蚵愿窝谆颊叩母谓M織。免疫電鏡還可觀察到肝細(xì)胞胞漿和胞核中的HBcAg 和HBeAg，常規(guī)電鏡法樣品用量小、制樣速度快、觀察比較直觀，但觀察靈敏度較低，要求樣 品的病毒量大[10]。而免疫電鏡法較常規(guī)電鏡法的敏感性高，但樣品制備過程較復(fù)雜，對操 作者的技能要求較高。2、免疫學(xué)技術(shù)免疫學(xué)檢測方法主要是檢測乙型肝炎病毒感染過程中產(chǎn)生的抗原抗體免疫標(biāo)志 物。常規(guī)的乙型肝炎病毒免疫標(biāo)志物的血清學(xué)檢查為五項(xiàng)即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb 和HBcAb。免疫學(xué)檢測法主要有酶免疫法(EIA)、固相放射免疫法(SPRIA)及微粒子酶免法 (MEIA)。EIA最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，是將特異性抗原或抗體吸附于 固相載體上，使其與待測樣品中的相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，然后加酶標(biāo)記的抗原或抗體，再加 底物顯色，最后根據(jù)色澤深淺推算待測抗原或抗體的含量。ELISA特異性強(qiáng)。但ELISA檢測 HBsiVg為陰性的樣品也可能乙型肝炎病毒DNA為陽性。SraiA法是利用放射性同位素標(biāo)記已 知的抗原或抗體。該方法靈敏度高，但由于同位素穩(wěn)定性差、對環(huán)境造成污染等原因并不常 用。MEIA是近年來發(fā)展起來的一種新的抗原抗體檢測技術(shù)，采用最新的熒光技術(shù)，通過測定熒光強(qiáng)度來檢測被測物的濃度，但如果被測物抗體呈弱陽性時(shí)，則不能輕易診斷出待測物。3、基因芯片(又稱DNA芯片)基因芯片技術(shù)(gene chips)又稱DNA芯片(DNA chips)或生物芯片(biological chips)。其原理是將大量特定的寡核苷酸或基因片段作為探針，有規(guī)律地和高密度地排列， 固定在一塊很小的支持物如硅片、玻片等，然后與待檢的熒光標(biāo)記樣品核酸按堿基配對原 則雜交，經(jīng)洗滌后通過激光共聚焦熒光系統(tǒng)檢測雜交信號強(qiáng)度，再經(jīng)計(jì)算機(jī)分析處理數(shù)據(jù) 從而獲取樣品的生物信息。將特異探針固定在載玻片上，在PCR擴(kuò)增乙型肝炎病毒分型區(qū) 域時(shí)，應(yīng)用熒光標(biāo)記的dNRP使PCR產(chǎn)物帶有熒光，通過將PCR產(chǎn)物與乙型肝炎病毒芯片雜 交后某型處的雜交點(diǎn)出現(xiàn)熒光而確定。可用于乙型肝炎病毒的基因變異、基因分型的檢測。該技術(shù)具有自動化程度高、靈 敏度高、檢測目的分子量少、效率高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在成本高、假陽性率偏高、重復(fù)性差等缺 陷。4、分子生物學(xué)方法錯(cuò)誤！未找到引用源。核酸探針法帶有標(biāo)記物的DNA或RNA片段即核酸探針能與互補(bǔ)的核酸序列特異結(jié)合。核酸探 針的標(biāo)記可用核素P32、S35、1131等，以及非放射性物質(zhì)如生物素、地高辛等。乙型肝炎病 毒的核酸探針有DNA探針和RNA探針兩種。核酸探針法的主要特點(diǎn)是敏感性、特異性都較 強(qiáng)。錯(cuò)誤！未找到引用源。普通PCR法PCR法通過兩段特異性寡核甘酸引物，在體外經(jīng)DNA聚合酶催化，擴(kuò)增與兩引物互 補(bǔ)的DNA序列之間的區(qū)段，檢測樣品中是否有該序列。PCR較血清學(xué)方法更敏感，但特異性 和重復(fù)性較低，若結(jié)合斑點(diǎn)雜交、微孔板雜交、濾膜核酸探針雜交等核酸雜交方法和酶聯(lián)免 疫等方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，靈敏度和特異性均可大大提高。隨著現(xiàn)代核酸技術(shù)的發(fā)展，建立在基因水平上的核酸擴(kuò)增技術(shù)-PCR及相關(guān)技術(shù)， 由于其高敏感性和高特異性，在乙型肝炎病毒的臨床檢測中得到廣泛應(yīng)用，成為實(shí)驗(yàn)室診 斷的主要方法。這些以PCR為基礎(chǔ)的檢測方法，都需要花費(fèi)時(shí)間對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后處 理，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中高濃度的目標(biāo)DNA分子會以氣溶膠的形式污染整個(gè)實(shí)驗(yàn)空間，由于PCR 的高度靈敏性，甚至可以檢測出反應(yīng)體系中10個(gè)拷貝的模板濃度，從而可能給今后的PCR 實(shí)驗(yàn)帶來嚴(yán)重的假陽性；常規(guī)PCR方法是終點(diǎn)檢測法，由于PCR反應(yīng)具有平臺期，無法依據(jù) 終產(chǎn)物對起始模板進(jìn)行精確定量檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種克服PCR擴(kuò)增產(chǎn)物終 點(diǎn)檢測所存在的“平臺效應(yīng)”對產(chǎn)物定量的影響，具有高度的特異性、靈敏度與準(zhǔn)確性，且技 