專利名稱：水稻抗褐飛虱主效基因bph7的分子標記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學領(lǐng)域，涉及水稻抗褐飛虱主效基因力祐7的分子標記，本發(fā)明還涉及該分子標記在選育水稻抗褐飛虱品種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最主要的糧食作物之一。同時，它也遭到不同病菌和害蟲的侵襲，使水稻生產(chǎn)受到嚴重的威脅。其中，稻褐飛虱就是水稻種植過程中為害最嚴重蟲害之一，其成蟲和若蟲以口針刺吸水稻韌皮部中的汁液，從而引起植株的葉片變黃，嚴重時整個植株枯死，最后可能導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收。據(jù)中國農(nóng)業(yè)年鑒記載，在1966、1969、1973、1977、1983和 2003年這6年中全國性褐飛虱大發(fā)生；而在1987、1991、2005、2006和2007年這5年中全國性褐飛虱特大發(fā)生。褐飛虱發(fā)生面積達到水稻種植總面積的50%以上，給我國水稻生產(chǎn)造成了嚴重的威脅。由于褐飛虱的為害多發(fā)生在水稻的灌漿期，若此時大量使用殺蟲劑進行防治，會對環(huán)境和稻谷造成較嚴重的污染。相反，若利用抗褐飛虱基因來培育抗蟲水稻品種，這將是褐飛虱綜合防治中最為經(jīng)濟有效的方法。迄今為止，在不同的秈稻品種和野生稻材料中已經(jīng)鑒定并報道了 23個抗褐飛風主效基因(Rahman et al. 2009 High-resolution mapping of two rice brown planthopper resistance genes, Bph2O(i) and Bph21( ), originating from Oryza minuta. Theor Appl Genet 119(7) : 1237-1246.)。除了如力5"和 4 ^ 夕卜，其余抗褐飛虱主效基因均已經(jīng)利用分子標記被定位到水稻不同的染色體上。早期鑒定的抗褐飛虱基因中，如Bphl、bph2和Bph3等，都已經(jīng)利用傳統(tǒng)的雜交方式轉(zhuǎn)育到一些性狀優(yōu)良的水稻材料中并培育成抗蟲品種，同時在亞洲熱帶水稻種植區(qū)大面積推廣種植。然而，隨著抗褐飛虱水稻品種的推廣種植，褐飛虱出現(xiàn)新的能致害抗性品種的生物型，從而使抗褐飛虱品種逐漸喪失抗性。例如，攜帶抗性基因的水稻抗蟲品種經(jīng)過2 3年(約M 36代)推廣種植后，它們就失去對褐飛虱群體的抗性。而攜帶和另外幾個微效抗性位點的水稻品種 IR64對褐飛虱群體表現(xiàn)出更持久的抗性性狀?？梢?，在水稻生產(chǎn)中迫切需要更多的新的抗褐飛虱基因，以利于培育更多攜帶不同抗性基因的水稻品種。由于水稻材料抗蟲性鑒定的復(fù)雜性，利用常規(guī)育種手段往往難以有效地導(dǎo)入和聚合不同的抗蟲基因。本發(fā)明是在找到與抗蟲基因緊密連鎖或共分離的分子標記的基礎(chǔ)上， 借助分子標記輔助選擇(Marker-assisted selection，MAS)技術(shù)可以有目的地進行抗蟲基因的導(dǎo)入和聚合，選育持久抗性品種，延緩抗蟲品種的退化年限和防止褐飛虱新生物型的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻抗褐飛虱主效基因_7的分子標記，通過檢測這些與抗褐飛虱主效基因緊密連鎖的分子標記，能夠預(yù)測水稻植株對褐飛虱的抗性，加快抗褐飛虱水稻品種的選擇進度。
本發(fā)明水稻抗褐飛虱主效基因力祐7的分子標記，由下述之一的引物對經(jīng)PCR擴增獲得
1)標記引物R1C^95，
左端引物序列，CCAGCTTAGCTATCAACGGATCG 右端引物序列，ACCTCCTCCGTTTCAATTCTCC ；
2)標記引物RM519，
左端引物序列，AATTTCCGCGAAATCAGCATCC 右端引物序列，TCATCTGGACAGTCGAGGTACGC ；
3)標記引物R1C8305，
左端引物序列，GTCATCTTCGCAAATGGTGATGG 右端引物序列，GGTCGTCGTGGTGTTATTCTTGG ；
4)標記引物冊；3448，
左端引物序列，TATTTACCACTCCCTGCCACTGC 右端引物序列，AGGGAAGGGTACAAGGGTGTCG ；
5)標記引物RM313，
左端引物序列，TGCTACAAGTGTTCTTCAGGAC 右端引物序列，GCTCACCTTTTGTGTTCCAC ；
6)標記引物R1C8374，
