專利名稱：一種高產(chǎn)乳酸的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)乳酸工程菌及其構(gòu)建方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)乳酸工程菌的應(yīng)用，特別是發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
作為一種重要的平臺(tái)化合物，L-乳酸的需求隨著石油資源的逐漸枯竭而不斷增加。在目前的L-乳酸合成工藝中，以生物質(zhì)為原料采用微生物發(fā)酵(乳酸菌和霉菌)的工藝具有廣泛的應(yīng)用。然而由于乳酸菌營(yíng)養(yǎng)需求高和難以耐受惡劣環(huán)境脅迫，以及霉菌易形成菌絲團(tuán)和副產(chǎn)物較多等原因，限制了 L-乳酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，釀酒酵母作為單細(xì)胞生物，能利用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基進(jìn)行快速生長(zhǎng)使其為工業(yè)化生產(chǎn)所青睞。通過整合表達(dá)乳酸脫氫酶(Idh)于Mccharomy cescerevisiae中可以使L-乳酸得到積累，但副產(chǎn)物乙醇的含量還是很高，為此需要借助基因工程策略，通過游離表達(dá)的方式，將源于Sti^ptococcus pneumoniae的NADH氧化酶(nox)表達(dá)于整合了 Idh的工程菌中，在沒有進(jìn)一步敲除PDC5 和增加Idh拷貝數(shù)的情況下，通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH/NAD+的水平，實(shí)現(xiàn)碳代謝流的重新分配， 促進(jìn)目的產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的積累并大幅度降低副產(chǎn)物乙醇的積累量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH/NAD+的水平，實(shí)現(xiàn)碳代謝流的
重新分配，提供一種高產(chǎn)乳酸低產(chǎn)乙醇工程菌。所述工程菌過量表達(dá)源于Sti^ptococcus pneumoniae的NADH氧化酶基因nox。 通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH/NAD+的水平，實(shí)現(xiàn)了碳代謝流的重新分配，促進(jìn)L-乳酸的積累并大幅度降低副產(chǎn)物乙醇的積累量。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種上述產(chǎn)乳酸工程菌的構(gòu)建方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為1)分別提取含nox基因的質(zhì)粒和含Idh基因的質(zhì)粒。對(duì)兩質(zhì)粒雙酶切、回收、純化，連接。2)將步驟1)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布帶有氨芐抗性的LB平板， 挑取轉(zhuǎn)化子。3)提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。4)將構(gòu)建好的質(zhì)粒由LiAc法轉(zhuǎn)化導(dǎo)入受體菌中，涂布Trp缺陷平板。5)驗(yàn)證所述工程菌。6)胞內(nèi) NADH/NAD+ 的測(cè)定。7) NADH氧化酶的測(cè)定。步驟4)中所述受體菌為整合了 Idh基因的酵母工程菌。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種所述高產(chǎn)乳酸低產(chǎn)乙醇工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳酸中的應(yīng)用。
發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的工藝為30°C、200r/min搖瓶培養(yǎng)所述工程菌至對(duì)數(shù)中期，以8% 接種量接種入發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)100小時(shí)；發(fā)酵參數(shù)為pH 5. 5，通氣量1. 5L/min，溶氧 50%。本發(fā)明通過游離表達(dá)的方法，獲得一株高產(chǎn)乳酸低產(chǎn)乙醇的工程菌。本發(fā)明提供的工程菌生產(chǎn)乳酸工藝簡(jiǎn)單易行，發(fā)酵IOOh后，目的產(chǎn)物L(fēng)-乳酸積累量達(dá)到20g/L，而副產(chǎn)物乙醇濃度降為8. 2g/L。


圖1 :pY14MET25-nox質(zhì)粒圖譜和nox酶切驗(yàn)證
A :pY14MET25-nox 質(zhì)粒圖譜
B :nox酶切驗(yàn)證
Marker =Ikb marker 1-2 未酶切質(zhì)粒對(duì)照3_4 酶切后的質(zhì)粒
圖2 :nox過量表達(dá)對(duì)S. cerevisiae生理代謝的影響
A :nox表達(dá)前后NADH/NAD+的值對(duì)比
B :nox表達(dá)前后NADH氧化酶活性對(duì)比
C :nox表達(dá)前后L-乳酸積累量曲線對(duì)比
