專利名稱：生產(chǎn)骨化三醇的發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵轉(zhuǎn)化方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種新的生產(chǎn)骨化三醇的發(fā)酵培養(yǎng)基以及相應(yīng)的發(fā)酵轉(zhuǎn)化方法和該發(fā)酵培養(yǎng)基的用途。
背景技術(shù)：
Norman和Boyle等在1971年發(fā)現(xiàn)骨化三醇為維生素D3在體內(nèi)轉(zhuǎn)化后最重要的活性形式。骨化三醇是由羅氏公司研發(fā)，并于1978年在瑞士獲得通過(guò)上市，1988年在我國(guó)首次注冊(cè)。骨化三醇主要用于治療骨質(zhì)疏松癥和腎性骨病等疾病。隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的到來(lái)，治療骨質(zhì)疏松癥的藥物市場(chǎng)需求很大。目前骨化三醇的生產(chǎn)主要依賴于化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成骨化三醇的工藝主要是以膽固醇為原料進(jìn)行大約20步反應(yīng)得到，產(chǎn)率非常低，小于1%，因此導(dǎo)致骨化三醇原料藥的價(jià)格非常高，所以開(kāi)發(fā)新的生產(chǎn)工藝十分必要。 1990年，Omura等成功篩選到3株能夠?qū)⒕S生素D3轉(zhuǎn)化為骨化三醇的菌株，包括2株鏈霉菌和I株自養(yǎng)性假諾卡氏菌。1991年，Takeda等在專利EP91305415. I說(shuō)明向反應(yīng)體系中加入環(huán)糊精可以大幅提高維生素D3的轉(zhuǎn)化率。但該專利中僅報(bào)道了菌株ATCC13181的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基和發(fā)酵的轉(zhuǎn)化方法，而目前國(guó)內(nèi)外的新的發(fā)酵工藝未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服了現(xiàn)有的利用自養(yǎng)性假諾卡氏菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)骨化三醇的發(fā)酵培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化率低的缺陷，從而提供了一種新的用于自養(yǎng)性假諾卡氏菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)骨化三醇的發(fā)酵培養(yǎng)基以及相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)方法和該發(fā)酵培養(yǎng)基的用途。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基可以大大提高骨化三醇的轉(zhuǎn)化率，從而提高生產(chǎn)效率，更加有利于工業(yè)化生產(chǎn),并且能夠大大降低骨化三醇的生產(chǎn)成本。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之一是一種用于自養(yǎng)性假諾卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)骨化三醇的發(fā)酵培養(yǎng)基,包括碳源和氮源，其中，按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)，所述碳源的含量為5-80g/L，較佳地為10-60g/L，更佳地為25-40g/L ;所述氮源的含量為2-80g/L，較佳地為5_50g/L，更佳地為25_40g/L ;所述碳源選自葡萄糖、麥芽糊精和可溶性淀粉中的一種或多種，所述氮源選自黃豆餅粉、棉籽餅粉、蛋白胨、酵母浸膏和酵母浸粉中的一種或多種。在本發(fā)明一較佳的實(shí)施方式中，所述碳源為葡萄糖和組分A的混合物；其中組分A為麥芽糊精和/或可溶性淀粉，較佳地為麥芽糊精。此時(shí)，所述葡萄糖的含量較佳地為5-20g/L,組分A的含量較佳地為5-70g/L，更佳地為5_40g/L ;組分A中，所述麥芽糊精的含量較佳地為10-60g/L，更佳地為20-40g/L ;所述可溶性淀粉的含量較佳地為5_60g/L，更佳地為20-40g/L ;所述含量皆按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)。在本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述黃豆餅粉可以選擇本領(lǐng)域的各種黃豆餅粉，如熱榨黃豆餅粉和/或冷榨黃豆餅粉。所述蛋白胨可選擇本領(lǐng)域的各種蛋白胨，較佳地為大豆蛋白胨和/或胰蛋白胨，更佳地為大豆蛋白胨。所述的酵母浸膏或酵母浸粉是采用常規(guī)的方法，將新鮮酵母乳液經(jīng)自溶、酶解、分離、濃縮等技術(shù)精制而成的一種可溶性膏狀或粉狀純天然制品。其中，所述熱榨黃豆餅粉的含量較佳地為5-30g/L ;所述冷榨黃豆餅粉的含量較佳地為5-50g/L，更佳地為5-30g/L ;所述棉籽餅粉的含量較佳地為l_50g/L，更佳地為
2-20g/L ;所述大豆蛋白胨或胰蛋白胨的含量較佳地為l_20g/L，所述酵母浸粉的含量較佳地為l-10g/L，所述酵母浸膏的含量較佳地為l-10g/L;所述含量皆按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)。在本發(fā)明一較佳的實(shí)施方式中，所 述氮源為由組分B和組分C組成的混合物，其中組分B選自所述黃豆餅粉、所述棉籽餅粉和所述蛋白胨中的至少一種，較佳地為所述黃豆餅粉和/或所述棉籽餅粉；更佳地為所述黃豆餅粉和/或所述棉籽餅粉，以及所述蛋白胨。所述組分C為酵母浸粉和/或酵母浸膏。此時(shí)，所述組分B的含量較佳地為2-65g/L，更佳地為20-40g/L。組分B中，所述黃豆餅粉的含量較佳地為5-50g/L，更佳地為15_40g/L ;所述棉籽餅粉的含量較佳地為l_50g/L，更佳地為2-20g/L ;所述蛋白胨的含量較佳地為2-20g/L0所述組分C的含量較佳地為5-10g/L ;所述含量皆按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)。