術(shù)操作簡便、自動化程度高的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種乙型肝炎病毒核酸定量檢測試 劑盒，該試劑盒含有(I)PCR反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、具有5，一3，外切活性的DNA聚合酶、 dNTPsUOXPCR Buffer、含有Mg2+離子的溶液、乙型肝炎病毒正向引物、乙型肝炎病毒反向引物、乙型肝炎病毒探針；乙型肝炎病毒正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示5 ‘ -TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3‘；乙型肝炎病毒反向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示5 ‘ -TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3‘；乙型肝炎病毒探針序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示 5 ‘ -CTGCGGCGTTTTAT-3‘；所述探針5'端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ或Eclipse熒光淬滅基團(tuán)；(2)溶液A，為聚乙二醇6000 ；(3)溶液B，其中包括EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基硫酸鈉)、Tris_HCl、 NP-40(乙基苯基聚乙二醇)；(4)陰性質(zhì)控品，為不含乙型肝炎病毒Pre-S基因的pUCm_T載體質(zhì)粒DNA片段；(5)陽性質(zhì)控品，為1. OX 106COpy/mL含乙型肝炎病毒基因組DNA片段；(6)臨界陽性質(zhì)控品，為1. OX 104COpy/mL含乙型肝炎病毒基因組DNA片段；(7)工作標(biāo)準(zhǔn)品，為含有乙型肝炎病毒的高度保守基因-Pre-S基因的71個(gè)堿基對 的核苷酸片段的PUCm-T重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒在大腸桿菌DH5 α中增殖；具體包括a、工作標(biāo)準(zhǔn)品1，含有約1. OX 107COpy/mL的乙型肝炎病毒I^re-S基因的非傳染性 DNA片段；b、工作標(biāo)準(zhǔn)品2，含有約1. OX 106COpy/mL的乙型肝炎病毒I^re-S基因的非傳染性 DNA片段；C、工作標(biāo)準(zhǔn)品3，含有約1. OX 105COpy/mL的乙型肝炎病毒I^re-S基因的非傳染性 DNA片段；d、工作標(biāo)準(zhǔn)品4，含有約1. OX 104COpy/mL的乙型肝炎病毒I^re-S基因的非傳染性 DNA片段。所述具有5，一 3，外切活性的DNA聚合酶為Taq酶。所述PCR反應(yīng)液各組分含量的配比為DEPC處理水用量27. 5 μ L ；濃度為5U/ μ L 的熱啟動Taq酶用量0. 3 μ L ；濃度為10mmol/L的dNIPs用量1 μ L ;10XPCR Buffer用量 5μ L ；濃度為25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L、濃度為lOymol/L的乙型肝炎病毒正向引 物用量1.6yL、濃度為10 μ mol/L的乙型肝炎病毒反向引物用量1.6yL、濃度為IOymol/ L的乙型肝炎病毒探針用量1 μ L0所述聚乙二醇6000的濃度為15% ；所述SDS濃度為0. 5% ；所述1Tris-HCl的ρΗ 值為8. 0 ；所述乙基苯基聚乙二醇的濃度為0. 1%。本發(fā)明實(shí)施例還提供利用所述的試劑盒檢測乙型肝炎病毒核酸的檢測方法，包括 下列步驟(1)采集樣品采集人血漿樣品，離心分離，上清即為血清樣品；(2)樣品處理取待測血清100 μ L，加入等量15%溶液Α，混勻，13000rpm離心 lOmin，去上清，加入50 μ L裂解溶液B，充分混勻后，在100°C加熱lOmin，再次13000rpm離 心lOmin，取上清液待測；(3)加樣向裝有45 μ L PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的樣品，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，臨界陽性質(zhì)控品，工作標(biāo)準(zhǔn)品5 μ L，蓋好管蓋，5，OOOrpm離心10秒；G)PCR擴(kuò)增將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標(biāo)記熒光基團(tuán) 種類、樣品名稱及類型，按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增；94 "C 5 分鐘；94 °C 30 秒、58 °C 45 秒，5 個(gè)循環(huán)；94°C 30秒、58°C 45秒，35個(gè)循環(huán)，收集熒光信號，在反應(yīng)程序的第三步的終了讀取 熒光值；(5)分析判斷Ct值小于觀的為陽性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于等于觀 且小于等于32的為臨界陽性。