專利名稱：組蛋白去甲基化酶基因OsJ5在提高水稻抗性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水稻基因工程技術(shù)領(lǐng)域。與轉(zhuǎn)基因水稻領(lǐng)域相關(guān)。具體涉及一個水稻組蛋白去甲基化酶基因0SJ5的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。所述的基因與提高水稻抗性有關(guān)。
背景技術(shù)：
真核基因的表達(dá)受細(xì)胞核內(nèi)、外多層次的調(diào)節(jié)，呈現(xiàn)多級調(diào)控包括遺傳調(diào)控(genetic regulation)和表觀遺傳調(diào)控(epigenetic regulation)。表觀遺傳是指不直接受DNA序列控制的基因發(fā)生表達(dá)或功能的變化并可以遺傳的現(xiàn)象，其實(shí)質(zhì)在于染色質(zhì) 結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化對基因表達(dá)的影響，由于它不涉及基因序列的改變，不符合孟德爾遺傳的遺傳方式，是一種全新的遺傳機(jī)制。常見的表觀遺傳現(xiàn)象包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、遺傳印記、X染色體失活、RNA調(diào)控、轉(zhuǎn)座元件等(Levenson JM and SweattJD. Epigenetic mechanisms in memory formation. Nat Rev Neurosci, 2005,6 :108-118)。細(xì)胞對外界環(huán)境做出的每一個反應(yīng)，都要調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)，這幾乎都會涉及到染色質(zhì)活性的變化，染色質(zhì)活性的變化往往就是通過修飾組蛋白實(shí)現(xiàn)的。組蛋白氨基末端的修飾包括磷酸化、泛素化、甲基化/去甲基化、乙?；?去乙酰化等，這些修飾產(chǎn)生的各種標(biāo)記的組合就形成了所謂調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因組表達(dá)的“組蛋白密石馬，，(Jenuwein T and Allis CD. Translating the histone code. Science, 2001,293 1074-1080)。其中組蛋白的甲基化修飾對植物的生長發(fā)育起著重要的作用。組蛋白去甲基化酶(Histone demethylase, HDM)是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類組蛋白修飾酶(Klose et al.,JmjC-domain—containingproteins and histone demethylation. Nat Rev Genet.2006,7 715-727)可以去除被甲基化修飾的組蛋白尾部的甲基，與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)的功能相反。含有Jumonji C(JmjC)結(jié)構(gòu)域的基因是在人類中新發(fā)現(xiàn)的具有組蛋白去甲基化酶功能的一類基因，并且具有位點(diǎn)特異性(Klose et al. ,Regulation of histone methylationby demethylimination and demethylation. Nature reviews. 2007,8 :307-318.)。隨著研究的深入，越來越多的這類蛋白的成員被發(fā)現(xiàn)，功能也越來越豐富。植物中，對jumonji家族功能報道最早的是在2004年發(fā)表的調(diào)控擬南芥開花的EARLY FLOWERING 6 (ELF6)和 RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6(REF6)(Noh et al. , Divergent Roles of a Pairof Homologous Jumonji/Zinc-Finger-Class Transcription Factor Proteins in theRegulation of Arabidopsis Flowering Time. The Plant Cell. 2004,16 :2601-2613.)。水稻的一個基因JMJ706證實(shí)具有去除H3K9 二甲基化和三甲基化的活性，其突變體呈現(xiàn)花形態(tài)的變異以及種子胚乳的異常，實(shí)驗(yàn)證明它可能通過調(diào)控花發(fā)育相關(guān)的基因MADS47和DHl的組蛋白修飾水平并促使其表達(dá)造成花發(fā)育的異常(Sun and Zhou. Rice jmjCdomain-containing geneJMJ706 encodes H3K9 demethylase required for floral organdevelopment. PNAS. 2008,36 :13679-13684)。水稻基因組中有 20 個 jumonji 基因，除JMJ706外其它基因的功能都未知，這樣我們就更有有理由相信，此類基因在水稻的表觀遺傳調(diào)控和生長發(fā)育中占據(jù)著重要的地位，相關(guān)發(fā)面的研究也具有一定的科研和應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆并鑒定一種新的水稻組蛋白去甲基化酶基因0sJ5及其編碼蛋白。通過轉(zhuǎn)化水稻本身，培育一種能夠提高水稻抗性的轉(zhuǎn)基因水稻。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)申請人:克隆得到水稻組蛋白去甲基化酶基因0sJ5，其核苷酸序列如SEQ NO 1中第123-3983所示。本發(fā)明的組蛋白去甲化酶基因0sJ5的編碼基因(SEQ ID NO 1)來源于水稻，由4145個堿基組成，推測的蛋白質(zhì)編碼序列有3861個堿基，是序列I自5’端第123位堿基到3983位堿基組成。