在本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中，如常規(guī)的自養(yǎng)性假諾卡氏菌的發(fā)酵培養(yǎng)基一樣，較佳地還可進(jìn)一步含有礦物質(zhì)。所述的礦物質(zhì)一般作為滲透壓調(diào)節(jié)劑和/或PH調(diào)節(jié)劑，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑較佳地為NaCUNa2HPO4和NaH2PO4中的一種或多種，所述pH調(diào)節(jié)劑較佳地為CaCO3。所述礦物質(zhì)的含量按發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)較佳地為I. 0-5. Og/L。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基如常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)基一樣，較佳地還可以含有消泡劑。消泡劑的用量為常規(guī)用量。在本發(fā)明的一較佳的實(shí)施例中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源和氮源，其中所述碳源為5-20g/L葡萄糖以及5-40g/L所述組分A ;組分A中所述麥芽糊精的含量較佳地為20-40g/L ;所述可溶性淀粉的含量較佳地為20-40g/L ;所述氮源為20_40g/L所述組分B以及5-10g/L所述組分C ;所述組分B中所述黃豆餅粉的含量較佳地為15-40g/L ;所述棉籽餅粉的含量較佳地為2-20g/L ;所述蛋白胨的含量較佳地為2-20g/L。較佳地所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括I. 0-5. Og/L所述礦物質(zhì)；所述含量皆按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)。在本發(fā)明另一較佳的實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基包含碳源、氮源和礦物質(zhì)，其中所述碳源為葡萄糖5-20g/L、麥芽糊精10-60g/L(優(yōu)選20-40g/L)和可溶性淀粉10-60g/L(優(yōu)選20-40g/L);所述氮源為冷榨黃豆餅粉5_40g/L、熱榨黃豆餅粉5_30g/L、大豆蛋白胨2-20g/L、棉籽餅粉2-40g/L(優(yōu)選2_20g/L)和酵母浸粉5_10g/L ;所述礦物質(zhì)包括NaCl I. 0-5. Og/L ;所述含量皆按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為本領(lǐng)域此類發(fā)酵培養(yǎng)基的常規(guī)pH值，較佳地為
5.0-8. 5，更佳地為 7. 0-8. O。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之二是一種骨化三醇的發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)方法，包括下述步驟(a)將自養(yǎng)性假諾卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是如上所述的任一項(xiàng)發(fā)酵培養(yǎng)基；(b)在所述接種后的0-72小時(shí)，向發(fā)酵液(即整個(gè)發(fā)酵體系)中添加底物維生素D3;(c)從發(fā)酵液中分離出骨化三醇，即可。
在本發(fā)明一較佳的實(shí)施例中，在步驟(b)中將￠-環(huán)糊精與微生物D3—起添加到所述發(fā)酵液中。其中，所述3 -環(huán)糊精的添加量為本領(lǐng)域此類發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)方法的常規(guī)添加量，較佳地為2-5g/L所述發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明中，所述的自養(yǎng)性假諾卡氏菌可以是現(xiàn)有的自養(yǎng)性假諾卡氏菌菌株，較佳地是自養(yǎng)性假諾卡氏菌ATCC13181。在步驟(a)中，所述的自養(yǎng)性假諾卡氏菌的種子液可按本領(lǐng)域的常規(guī)方法將自養(yǎng)性假諾卡氏菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的。所述種子液可由現(xiàn)有的各種自養(yǎng)性假諾卡氏菌的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)制得，所述種子培養(yǎng)基較佳地為ISP2培養(yǎng)基或BG培養(yǎng)基。所述種子培養(yǎng)的溫度較佳地是25-32°C。所述種子液的接種量為本領(lǐng)域的常規(guī)接種量，較佳地為10% -20% (v/v)。在步驟(a)中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的溫度是本領(lǐng)域的常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)溫度，較佳地為 20-400C，更佳地為25-37°C。所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間較佳地為4_9天，更佳地為6_7天。在步驟(b)中，向發(fā)酵液中添加底物維生素D3的時(shí)間較佳地為接種后0_48h。在步驟(b)中，所述維生素D3的添加量較佳地為50mg/L_250mg/L所述發(fā)酵培養(yǎng)基。在步驟(C)中，從發(fā)酵液中分離出骨化三醇的方法為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，一般是將發(fā)酵液離心取上清，用乙酸乙酯抽提，經(jīng)過(guò)疏水柱的洗脫，濃縮脫色然后結(jié)晶，從而得到