進(jìn)一步地，當(dāng)需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，另取4個(gè)反應(yīng)管，直接加入不同濃度梯度的工 作標(biāo)準(zhǔn)品5 μ L，5，OOOrpm離心10秒，放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。本發(fā)明還提供一種乙型肝炎病毒核酸定量檢測引物和探針，包括如下序列組包括下述正向引物，反向引物和熒光探針的一組序列正向引物如序列表中SEQ IDN0. 1 所示5' -TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3‘，反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 所示5' -TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3 ‘，熒光探針如序列表中SEQ ID NO. 3 所示5' -CTGCGGCGTTTTAT-3 ‘；或者在上述序列的5’端和/或3’端有延長的核苷酸片段的一組序列；或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列；或者與上述序列的堿基互補(bǔ)的一組序列；上述的任意一組序列可單獨(dú)使用，或以所有序列組之間的任意組合形式而使用；其中，所述熒光探針的5’端和3’端分別用熒光染料修飾。其中熒光探針的，5，端修飾的熒光染料可選自FAM，HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3 或 Cy5 ；3’ 端修飾的熒光染料可選自TAMRA、Eclipse, BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL。本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是本發(fā)明試劑盒利用特異性的 TaqMan探針來檢測乙型肝炎病毒，檢測完成后無需開蓋電泳，避免了產(chǎn)物污染及對實(shí)驗(yàn)室 人員的傷害。本發(fā)明可用LNA探針，MGB探針，AUGlo 探針來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)檢測克服了擴(kuò) 增產(chǎn)物終點(diǎn)檢測所存在的“平臺效應(yīng)”對產(chǎn)物定量的影響，它具有高度的特異性、靈敏度與 準(zhǔn)確性，且技術(shù)操作簡便、自動化程度高，由于采用閉管操作，不需要PCR產(chǎn)物后處理，有效 解決PCR污染問題等特點(diǎn)，結(jié)果可靠。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例ι中提供的實(shí)S金結(jié)果圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中提供的實(shí)S金結(jié)果圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中提供的實(shí)S金結(jié)果圖4是本發(fā)明實(shí)施例4中提供的實(shí)S金結(jié)果圖5是本發(fā)明實(shí)施例5中提供的實(shí)S金結(jié)果圖6是本發(fā)明實(shí)施例5中提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖中圖1、圖2、圖3、圖4和圖5的橫坐標(biāo)表示表示循環(huán)數(shù)(Cycle number)，縱 坐標(biāo)表示熒光值(Delta Rn)；圖6的橫坐標(biāo)表示LogC(乙肝病毒起始濃度的對數(shù)值)，縱坐標(biāo)表示Ct值。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實(shí)施方 式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。本發(fā)明提供了一種乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒，該試劑盒含有PCR反應(yīng) 液，其中包括DEPC處理水、Taq酶、dNTPsUOXPCR Buffer、含有Mg2+離子的溶液、乙型肝 炎病毒正向引物、乙型肝炎病毒反向引物、乙型肝炎病毒探針；溶液A，為聚乙二醇6000 ； 溶液B，其中包括EDTA、SDS、Tris-HCl、NP-40 ；陰性質(zhì)控品，為不含乙型肝炎病毒I^re-S基 因的質(zhì)粒DNA片段；陽性質(zhì)控品，為高濃度乙型肝炎病毒基因組DNA片段；臨界陽性質(zhì)控 品，為低濃度乙型肝炎病毒基因DNA片段；工作標(biāo)準(zhǔn)品，為含有乙型肝炎病毒的高度保守基 因-Pre-S基因的71個(gè)堿基對的核苷酸片段的pUCm-T重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒在大腸桿菌DH5 α 中增殖；試劑盒的制造1.試劑本試劑盒制造過程中所用的試劑主要購自寶生物工程(大連)有限公司。