左端引物序列，GTCATCATGCGAAAGCAACAAAGG 右端引物序列，CGACATCGCCTTCAAGGTTGG。本發(fā)明還提供水稻抗褐飛虱主效基因力祐7的分子標記方法，其是用上述之一的引物對擴增待檢水稻基因組DNA，如果用引物R1C8295能夠擴展出IOObp的擴增片段，或者用引物RM519能夠擴增出125bp的擴增片段，或者用引物R1C8305能夠擴增出142bp的擴增片段，或者用引物RM3448能夠擴增出16;3bp的擴增片段，或者用引物RM313能夠擴增出 Illbp的擴增片段，或者用引物R1C8374能夠擴增出169bp的擴增片段，均標志著水稻T12 抗褐飛虱主效基因位點bph7的存在。該基因位點位于水稻基因組第4染色體長臂的分子標記RM28295和RM313之間的區(qū)域內(nèi)。本發(fā)明用RM28295和RM313篩選了 M30個BC2F2和 BC3F2的單株，得到了在這兩個分子標記間有重組的單株。分析重組單株的基因型和抗蟲級別后發(fā)現(xiàn)，分子標記冊；3448和RM313與抗褐飛虱主效基因如力7最靠近；同時，分子標記 R1C^95、RM519、RM28305和RM28374也均能用于篩選含力祐7基因的抗褐飛虱水稻品種。篩選上述分子標記引物的過程如下
(1)最早由Kabir & Khush (1988)利用抗蟲性篩選發(fā)現(xiàn)水稻品種T12對褐飛虱 Bangladesh群體(生物型4)具有抗性，通過遺傳分析表明該品種攜帶一對隱性抗褐飛虱基因并將其命名為如力7(Kabir & Khush. 1988 Genetic analysis of resistance to brown planthopper in rice, Oryza sativa L. Plant Breeding 100， 54 - 58)。但到目前為止， 辦祐7仍未定位在水稻的染色體上，這給該抗蟲基因在水稻分子輔助育種中的應(yīng)用帶來很大的困難。同時，水稻品種T12中抗性基因力祐7的鑒定已經(jīng)過去二十多年，在此過程中世界不同水稻種植地區(qū)的褐飛虱群體遺傳結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化。因此，評價水稻品種T12對我國主要褐飛虱群體的抗性級別并且利用SSR分子標記定位該抗蟲基因是非常必要的，這將為該基因在我國的水稻育種應(yīng)用中提供技術(shù)支持。因此，本發(fā)明篩選并開發(fā)了基于PCR技術(shù)的SSR分子標記。根據(jù)gramene網(wǎng)站(http//www. gramene. org)公布的SSR分子標記， 按照較均勻的遺傳距離選擇一定數(shù)目分子標記進行合成。(2)以高感褐飛虱的秈稻品種9311為母本，抗褐飛虱的品種T12為父本，配制雜種，構(gòu)建9311/T12 F2分離群體用于分子標記分析；每個F2單株通過自交獲得相應(yīng)的F2:3家系并用于苗期抗蟲鑒定。(3) M CTAB (Murray & Thompson， 1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8: 4321-4325)提取親本 T12、 9311及F2群體各單株的基因組DNA。用方法(1)獲得的備選標記對兩親本進行多態(tài)性篩選，PCR反應(yīng)在PTC-100擴增儀上進行，擴增產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析， 記錄并選擇在親本間具有多態(tài)性的SSR標記用于后續(xù)分析。(4)采用苗期接蟲進行抗蟲性鑒定，褐飛虱為生物型1和生物型2混合群體。兩葉一心期按8頭/苗的比例接種2 3齡褐飛虱若蟲，當對照感蟲品種Tm死亡株數(shù)達到90% 以上時，參照Huang等介紹的方法對每個單株進行0、1、3、5、7或9級的抗性評價(Huang et al. 2001 Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes in rice. Theor Appl Genet 102，9 - 934)，對親本材料和群體中的每個家系通過加權(quán)平均計算該家系的抗性級別。(5)根據(jù)F2單株的抗蟲級別，分別選擇10個極端抗蟲單株和10個極端感蟲單株的DNA混合構(gòu)建抗、感池。同時，利用在親本間有多態(tài)性的引物分別篩選抗、感DNA池并獲得有多態(tài)性的分子標記，該類多態(tài)性標記很可能與抗性性狀連鎖。然后，根據(jù)連鎖標記所在的染色體，選擇該染色體上在親本間有多態(tài)性的引物篩選F2分離群體的各個單株，PCR程序同上，獲得群體基因型資料。根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用軟件JoinMap 3.0將群體基因型資料構(gòu)建水稻的部分遺傳圖譜并獲得各分子標記的遺傳距離。