D :nox表達(dá)前后乙醇積累量曲線對(duì)比
圖3 代謝工程策略對(duì)碳代謝流分配的影響
B 整合了 Idh的工程菌碳流分配
C :nox過量表達(dá)后工程菌碳流分配
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實(shí)施例用于說明發(fā)明目的而非用于限制本發(fā)明范圍。下列實(shí)施例中有未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，基本上是按照常見的分子克隆手冊(cè)所述的條件進(jìn)行操作。實(shí)施例1高產(chǎn)乳酸低產(chǎn)乙醇工程菌的構(gòu)建1、構(gòu)建帶有l(wèi)dh-nox基因的質(zhì)粒提取質(zhì)粒ρ (212-ηοχ和ρΥ14ΜΕΤ25。用BamHI和Mil酶對(duì)兩質(zhì)粒雙酶切(圖 1A)、回收、純化，連接(16°C過夜)。2、將步驟1)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中后，涂布帶有氨芐抗性的LB平板，經(jīng)37°C 過夜培養(yǎng)。3、提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)均為陽性克隆。表明pY13MET25-nOX (圖1B) 已構(gòu)建成功。4、將構(gòu)建好的質(zhì)粒由LiAc法轉(zhuǎn)化導(dǎo)入受體菌中，涂布Trp缺陷平板。長(zhǎng)出菌落后傳代3次以上。5、驗(yàn)證所述工程菌。挑取適量轉(zhuǎn)化子接種于種子培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，得到所需菌株CEN.PK2-1C[LDH]-nox。 實(shí)施例2胞內(nèi)NADH/NAD+的測(cè)定和NADH氧化酶的測(cè)定1、胞內(nèi) NADH/NAD+ 的測(cè)定取30mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞發(fā)酵液，于10000rpm、4°C下離心lOmin，去除上清液，并迅速置于液氮中以阻斷微生物代謝，取出置于-20°C保存?zhèn)溆?。核苷酸的提取按照Manley的處理方法。采用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定，色譜分析條件為=Agilent ZORBAXSB-Aq C18 反相柱(250mmX4. 6mm)；流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液(10. 93g NaH2PO4 禾口 3. (MgNa2HPO4溶于純水中，加入四丁基溴化銨3. 22g，調(diào)節(jié)pH為6. 5，真空抽濾后定容至1L) 和乙腈配比為86 14;流速lmL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;柱溫35°C。所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均用0. 22 μ m濾膜過濾后進(jìn)樣10 μ L分析。NAD+、NADH在5min內(nèi)可以得到分離。胞內(nèi)NADH 和NAD+濃度至少是三次獨(dú)立提取過程的平均值。2、NADH氧化酶的測(cè)定參照Lopez de Felipe F 的方法。實(shí)施例3發(fā)酵罐培養(yǎng)生產(chǎn)乳酸從新鮮斜面接一環(huán)S. cerevisiae入種子培養(yǎng)基YPD (80mL SC/250mL錐形瓶)，于 30°C、200r/min搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(Mh)后，以8%接種量(ν/ν)接入裝有700mLYNB培養(yǎng)基的1.3L發(fā)酵罐(NEW Brun Swick/BLO FLO 110)中。發(fā)酵初始pH為5. 5，發(fā)酵過程中以8mol/L的NaOH維持pH保持5. 5。通氣量為1. 5L/min，溶氧控制為50%。發(fā)酵IOOh后， 目的產(chǎn)物L(fēng)-乳酸積累量達(dá)到20g/L，而副產(chǎn)物乙醇濃度降為8. 2g/L。YPD種子培養(yǎng)基組成為(g/L)酵母膏10，葡萄糖20，蛋白胨20YNB 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L) :CaC034. 5，YNB (without (NH4) 2504) 1. 7，尿素 1，乙醇 5，葡萄糖70。實(shí)施例4L-乳酸、乙醇及葡萄糖的檢測(cè)L-乳酸和乙醇濃度的測(cè)定采用Agilent A1200高效液相色譜(HPLC)儀測(cè)定。色譜條件色譜柱AminexHPX-87H (Bio-Rad)流動(dòng)相0.005mol/L H2SO4流速0. 6mL/min柱溫35°C進(jìn)樣量5yL檢測(cè)器示差折光樣品制備5mL發(fā)酵液在IOOOOrpm下離心lOmin，取上清液移入試管中以備測(cè) L-乳酸、乙醇和殘余葡糖糖時(shí)用。測(cè)L-乳酸時(shí)，取ImL上清液移入IOmL容量瓶中，去離子水定容至刻線，經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾后，濾液供液相色譜分析用。