骨化三醇。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之三是所述的發(fā)酵培養(yǎng)基在將自養(yǎng)性假諾卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)發(fā)酵轉(zhuǎn)化成骨化三醇中的用途。其中，所述的自養(yǎng)性假諾卡氏菌可以是現(xiàn)有的自養(yǎng)性假諾卡氏菌菌株，較佳地是自養(yǎng)性假諾卡氏菌ATCC13181。本發(fā)明中，上述優(yōu)選條件在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說(shuō)明之外，均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明提供了一種有利于自養(yǎng)性假諾卡氏菌高效發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)骨化三醇的發(fā)酵培養(yǎng)基以及相應(yīng)的發(fā)酵轉(zhuǎn)化方法和該發(fā)酵培養(yǎng)基的用途。通過(guò)優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基中碳、氮源的成分及配比，從而提高了骨化三醇的產(chǎn)量。更進(jìn)一步的，優(yōu)化了底物添加時(shí)間，使產(chǎn)量進(jìn)一步提高。本發(fā)明提供的骨化三醇的發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)方法大幅提高了骨化三醇的發(fā)酵單位，適用于骨化三醇的規(guī)?；a(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。發(fā)酵液中骨化三醇含量測(cè)定發(fā)酵結(jié)束時(shí)取適量發(fā)酵液，經(jīng)12000rpm離心lOmin，取上清液經(jīng)0. 45 u m微孔濾膜過(guò)濾后用于高壓液相色譜檢測(cè)。色譜條件色譜柱=UltimateXB-C18 柱(3 u m, 4. 6mmX 50mm);流動(dòng)相乙腈:水(50 : 50)) (pH = 7. 6);流速1. OmL/min ;波長(zhǎng)280nm ;柱溫40°C ;進(jìn)樣量10ii L，骨化三醇在7分鐘左右出峰。
實(shí)施例I取一株自養(yǎng)性假諾卡氏菌(Pseudonocardiaautotrophica)ATCC13181 劃線于種子斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)96h后接種于搖瓶種子培養(yǎng)基，裝液量為20ml/250ml，于28°C，230rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)48h，得種子液。種子液以10% (v/v)接種量接種于裝液量為20ml/250ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C進(jìn)行發(fā)酵120h。在此過(guò)程中，在將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后的0h，添加200uL維生素D3(2%，m/v) (2%指2g維生素D3溶于IOOmL乙醇中)和2mL ￠-環(huán)糊精(2%，m/v) (2%指2g P -環(huán)糊精溶于IOOmL水中)。發(fā)酵完畢后得發(fā)酵液，在發(fā)酵液中加入等體積的乙腈后離心取上清。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇產(chǎn)量達(dá)6. 8mg/L。其中所用的斜面培養(yǎng)基組成葡萄糖4. 0g/L，酵母浸粉4. 0g/L，麥芽浸粉10. Og/L，瓊脂粉20. 0g/L, pH自然。所用的種子培養(yǎng)基為BG培養(yǎng)基葡萄糖15g/L、蛋白胨15g/L、玉米漿粉5g/L、、NaCl 5g/L、CaCO3 2g/L，pH7. O。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽餅粉10. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黃豆餅粉10. 0g/L,熱榨黃豆餅粉5. 0g/L, NaCl 4. Og/L, CaCO31g/L, pH7. O。實(shí)施例2發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽餅粉 10. 0g/L，冷榨黃豆餅粉 10. 0g/L，熱榨黃豆餅粉 5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L, pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)2. ImgfL0實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)基的組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精28. 0g/L，棉籽餅粉10. 0g/L，酵母浸粉5. 0g/L，冷榨黃豆餅粉10. 0g/L，熱榨黃豆餅粉5. 0g/L, NaC15. 0g/L, pH7. 0。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)2. 4mg/L。實(shí)施例4發(fā)酵培養(yǎng)基組成發(fā)酵培養(yǎng)基的組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黃豆餅粉10. 0g/L,熱榨黃豆餅粉5. 0g/L, NaCl 5. Og/L, pH 7. O0將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)3. lmg/L。實(shí)施例5發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽餅粉 10. 0g/L，酵母浸粉 5. 0g/L，熱榨黃豆餅粉 5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L, pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)3. 5mg/L。實(shí)施例6發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽餅粉 10. 0g/L，酵母浸粉 5. 0g/L，冷榨黃豆餅粉 10. 0g/L, NaCl 5. 0g/L, pH7. O。