最后，結(jié)合F2群體各個單株的分子標記基因型資料和相應(yīng)的褐飛虱抗性鑒定的抗蟲級別，利用MapQTL 5. 0軟件復(fù)合區(qū)間作圖法，對目標染色體進行QTL位點掃描。(6)根據(jù)初次QTL鑒定的結(jié)果，本發(fā)明用R1C8295和RM313篩選了 M30個BC2F2 和BC3F2群體的單株，DNA提取、SSR的PCR擴增及電泳分析同(2)，獲得了 37個在分子標記 RM28295和RM313之間有重組的單株。結(jié)合37個重組單株的基因型和相應(yīng)家系的抗蟲級別，得到與抗褐飛虱主效基因力祐7共分離的分子標記。本發(fā)明的有益效果
1.通過本發(fā)明首次用SSR標記定位了水稻品種T12中的抗褐飛虱主效基因如
2.通過本發(fā)明分子標記定位的主效基因位點位置明確，鑒定方便。通過檢測與該基因位點連鎖的分子標記，即可以預(yù)測水稻植株的褐飛虱抗性，用于水稻品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有褐飛虱抗性，進而快速篩選抗蟲品種或品系用于水稻育種。其檢測方便快速，不受環(huán)境影響；
3.輔助育種選擇目標明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有抗蟲基因的親本與栽培品種進行一系列雜交，而且要對水稻品種進行抗褐飛虱性狀的鑒定并進行選擇，操作非常復(fù)雜，同時還受環(huán)境的影響。此外，在進行抗蟲鑒定之前，首先要獲得蟲源并飼養(yǎng)繁殖褐飛虱群體，同時還要求接種蟲源與水稻秧苗苗齡較同步，這同樣給育種工作帶來麻煩，若不能有效地處理好蟲源、秧苗以及環(huán)境之間的關(guān)系，抗褐飛虱的表型鑒定結(jié)果可靠性就很低。因此，抗蟲育種不僅費時，而且難度大，成本高。然而，通過檢測抗褐飛虱主效基因位點，可以在苗期就鑒定出高抗褐飛虱的單株，淘汰其它植株，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高抗褐飛虱水稻材料的選擇效率，極大地縮短水稻品種的育種周期。


圖1.水稻品種T12抗褐飛虱主效基因力祐7定位在第12染色體。A，^^7初步定位。垂直線表示水稻第12號染色體，水平短線表示染色體上的分子標記，括號內(nèi)的數(shù)值表示標記間的遺傳距離(cM)，η為群體的單株數(shù)目；B，R1C8295和RM313篩選BC2F2和BC3F2重組單株的結(jié)果，結(jié)合表現(xiàn)型和基因型結(jié)果，如力7定位于冊；3448和RM313之間。參照9311的基因組序列，這兩個標記間的物理距離約為4851Λ。η表示篩選的BC2F2和BC3F2單株總數(shù)。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。實施例1
(-)9311/Τ12 F2群體構(gòu)建及表型鑒定
(1)在1988年，Kabir & Khush利用抗蟲性篩選發(fā)現(xiàn)水稻品種Τ12對褐飛虱Bangladesh 群體(生物型4)具有抗性，通過遺傳分析表明該品種攜帶一對隱性抗褐飛虱基因并將其命名為如力7 (Kabir & Khush, 1988 Genetic analysis of resistance to brown planthopper in rice, Oryza sativa L. Plant Breeding 100, 54 - 58)。/K禾酉品禾中來源于中國農(nóng)業(yè)科學院種質(zhì)資源庫，T12來源于國際水稻研究所水稻種質(zhì)資源庫。抗蟲鑒定實驗表明，T12對我國的褐飛虱群體具有中等抗性。為了尋找簡單有效且與力祐7緊密連鎖的分子標記，本發(fā)明以感蟲品種9311為母本，以抗褐飛虱品種T12為父本雜交，得到的F1再自交，從而獲得F2分離群體；然后，每個F2單株通過自交獲得相應(yīng)的F2:3家系。(2)采用苗期接種對親本和F2:3家系進行抗蟲性鑒定。為確保親本和F2:3群體中的每個家系生長一致，所有供試材料在播種前分別浸種催芽。每個家系(品種)各60粒種子播種于一個長58cm、寬38cm和高9cm，且盛有7cm厚營養(yǎng)土的面包盒中。每盒每個材料播種3個重復(fù)，其中隨機播種親本和TNl (感性對照)各3個重復(fù)。播種7天后間苗，淘汰病弱苗。待苗長至兩葉一心期時，按8頭/苗的比例接種2 3齡褐飛虱若蟲，最后罩上透光性良好的尼龍紗網(wǎng)。當感蟲品種Tm全部死亡時，參照Huang等(Huang Z et a7,2001 Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes in rice. Theor Appl Genet 102，9 - 934)介紹的方法對每個單株進行0、1、3、5、7或9級的抗性評價(表1)，對親本材料和群體的每個家系通過加權(quán)平均計算該家系的抗性級別，并根據(jù)抗性級別推測此單株基因型。表1 水稻抗褐飛虱性能鑒定的分級標準