2. PCR反應(yīng)液制備(1)引物及探針設(shè)計(jì)與合成選擇乙型肝炎病毒特異性保守基因Pre-S基因作為目標(biāo)檢測基因，通過美國國家 生物技術(shù)信息中心(NCBI) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)，獲得乙型肝炎病毒目前已有 的8個(gè)基因型的乙型肝炎病毒Pre-S基因序列，并在www. ebi. ac. uk/在線分別對8個(gè)基因 型的Pre-S基因序列進(jìn)行序列比對，在基因區(qū)選擇一段保守序列，序列如序列表中SEQ ID NO. 4 所示TTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGC CTCA，利用實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR的專業(yè)設(shè)計(jì)軟件BeaconDesigner 7. 0設(shè)計(jì)引物、探 針序列，引物、探針序列不僅要滿足軟件中各項(xiàng)指標(biāo)，而且要確保乙型肝炎病毒引物、探針 序列能檢測全部8個(gè)基因型序列。在本發(fā)明中，乙型肝炎病毒探針的5’端修飾的熒光染 料可選自FAM，HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3或Cy5 ；3，端修飾的熒光染料可選自TAMRA、 Eclipse, BHQ1,BHQ2, BHQ3或DABCYL。本實(shí)施例中熒光報(bào)告基團(tuán)設(shè)計(jì)為FAM，F(xiàn)AM的激發(fā)波 長為485nm，接收波長為527nm，淬滅集團(tuán)設(shè)計(jì)為Eclipse。設(shè)計(jì)結(jié)果如下表所示
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有(I)PCR反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、具有5，一 3，外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、 lOXPCRBuffer、含有Mg2+離子的溶液、乙型肝炎病毒正向引物、乙型肝炎病毒反向引物、乙 型肝炎病毒探針；乙型肝炎病毒正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示 5 ‘ -TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3‘，乙型肝炎病毒反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示 5' -TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3‘，乙型肝炎病毒探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示5' -CTGCGGCGTTTTAT-3‘； 其中，所述熒光探針的5’端和3’端分別用熒光基團(tuán)修飾；所述引物序列中，Y = (C/T)；O) DNA提取液；(3)陰性質(zhì)控品，為不含乙型肝炎病毒Pre-S基因的pUCm-T載體質(zhì)粒DNA片段；(4)陽性質(zhì)控品，為1.0X106COpy/mL含乙型肝炎病毒基因組DNA片段；(5)臨界陽性質(zhì)控品，為1.0X104COpy/mL含乙型肝炎病毒基因組DNA片段；(6)工作標(biāo)準(zhǔn)品，為含有乙型肝炎病毒的高度保守基因-Pre-S基因的71個(gè)堿基對的核 苷酸片段的PUCm-T重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒在大腸桿菌DH5 α中增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，其中熒光 探針的5，端修飾的熒光染料選自:FAM, HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3或Cy5 ；3，端修飾的熒 光染料選自TAMRA、Eclipse，BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA提 取液由溶液A和溶液B組成；所述溶液A，為聚乙二醇6000;所述溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述工作 標(biāo)準(zhǔn)品包括a、工作標(biāo)準(zhǔn)品1，含有1. OX 107COpy/mL的乙型肝炎?。籦、工作標(biāo)準(zhǔn)品2，含有1. OX 106COpy/mL的乙型肝炎病; C、工作標(biāo)準(zhǔn)品3，含有1. OX 105COpy/mL的乙型肝炎病; d、工作標(biāo)準(zhǔn)品4，含有1. OX 104COpy/mL的乙型肝炎病;Pre-S基因的非傳染性DNA片 Pre-S基因的非傳染性DNA片 Pre-S基因的非傳染性DNA片 Pre-S基因的非傳染性DNA片段 段 段 段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述具有 5，一 3，外切活性的DNA聚合酶為Taq酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液各組分含量的配比為DEPC處理水用量27. 5 μ L ；濃度為5U/ μ L的熱 啟動 Taq 酶用量 0. 3 μ L ；濃度為 IOmmol/L 的 dNTPs 用量 1 μ L ； 10 XPCR Buffer 用量 5 μ L ；濃度為25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L、濃度為ΙΟμπιοΙ/L的乙型肝炎病毒正向引物用量 1.6μ L、濃度為10 μ mol/L的乙型肝炎病毒反向引物用量1. 6 μ L、濃度為10 μ mol/L的乙型 肝炎病毒探針用量1 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述聚乙二醇6000的濃度為15% ；所述SDS濃度為0. 5% ；所述Tris-HCl的ρΗ值為 8. 0 ；所述乙基苯基聚乙二醇的濃度為0. 1%。