將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)3. 3mg/L。實(shí)施例7發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. Og/L，麥芽糊精30. Og/L，大豆蛋白胨5. Og/L，棉籽餅粉10. Og/L，酵母浸粉5. Og/L，冷榨黃豆餅粉10. 0g/L，熱榨黃豆餅粉5. 0g/L, pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)5. lmg/L。實(shí)施例8發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽餅 粉10. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黃豆餅粉10. 0g/L,熱榨黃豆餅粉5. 0g/L, NaH2PO4 2. Og/L, pH7. O0將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)6. 4mg/L。實(shí)施例9發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，可溶性淀粉30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽餅粉10. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黃豆餅粉10. 0g/L,熱榨黃豆餅粉5. 0g/L, NaCl 5. Og/L, pH8. O0將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)7. 2mg/L。實(shí)施例10發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽餅粉10. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黃豆餅粉10. 0g/L,熱榨黃豆餅粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L,pH5. O0將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)5. 0mg/L。實(shí)施例11發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，棉籽餅粉10. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L,冷榨黃豆餅粉10. 0g/L,熱榨黃豆餅粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L,pH8. O0將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)8. 3mg/L。實(shí)施例12將按實(shí)施例11中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37°C發(fā)酵120h，其他條件同實(shí)施例11。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)I. 7mg/L。實(shí)施例13將按實(shí)施例11中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30°C發(fā)酵120h，其他條件同實(shí)施例11。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)8. 5mg/L。實(shí)施例14將按實(shí)施例11中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C發(fā)酵120h，其他條件同實(shí)施例11。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)4. 2mg/L。實(shí)施例15在將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后24h，添加200uL維生素D3(2%，m/v)和2mL3 -環(huán)糊精(2%，m/v)，其他條件同實(shí)施例13。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)9. Omg/L。實(shí)施例16
在將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后72h，添加200uL維生素D3乙醇液(2%，m/v)和2mLP-環(huán)糊精(2 %，m/v)，其他條件同實(shí)施例13。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)2. 4mg/L0實(shí)施例17發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. Og/L，冷榨黃豆餅粉50. Og/L, pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)2. 8mg/L。實(shí)施例18發(fā)酵培養(yǎng)基組成麥芽糊精80. Og/L，棉籽餅粉50. Og/L, pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)2. 9mg/L。實(shí)施例19發(fā)酵培養(yǎng)基組成可溶性淀粉10. 0g/L,冷榨黃豆餅粉50. 0g/L, pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)3. lmg/L。實(shí)施例20發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精30. 0g/L，大豆蛋白胨2. 