將該基因的完整編碼序列(Coding sequence)構(gòu)建到超表達(dá)載體PU1301(見圖1)，獲得轉(zhuǎn)化載體pU1301-0sJ5后直接轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因植株在分孽期開始逐漸出現(xiàn)假病斑，在孕穗期接種白葉枯病發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株比對照野生型要抗病許多(見圖3)。檢測轉(zhuǎn)基因植株的組蛋白修飾情況發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的組蛋白H3K36三甲基化和H3K93三甲基化水平要明顯低于野生型(見圖6)。表明本發(fā)明的組蛋白去甲基化酶基因0sJ5可 以調(diào)控水稻組蛋白甲基化修飾并且提高水稻對白葉枯病的抗性。具體操作步驟如下(I)從 NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)得到 0sJ5 基因(登錄號AK068952)的核苷酸序列，根據(jù)該序列設(shè)計引物對，擴(kuò)增特異的片段區(qū)域(其核苷酸序列見SEQ ID NO 1所示，其中123-3983bp是編碼區(qū))，所述引物對的DNA序列如下0XJ5-F (正向引物)5 ’ GGGGGTACCATGAGGCCCTCGCCGCCTCC—3，0XJ5-R (反向引物)5 ’ GGGGGATCCTCAACTCTTTGCTTTCTTCTTCT------3 ’(2)將⑴中擴(kuò)增片段連接到pU1301(見圖1)，獲得轉(zhuǎn)化載體roi301-0sJ5。(3)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法(Hiei Y et. al. , Efficient transformationofrice(Oryza sativaL. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA. PlantJ. 1994，6 :271-282)將所述的載體導(dǎo)入水稻受體中花
11(來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)，獲得轉(zhuǎn)化植株；(4)借助Northern Blot方法分析鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株,并初步觀察統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因植株表型；(5)利用RT-PCR方法分析水稻內(nèi)源0sJ5基因表達(dá)模式；(6)利用realtime-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株中相關(guān)基因的表達(dá)；(7)借助Western Blot分析轉(zhuǎn)基因植株組蛋白修飾情況；(8)轉(zhuǎn)基因植株接種白葉枯菌株P(guān)X099，并進(jìn)行抗性統(tǒng)計。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下本發(fā)明組蛋白去甲基化酶基因0sJ5在提高水稻抗性中的功能在國內(nèi)外未見報道，對組蛋白去甲基化酶功能的研究和表觀調(diào)控對水稻抗性的研究起著重要的意義。目前在水稻中還未有去組蛋白H3K36三甲基化酶基因的報道，本發(fā)明0sJ5可以去除組蛋白H3K36三甲基化的功能對組蛋白修飾酶基因分子功能的補(bǔ)充有重要的生物學(xué)意義。超表達(dá)OsJ5轉(zhuǎn)基因植株可以提高水稻對白葉枯病的抗性，這對水稻抗白葉枯病的研究有重要的指導(dǎo)意義，可以在分子水平上揭示抗病機(jī)理。并可以為進(jìn)一步的應(yīng)用于農(nóng)作物品種改良打下良好的基礎(chǔ)，對保障中國糧食安全具有重要意義。


序列表SEQ ID NO I :是本發(fā)明克隆的水稻組蛋白去甲基化酶的核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列。序列全長為4145bp，其中123-3983bp區(qū)域是編碼區(qū)。圖I :是本發(fā)明構(gòu)建的超量表達(dá)載體TO1301示意圖。圖2 :是0sJ5基因在Tl代超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量檢測。中花11為陰性對照，圖中1-1，2-5，3-9，4-2為轉(zhuǎn)基因陽性植株，2-2為轉(zhuǎn)基因陰性植株；圖3 :是0sJ5基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株葉片的形態(tài)表型及轉(zhuǎn)基因植株接種白葉枯菌株P(guān)X099 15天后的表型。圖3A為超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在自然條件下孕穗期時葉片的表型 圖；圖3B為超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在孕穗期接種白葉枯菌株P(guān)X099 15天后的葉片表型。中花11為陰性對照，圖中1-1，2-5，3-9，4-2為有表型植株的葉片，2-2為轉(zhuǎn)基因無表型陰性植株的葉片。圖4 :0sJ5基因的表達(dá)模式。圖中是0sJ5基因在水稻愈傷、芽、根、莖、幼穗、劍葉、幼葉中的表達(dá)模式，actin為內(nèi)參。圖5 0sJ5基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株葉片中hAT和HSR201的表達(dá)情況。圖5A為超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中hAT的相對表達(dá)水平；圖5B為超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中HSR201的相對表達(dá)水平。中花11為對照材料，圖中1-1，2-5，4-2為0sJ5基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因的Tl代材料，actin為內(nèi)參；