8.一種利用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測乙型肝炎病毒核酸的檢測方法，其 特征在于，包括下列步驟(1)采集樣品采集人血漿樣品，離心分離，上清即為血清樣品；(2)樣品處理取待測血清100μ L，加入等量15%溶液Α，混勻，13000rpm離心IOmin, 去上清，加入50 μ L裂解溶液B，充分混勻后，在100°C加熱lOmin，13000rpm再離心IOmin, 取上清液待測；(3)加樣向裝有45μ L PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的樣品，陰性質(zhì)控 品，陽性質(zhì)控品，臨界陽性質(zhì)控品，工作標(biāo)準(zhǔn)品各5 μ L，蓋好管蓋，5，OOOrpm離心10秒；(4)PCR擴(kuò)增將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標(biāo)記熒光基團(tuán)種類、 樣品名稱及類型，按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增；94 0C 5分鐘；94 0C 30 秒、58°C 45 秒，5 個(gè)循環(huán)；94°C 30秒、58°C 45秒，35個(gè)循環(huán)，收集熒光信號，在反應(yīng)程序的第三步的終了讀取熒光值；(5)分析判斷Ct值小于觀的為陽性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于或等于觀且 小于或等于32的為臨界陽性。
9.一種乙型肝炎病毒核酸定量檢測引物和探針，包括如下的序列組 包括下述正向引物，反向引物和熒光探針的一組序列正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 1 所示5' -TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3‘， 反向引物如序列表中 SEQ ID N0. 2 所示5' -TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3‘， 熒光探針如序列表中SEQ ID N0. 3所示5' -CTGCGGCGTTTTAT-3‘； 或者在上述序列的5’端和/或3’端有延長的核苷酸片段的一組序列； 或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列； 或者與上述序列的堿基互補(bǔ)的一組序列；上述的任意一組序列可單獨(dú)使用，或以所有序列組之間的任意組合形式而使用； 其中，所述熒光探針的5’端和3’端分別用熒光基團(tuán)修飾；所述引物序列中Y = (C/T)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的乙型肝炎病毒核酸定量檢測引物和探針，其特征在于，其中 熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自FAM，HEX, ΤΕΤ, JOE, VIC, ROX, Cy3或Cy5 ；3，端修飾 的熒光染料選自TAMRA、Eclipse，BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒、檢測方法、引物及其探針，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法涉及一種引起人類各種急慢性及重型肝炎的病毒基因檢測技術(shù)，適用于乙型肝炎病毒定性定量檢測。本試劑盒包括PCR反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、Taq酶、dNTPs、10×PCR Buffer、含有Mg2+離子的溶液、乙型肝炎病毒正向引物5′-TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3′、乙型肝炎病毒反向引物5′-TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3′、乙型肝炎病毒探針5′-CTGCGGCGTTTTAT-3′；試劑盒中還包括DNA提取液、陰性質(zhì)控品、工作標(biāo)準(zhǔn)品、陽性質(zhì)控品和臨界陽性質(zhì)控品。本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測乙型肝炎病毒核酸，具有特異、靈敏、快速、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/11GK102146487SQ20111009116
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者嚴(yán)曉峰, 唐景峰, 柳小英, 王業(yè)富, 白旭 申請人:武漢百泰基因工程有限公司