0g/L, pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)2. lmg/L.實(shí)施例21發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，可溶性淀粉30. 0g/L，棉籽餅粉5. 0g/L, pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)3. 0mg/L。實(shí)施例22發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L,麥芽糊精30. 0g/L,冷榨黃豆餅粉50. 0g/L,pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)3. 2mg/L。實(shí)施例23發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，可溶性淀粉30. 0g/L，酵母浸膏80. 0g/L，pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)2. 9mg/L。實(shí)施例24發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L,可溶性淀粉60. 0g/L,冷榨黃豆餅粉40. 0g/L,酵母浸膏 5. Og/L, pH7. O0將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)3. 6mg/L。實(shí)施例25發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. Og/L，麥芽糊精60. Og/L，棉籽餅粉2. Og/L，酵母浸膏10. Og/L, pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)3. 4mg/L。實(shí)施例26發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖20. 0g/L，可溶性淀粉5. 0g/L，酵母浸粉10. 0g/L，棉籽餅 粉 40. 0g/L, pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)4. 0mg/L。實(shí)施例27發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖20. 0g/L,可溶性淀粉5. 0g/L,冷榨黃豆餅粉20. 0g/L,棉籽餅粉 20. 0g/L，pH7.0。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)4. 3mg/L。實(shí)施例28發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精60. 0g/L，可溶性淀粉10. 0g/L，大豆蛋白胨20. 0g/L,棉籽餅粉10. 0g/L,酵母浸粉I. 0g/L,冷榨黃豆餅粉5. 0g/L,熱榨黃豆餅粉
10.0g/L, NaCl I. 0g/L，pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)3. 2mg/L。實(shí)施例29發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖20. 0g/L，麥芽糊精10. 0g/L，可溶性淀粉10. 0g/L，大豆蛋白胨2. 0g/L，棉籽餅粉20. 0g/L，酵母浸粉10. 0g/L，冷榨黃豆餅粉10. 0g/L，熱榨黃豆餅粉 30. 0g/L, NaCl I. 0g/L，pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)6. 3mg/L。實(shí)施例30發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. 0g/L，麥芽糊精10. 0g/L，可溶性淀粉60. 0g/L，大豆蛋白胨5. 0g/L，胰蛋白胨5. 0g/L，棉籽餅粉2. 0g/L，酵母浸膏5. 0g/L，冷榨黃豆餅粉40. 0g/L,熱榨黃豆餅粉 5. 0g/L, Na2HPO4 2. 0g/L, pH7. O。將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)3. lmg/L。實(shí)施例31將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后的0h，添加200uL維生素D3(2%，m/v)。其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)0. 6mg/L。實(shí)施例32發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖5. Og/L，麥芽糊精30. Og/L，大豆蛋白胨5. Og/L，棉籽餅粉10. Og/L,酵母浸粉5. Og/L,冷榨黃豆餅粉10. 0g/L,熱榨黃豆餅粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L,pH8. 50將按實(shí)施例I中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件皆同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)5. 5mg/L。實(shí)施例33將按實(shí)施例11中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中， 于40°C發(fā)酵120h，其他條件同實(shí)施例11。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)I. 0mg/L。實(shí)施例34將按實(shí)施例11中的方法制得的種子液以10% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于20°C發(fā)酵120h，其他條件同實(shí)施例11。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)3. 0mg/L。