圖6 :0sJ5基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的組蛋白修飾。Western Blot實(shí)驗(yàn)用的一抗分別為H3抗體，三甲基化H3K9抗體，三甲基化H3K36抗體；所檢測的蛋白分別為中花11和0sJ5基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因Tl代材料2-5的組蛋白。圖7:轉(zhuǎn)基因植株接種白葉枯菌株P(guān)X099病情統(tǒng)計。孕穗期采用剪葉法接種白葉枯病菌PX099 (菲律賓菌系生理小種)，每株接種5片完全伸展的葉子，接種后15天調(diào)查病斑長度，依據(jù)病斑面積(病斑長度/病葉長度)衡量病情。中花11為對照，1-22為0sJ5超表達(dá)轉(zhuǎn)基因Tl代材料，正體字標(biāo)注的為分離出的轉(zhuǎn)基因陽性植株，下劃線標(biāo)注的為轉(zhuǎn)基因陰性植株；
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I 0sJ5基因片段克隆對本發(fā)明所需要的基因(登錄號AK068952, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/32978976)，主要通過RT-PCR方法(參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，北京，科學(xué)出版社，2002版)進(jìn)行擴(kuò)增得到0sJ5特異的一段序列，具體步驟是先抽提來自孕穗期植株葉片的RNA，RNA抽提用試劑是Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見試劑盒說明書)；RT-PCR中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈的步驟如下①配混合液I 總RNA 2 u g, DNAse12u,IOx DNAseI buffer I yl，加DEPC (焦碳酸二乙酯，RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑)處理水(0.01%DEPC)到10 u 1，混勻后將混合液I在37°C放置20分鐘以除去DNA，②20分鐘后將混合液I置于70°C水浴中溫浴10分鐘以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分鐘，③向混合液I中加入Iyl 500 u g/ml的oligo (dT)，④將冷卻的混合液I立即置于70°C水浴中溫浴10分鐘，以徹底使RNA變性，然后置于冰上5分鐘，⑤配混合液2 :混合液110 yl，5x firststrand buffer 4 u 1,0. IM DTT (疏基乙醇)2 u I, IOmM dNTP mixturel. 5 u 1,DEPC 處理水0. 5u I,反轉(zhuǎn)錄酶2 ii I,混勻后將混合液2置于42°C水浴鍋內(nèi)溫浴I. 5小時,⑥反應(yīng)結(jié)束后將混合液2置于90°C干浴3分鐘，⑦_(dá)20°C保存反應(yīng)最終產(chǎn)物，反應(yīng)中用到的試劑全部購自Invitrogen 公司；然后根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)公布的 0sJ5 基因的全長cDNA序列，設(shè)計特異引物PCR擴(kuò)增特異片段。PCR用到的體系為20 U 1，具體配法為cDNA 第一鏈模板 I ii 1，IOxPCR buffer 2u I, IOmM dNTP I. 6u 1,2. 5mMMg2+l. 5u I,0XJ5-F 和 0XJ5-R 引物 0. 4 ill，TAQ 酶 0. 2 ill，加水到 20 ill (所用至Ij 的 PCR buffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均購自寶生物工程大連有限公司)JCR反應(yīng)條件如下①94°C 4分鐘，②94°C 30秒，③60°C 30秒，④72°C 4分鐘，⑤從②-④循環(huán)30次，⑥72°C 7分鐘，⑦4°C保存。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T/A克隆載體pGEMT-vector (購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國Promega公司)上用17和SP6引物測序驗(yàn)證。用來克隆0sJ5的全長片段的引物為 0XJ5-F (正向引物)5，一GGGGGTACCATGAGGCCCTCGCCGCCTCC—3， 0XJ5-R (反向引物)5 ’ GGGGGATCCTCAACTCTTTGCTTTCTTCTTCT—3 ’最終得到的0sJ5基因的全長cDNA序列如序列表SEQ ID NO 1中第123-3983位所示。實(shí)施例2超表達(dá)載體PU 1301-Os J5的構(gòu)建具體步驟如下I)將帶有0sJ5片段(如序列表SEQ ID NO : I中第123-3983位所示)的T/A克隆用KpnI和BamHI酶切，回收目標(biāo)條帶，與KpnI和BamHI酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒TO1301 (見圖I)連接，pUl301是在國際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIAl301 (Sun等，2004，Xa26，a geneconferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice, encoding a LRRreceptor kinase-like protein. Plant Journal. 37 :517-527)基礎(chǔ)上改造的，是攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米泛素啟動子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體。PCAMBIA1301載體由澳大利亞 CAMBIA 實(shí)驗(yàn)室(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture)惠贈。