結(jié)果表明n0X的過量表達(dá)，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)NADH和NAD+的濃度分別為0. 476 μ mol/g DCff和5. 944 μ mol/g DCW，未表達(dá)nox前胞內(nèi)NADH和NAD+的濃度分別為 0. 243 μ mol/g DCW 禾口 8. 103 μ mol/g DCW，胞內(nèi) NADH/NAD+ 比例降為 0. 03 (圖 2A)，經(jīng)酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)，NADH氧化酶活性提高到10. 7U/mg蛋白，是CEN. PK2-1C [LDH]的2. 9倍(圖2B)。 與CEN. PK2-1C[LDH]比較，nox的表達(dá)使突變株CEN. PK2-lC[LDH]-nox積累L-乳酸的能力提高了 33% (20g/L，圖2C)，而乙醇濃度下降了 49%，僅為8.2g/L(圖2D)。分析圖2C-D數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)，隨著nox的過量表達(dá)(I)L-乳酸對(duì)葡萄糖產(chǎn)率系數(shù)由0. 165g/g提高到0. 289g/ g ；⑵而乙醇對(duì)葡萄糖的產(chǎn)率系數(shù)則從0. 183g/g降低為0. 119g/g ； (3) L-乳酸/乙醇的比例提高了 2. 6倍。 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)乳酸工程菌，其特征在于過量表達(dá)了源于Mi^ptococcus pneumoniae的 NADH氧化酶基因nox，通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH/NAD+的水平，實(shí)現(xiàn)了碳代謝流的重新分配，促進(jìn) L-乳酸的積累并大幅度降低了副產(chǎn)物乙醇的積累量。
2.權(quán)利要求1所述產(chǎn)乳酸工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟1)提取帶有nox基因的質(zhì)粒和帶有LDH基因的質(zhì)粒，對(duì)兩質(zhì)粒雙酶切、回收、純化，連接；2)將步驟1)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布帶有氨芐抗性的LB平板，挑取轉(zhuǎn)化子；3)提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證；4)將構(gòu)建好的質(zhì)粒由LiAc法轉(zhuǎn)化導(dǎo)入受體菌中，涂布Trp缺陷平板；5)驗(yàn)證所述工程菌；6)胞內(nèi)NADH/NAD+的測(cè)定；7)NADH氧化酶的測(cè)定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟4)中所述受體菌為整合了LDH基因的酵母工程菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述酵母菌為產(chǎn)乳酸，但副產(chǎn)物乙醇較高的酵母菌。
5.權(quán)利要求1所述產(chǎn)乳酸工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳酸中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵生產(chǎn)的工藝為30°C、200r/min搖瓶培養(yǎng)所述工程菌至對(duì)數(shù)中期，以8%接種量接種入發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)100小時(shí)；發(fā)酵參數(shù)為 pH5. 5，通氣量 1. 5L/min，溶氧 50%。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種高產(chǎn)乳酸工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于遺傳發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過游離表達(dá)的方式，將源于Streptococcus pneumoniae的NADH氧化酶(nox)過量表達(dá)于整合了乳酸脫氫酶(LDH)的工程菌S.cerevisiae CEN.PK2-1C[LDH]中，構(gòu)建了L-乳酸合成能力進(jìn)一步提高的基因工程菌S.cerevisiae CEN.PK2-1C[LDH]-nox。所述菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，發(fā)酵100h后，發(fā)酵液中L-乳酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株增加了33％，達(dá)到20g/L，而乙醇積累量則下降了49％，為8.2g/L，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102212489SQ201110091340
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者劉立明, 王菲菲, 趙亮亮, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)