實(shí)施例35 在將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后48h，添加200uL維生素D3乙醇液(2%，m/v)和2mL ^ -環(huán)糊精(2%，m/v)，其他條件同實(shí)施例13。經(jīng)HPLC測(cè)定，骨化三醇的產(chǎn)量達(dá)6. Omg/L0對(duì)比實(shí)施例I按專利EP 91305415. I所述方法，取一株自養(yǎng)性假諾卡氏菌(Pseudonocardiaautotrophica) ATCC13181斜面，使用接種環(huán)接種于搖瓶BG培養(yǎng)基，裝液量為100ml/500ml，230rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床28°C培養(yǎng)48h，得種子液。種子液以8% (v/v)接種量接種于裝液量為50mL/500mL的TM-I培養(yǎng)基中，于28°C進(jìn)行發(fā)酵120h。在此過(guò)程中，在將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后48h后，加入0. 5mL的維生素D3乙醇液(2%，m/v)和ImL的P -環(huán)糊精(5%，m/v)。骨化三醇產(chǎn)量為2. 7mg/L。BG 培養(yǎng)基為葡萄糖 15g/L、蛋白胨 15g/L、玉米漿粉 5g/L、NaCl 5g/L、CaC032g/L,pH7. 0。TM-I培養(yǎng)基為葡萄糖20g/L、脫脂豆粉10g/L、蛋白胨5g/L、玉米漿粉5g/L、酵母浸粉 5g/L、NaCl 4g/L、KH2PO4O. 4g/L, pH7. 0。由對(duì)比實(shí)施例I可見(jiàn)，采用TM-I培養(yǎng)基需要在投入0. 5ml (500uL)的情況下，才
能產(chǎn)生與本發(fā)明培養(yǎng)基相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)量，由此證明本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠明顯提高骨化三醇的產(chǎn)量。對(duì)比實(shí)施例2按照對(duì)比實(shí)施例I的方法制得的種子液以8% (v/v)接種量接種于裝液量為50mL/500mL的TM-I培養(yǎng)基中，于28°C發(fā)酵120h，在此過(guò)程中，在將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后0h，加入0. 5mL的維生素D3乙醇液(2%，m/v)。其他條件皆同實(shí)施例31。骨化三醇產(chǎn)量為 0. lmg/Lo
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)骨化三醇的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括碳源和氮源，其中，按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)，所述碳源的含量為5-80g/L ;所述氮源的含量為2-80g/L ;所述碳源選自葡萄糖、麥芽糊精和可溶性淀粉中的一種或多種，所述氮源選自黃豆餅粉、棉籽餅粉、蛋白胨、酵母浸膏和酵母浸粉中的一種或多種。
2.如權(quán)利要求I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述碳源的含量為10-60g/L，較佳地為25-40g/L ;所述氮源的含量為5-50g/L，較佳地為25_40g/L ;所述含量皆按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)。
3.如權(quán)利要求I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述碳源為葡萄糖和組分A的混合物；其中組分A為麥芽糊精和/或可溶性淀粉，較佳地為麥芽糊精； 其中，所述葡萄糖的含量較佳地為5-20g/L ;組分A的含量較佳地為5-70g/L，更佳地為5-40g/L ;組分A中，所述麥芽糊精的含量較佳地為10-60g/L，更佳地為20_40g/L ;所述可溶性淀粉的含量較佳地為5-60g/L，更佳地為20-40g/L ;所述含量皆按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)。
4.如權(quán)利要求I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述黃豆餅粉為熱榨黃豆餅粉和/或冷榨黃豆餅粉；所述蛋白胨為大豆蛋白胨和/或胰蛋白胨；所述熱榨黃豆餅粉的含量較佳地為5-30g/L ;所述冷榨黃豆餅粉的含量較佳地為5-50g/L，更佳地為5_30g/L ;所述棉籽餅粉的含量較佳地為l_50g/L，更佳地為2-20g/L ;所述大豆蛋白胨或所述胰蛋白胨的含量較佳地為l_20g/L ;所述酵母浸粉的含量較佳地為l-10g/L，所述酵母浸膏的含量較佳地為l-10g/L ;所述含量皆按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)。
5.如權(quán)利要求I或4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述氮源為由組分B和組分C組成的混合物；組分B選自所述黃豆餅粉、所述棉籽餅粉和所述蛋白胨中的至少一種，較佳地為所述黃豆餅粉和/或所述棉籽餅粉，更佳地為所述黃豆餅粉和/或所述棉籽餅粉，以及所述蛋白胨；所述組分C為酵母浸粉和/或酵母浸膏； 其中，所述組分B的含量較佳地為2-65g/L，更佳地為20-40g/L ;此時(shí)組分B中，所述黃豆餅粉的含量更佳地為5-50g/L，最佳地為15-40g/L ;所述棉籽餅粉的含量更佳地為l-50g/L，最佳地為2-20g/L ;所述蛋白胨的含量更佳地為2-20g/L ;所述組分C的含量較佳地為5-10g/L ;所述含量皆按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于其還包括消泡劑和/或礦物質(zhì)；所述礦物質(zhì)較佳地為滲透壓調(diào)節(jié)劑和/或PH調(diào)節(jié)劑，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑較佳地為NaCUNa2HPO4和NaH2PO4中的一種或多種，所述pH調(diào)節(jié)劑較佳地為CaCO3 ;所述礦物質(zhì)的含量按發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)較佳地為I. 0-5. Og/L。