內(nèi)切酶KpnI和BamHI和連接所使用的T4連接酶均購自寶生物工程大連有限公司，用法及用量按照該公司提供的產(chǎn)品說明書；2)連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法(電轉(zhuǎn)化儀為印pendorf公司產(chǎn)品，所用電壓為1800v，操作方法見儀器說明書)導(dǎo)入大腸桿菌DH10B(購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(購自羅氏生物公司產(chǎn)品)的LA (LA配方參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)LA抗性培養(yǎng)基上涂皿培養(yǎng)；3)將LA抗性培養(yǎng)基上長出的單菌落在超凈工作臺接種于滅菌的IOml離心管，管內(nèi)預(yù)先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培養(yǎng)基，然后在37°C搖床上培養(yǎng)16-18小時。按照(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002)所述的方法抽提質(zhì)粒，用KpnI和BamHI酶切和PCR檢測，根據(jù)插入片段的大小獲得陽性的超表達(dá)質(zhì)粒載體將其命名為PU1301-0sJ5 ；
4)把步驟3)的超表達(dá)載體PU1301_0sJ5通過電轉(zhuǎn)化的方法(參考文獻(xiàn)和使用的電壓參數(shù)按照本實(shí)施例步驟2)的方法進(jìn)行)導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105(購自澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室)菌株中。將轉(zhuǎn)化后的菌株命名為T-0sJ5 ；實(shí)施例3雙元Ti質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株陽性和表達(dá)量檢測具體步驟如下I)將T_0sJ5向水稻受體品種“中花11”(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方法參照 Hiei 等人報道的方法(Hiei 等,Eff icient transformation of rice (Oryzasativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA. Plant J，1994，6 :271-282)進(jìn)行。所獲得的TO代轉(zhuǎn)基因植株命名為0sJ5_n，其中n = 1，2，3…代表轉(zhuǎn)基因的不同家系。
2)取TO代轉(zhuǎn)化植株葉片抽提總DNA，DNA抽提方法為CTAB法(Zhang等，geneticdiversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLPanalysis, 1992, Theor Appl Genet，83，495-499)。然后用 PCR 方法對 TO 代轉(zhuǎn)化植株用潮霉素引物進(jìn)行陽性檢測。潮霉素引物的序列如下Hn_F 5’ -agaagaagatgttggcgacct-3’，Hn-R 5’ -gtcctgcgggtaaatagctg-3’(上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)。PCR反應(yīng)總體積為 20 u 1，具體配法是模板 lOOng，IOxPCR buffer 2u I, IOmM dNTP I. 6u 1,2. 5mMMg2+L 5 iil，左、右引物(Hn-F和Hn-R)各0. 4yl，TAQ酶0. 2 yl加去離子水到20 yl (所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均購自寶生物工程大連有限公司)。PCR反應(yīng)條件如下①940C 4分鐘，②94°C 30秒，③56°C 30秒，④72°C 2. 5分鐘，⑤從②_④循環(huán)32次，⑥72°C 7分鐘，⑦4°C保存。PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。因?yàn)槌泵顾鼗驗(yàn)檗D(zhuǎn)化載體所特有，這樣能擴(kuò)增出潮霉素基因特異帶的轉(zhuǎn)基因植株即為陽性植株。對TO代陽性植株收種子(Tl代)，為Tl代的大田種植和性狀調(diào)查做準(zhǔn)備。3)為了檢測轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因的表達(dá)量，申請人采用Northern-blot的方法對轉(zhuǎn)基因TI代植株進(jìn)行了表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)所用的總RNA來自分蘗期的水稻葉片，RNA抽提用試劑是Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見試劑盒說明書)！Northern轉(zhuǎn)膜上樣量為15-20 yg，探針標(biāo)記采用隨機(jī)引物標(biāo)記的方法，所使用的同位素標(biāo)記物為a-32P-Dctp,膜在雜交管中先預(yù)雜交3個小時左右，然后加入同位素標(biāo)記的探針，繼續(xù)雜交12個小時；雜交結(jié)束后，用2X檸檬酸鈉緩沖液(SSC)，0. I %十二烷基硫酸鈉(SDS)常溫下將雜交膜漂洗10分鐘，然后用同樣的洗膜液在65°C漂洗，每次兩分鐘，直到信號值合適為止。洗完膜以后將膜置于干凈的濾紙晾干，用保鮮膜包好，然后用磷屏(Phosphorimage，F(xiàn)UJI,日本)壓片4-6小時最后用FUJIFILMFLA5100掃描讀取結(jié)果。在本實(shí)施例中，獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(文獻(xiàn)參見Hiei et al. , Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. ) mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J，1994，6 :271-282)報道的主要步驟，培養(yǎng)基以及使用的試劑主要參照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)授權(quán)專利(專利號ZL200710053552. 9，發(fā)明的名稱水稻廣親和基因S5的分離克隆及應(yīng)用；專利
公開日2008年6月18日；
發(fā)明者周道繡, 李甜甜 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)