權(quán)利要求
1.水稻抗褐飛虱主效基因如的分子標記，其由下述之一的引物對經(jīng)PCR擴增獲得1)標記引物R1C^95，左端引物序列，CCAGCTTAGCTATCAACGGATCG 右端引物序列，ACCTCCTCCGTTTCAATTCTCC ；2)標記引物RM519，左端引物序列，AATTTCCGCGAAATCAGCATCC 右端引物序列，TCATCTGGACAGTCGAGGTACGC ；3)標記引物R1C8305，左端引物序列，GTCATCTTCGCAAATGGTGATGG 右端引物序列，GGTCGTCGTGGTGTTATTCTTGG ；4)標記引物冊；3448，左端引物序列，TATTTACCACTCCCTGCCACTGC 右端引物序列，AGGGAAGGGTACAAGGGTGTCG ；5)標記引物RM313，左端引物序列，TGCTACAAGTGTTCTTCAGGAC 右端引物序列，GCTCACCTTTTGTGTTCCAC ；6)標記引物R1C8374，左端引物序列，GTCATCATGCGAAAGCAACAAAGG 右端引物序列，CGACATCGCCTTCAAGGTTGG。
2.權(quán)利要求1所述分子標記在選育抗褐飛虱水稻中的應(yīng)用。
3.水稻抗褐飛虱主效基因如的分子標記方法，其通過下述之一的引物對PCR擴增待檢水稻基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物1)標記引物R1C^95，左端引物序列，CCAGCTTAGCTATCAACGGATCG 右端引物序列，ACCTCCTCCGTTTCAATTCTCC ；2)標記引物RM519，左端引物序列，AATTTCCGCGAAATCAGCATCC 右端引物序列，TCATCTGGACAGTCGAGGTACGC ；3)標記引物R1C8305，左端引物序列，GTCATCTTCGCAAATGGTGATGG 右端引物序列，GGTCGTCGTGGTGTTATTCTTGG ；4)標記引物冊；3448，左端引物序列，TATTTACCACTCCCTGCCACTGC 右端引物序列，AGGGAAGGGTACAAGGGTGTCG ；5)標記引物RM313，左端引物序列，TGCTACAAGTGTTCTTCAGGAC 右端引物序列，GCTCACCTTTTGTGTTCCAC ；6)標記引物R1C8374，左端引物序列，GTCATCATGCGAAAGCAACAAAGG右端引物序列，CGACATCGCCTTCAAGGTTGG ；如果用引物冊觀四5能夠擴增出IOObp的擴增片段，或者用引物RM519能夠擴增出 125bp的擴增片段，或者用引物R1C8305能夠擴增出142bp的擴增片段，或者用引物RM3448 能夠擴增出16;3bp的擴增片段，或者用引物RM313能夠擴增出Illbp的擴增片段，或者用引物R1C8374能夠擴增出169bp的擴增片段，則標志著該待檢水稻存在抗褐飛虱主效基因 bph7 ο
4. 一種篩選抗褐飛虱水稻的方法，其用權(quán)利要求1中所述的引物對之一擴增待檢水稻基因組DNA，如果用引物R1C8295能夠擴展出IOObp的擴增片段，或者用引物RM519能夠擴增出125bp的擴增片段，或者用引物R1C8305能夠擴增出142bp的擴增片段，或者用引物 RM3448能夠擴增出163bp的擴增片段，或者用引物RM313能夠擴增出Illbp的擴增片段，或者用引物R1G8374能夠擴增出169bp的擴增片段，則標志著該待檢水稻存在抗褐飛虱主效基因bph7。
全文摘要
本發(fā)明提供了水稻抗褐飛虱主效基因bph7的分子標記及其應(yīng)用。通過將水稻抗蟲品種T12(♂)與感蟲品種9311(♀)雜交獲得的F2各單株的基因型，同時結(jié)合F2:3各家系的抗褐飛虱的抗性級別進行遺傳連鎖分析，獲得抗蟲品種T12抗性基因bph7并定位于分子標記RM3448和RM313之間。與該基因連鎖的分子標記還有RM28295、RM519、RM28305和RM28374。本發(fā)明中的分子標記可以有效檢測抗蟲品種T12及其衍生品種(系)中是否含有該主效基因位點，大大提高抗褐飛虱水稻的選擇效率，獲得含有bph7基因的抗褐飛虱水稻品種。
文檔編號C12Q1/68GK102181440SQ20111009164
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者何光存, 杜波, 祝莉莉, 邱永福, 陳榮智 申請人:武漢大學