7.如權(quán)利要求1、3、5或6所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源和氮源，其中所述碳源為5_20g/L葡萄糖以及5-40g/L所述組分A ;組分A中所述麥芽糊精的含量較佳地為20-40g/L ;所述可溶性淀粉的含量較佳地為20-40g/L ;所述氮源為20-40g/L所述組分B以及5-10g/L所述組分C ;所述組分B中所述黃豆餅粉的含量較佳地為15-40g/L ;所述棉籽餅粉的含量較佳地為2-20g/L ;所述蛋白胨的含量較佳地為2_20g/L ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基較佳地還包括I. 0-5. Og/L所述礦物質(zhì)；所述含量皆按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)。
8.如權(quán)利要求I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含所述碳源、所述氮源和所述礦物質(zhì)，其中所述碳源為葡萄糖5-20g/L、麥芽糊精10-60g/L和可溶性淀粉10-60g/L ;所述氮源為冷榨黃豆餅粉5-40g/L、熱榨黃豆餅粉5-30g/L、大豆蛋白胨2-20g/L、棉籽餅粉2-40g/L和酵母浸粉5-10g/L ;所述礦物質(zhì)包括NaCl I. 0-5. Og/L ;其中，麥芽糊精的含量較佳地為20-40g/L，可溶性淀粉的含量較佳地為20-40g/L，棉籽餅粉的含量較佳地為2-20g/L，大豆蛋白胨的含量較佳地為2-10g/L ;所述含量皆按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為 5. 0-8. 5，較佳地為 7. 0-8. O。
10.一種骨化三醇的發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)方法，其特征在于其包括下述步驟 (a)將自養(yǎng)性假諾卡氏菌(Pseudonocardiaautotrophica)的種子液接種于權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)； (b)在所述接種后的0-72小時(shí)，向發(fā)酵液中添加底物維生素D3； (c)從發(fā)酵液中分離出骨化三醇，即可。
11.如權(quán)利要求10所述的骨化三醇的發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)方法，其特征在于在步驟(b)中將￠-環(huán)糊精與微生物D3—起添加到所述發(fā)酵液中；所述3 -環(huán)糊精的添加量較佳地為2-5g/L所述發(fā)酵培養(yǎng)基。
12.如權(quán)利要求10或11所述的骨化三醇的發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)方法，其特征在于所述的自養(yǎng)性假諾卡氏菌為自養(yǎng)性假諾卡氏菌ATCC13181 ;在步驟(b)中，所述維生素D3的添加量為50mg/L-250mg/L所述發(fā)酵培養(yǎng)基。
13.如權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的骨化三醇的發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)方法，其特征在于在步驟(a)中，所述種子液由ISP2培養(yǎng)基或BG培養(yǎng)基培養(yǎng)制得；種子培養(yǎng)的溫度為25-32°C;所述種子液的接種量為體積百分比10% -20% ;所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20-40°C，較佳地為25-370C ;所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為4-9天，較佳地為6-7天；在步驟(b)中，向發(fā)酵液中添加底物維生素D3的時(shí)間為接種后0-48h。
14.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基在將自養(yǎng)性假諾卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)發(fā)酵轉(zhuǎn)化成骨化三醇中的用途,其中所述的自養(yǎng)性假諾卡氏菌較佳地是自養(yǎng)性假諾卡氏菌ATCC13181。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)骨化三醇的發(fā)酵培養(yǎng)基以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)化方法和該發(fā)酵培養(yǎng)基的用途。該發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源和氮源，其中，按所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積計(jì)，所述碳源的含量為5-80g/L；所述氮源的含量為2-80g/L；所述碳源選自葡萄糖、麥芽糊精和可溶性淀粉中的一種或多種，所述氮源選自黃豆餅粉、棉籽餅粉、蛋白胨、酵母浸膏和酵母浸粉中的一種或多種。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基可以大大提高骨化三醇的轉(zhuǎn)化率，從而提高生產(chǎn)效率，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)，并且能夠大大降低骨化三醇的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102732571SQ201110095568
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者王向陽(yáng), 趙浩, 陳少欣 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院