專利名稱：一種應用特異引物檢測煙草種質(zhì)花葉病抗性的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域。本發(fā)明涉及一種抗花葉病煙草種質(zhì)的分子檢測方法， 更具體地涉及一種應用特異引物檢測煙草種質(zhì)花葉病抗性的方法。
背景技術：
煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)屬于正單鏈RNA病毒，是典型的模式植物病毒，具有抗逆性強、防治難、危害大、寄主范圍廣等特點。煙草花葉受TMV侵染后開始表現(xiàn)癥狀，其最顯著的癥狀有花葉、葉片畸形、植株矮縮、病葉厚薄不均、葉色濃淡不勻等。煙株受到煙草花葉病的侵害后，其煙葉烤曬后的顏色不均，煙味差，品質(zhì)大幅度降低。據(jù)相關研究發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒可侵染十字花科、茄科、菊科、藜科及莧科等36科植物及包括煙草、番茄、茄子、辣椒、菠菜在內(nèi)的350種植物。煙草花葉病已經(jīng)在世界各煙區(qū)普遍發(fā)生。煙草花葉病的危害日趨嚴重，篩選抗花葉病的煙草種質(zhì)成為防治煙草花葉病最直接、最經(jīng)濟、最有效的措施，其中檢測煙草種質(zhì)對煙草花葉病(TMV)的抗性，則是必不可少的重要環(huán)節(jié)?？篃煵莼ㄈ~病基因鴨是一個單顯性基因，屬于NBS-LRR類R基因之一，也是目前已經(jīng)報道的抗煙草花葉病基因中對抗TMV比較有效的基因之一，其結構、功能及表達特點都已進行了研究，但利用特異引物進行煙草種質(zhì)花葉病抗性的檢測還較少見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種應用特異引物檢測煙草種質(zhì)花葉病抗性的方法，以滿足在分子水平上對煙草種質(zhì)抗花葉病特性進行檢測的需要，從而解決傳統(tǒng)的田間檢測易造成污染的問題。本發(fā)明的用于檢測煙草種質(zhì)抗花葉病特性的特異引物CNF和CNR，其具體核苷酸序列為CNF :5，-AGGAAGGAAAGCACCAAATGG -3，和 CNR:5，_ CGCAACCCGTA TTCAACTCC -3，。利用所述的特異引物檢測煙草種質(zhì)花葉病抗性的方法，其步驟為利用特異引物對待檢測煙草種質(zhì)的基因組DNA進行PCR擴增，如果能特異性地擴增出565 bp的產(chǎn)物，即可判斷其抗性。本發(fā)明特異引物的設計與獲得過程為采用改良的CTAB法提取抗花葉病煙草種質(zhì)基因組DNA。利用GenBank上登錄的抗花葉病基因(OV)的核苷酸序列設計一對特異引物 CNF和CNR。用設計好的特異引物CNF和CNR擴增抗花葉病基因序列。然后將PCR產(chǎn)物克隆到PMD18-T載體上，轉化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，提取重組子質(zhì)粒DNA，并根據(jù)質(zhì)粒 DNA的PCR檢測結果，選取陽性克隆進行測序并進行序列分析。測序分析結果表明該引物擴增的核苷酸序列與其它抗花葉病基因保守序列的同源性達到88%。采用DNAMAN6. 0軟件對該引物擴增的的基因片段序列與其它抗花葉病基因的片段序列進行多重序列比較，比對結果表明該引物擴增的核苷酸序列與其他抗花葉病基因的核苷酸區(qū)域均含有1個保守核苷酸序列區(qū)域NBS域。


圖1為抗花葉病煙草種質(zhì)的基因組DNAPCR擴增產(chǎn)物回收后的電泳檢測圖； 圖2為陽性重組子的PCR檢測圖3為不同類型的煙草種質(zhì)DNA片段的PCR擴增圖；其中編號1-46對應待測來源于3 種煙草種質(zhì)材料的46個煙草資源的具體編號。
具體實施例方式實施例1
該實施例所用藥劑及載體等均為TAKARA公司購買。1、特異引物的獲得與特異性檢測 (1)抗花葉病煙草種質(zhì)基因組DNA的提取
采用改良的CTAB法，提取福建省煙草科研所提供的抗花葉病煙草種質(zhì)的基因組DNA。(2)煙草抗花葉病基因的PCR檢測
以 CNF :5’-AGGAAGGAAAGCACCAAATGG -3，禾口 CNR :5’ - CGCAACCCGTA TTCAACTCC -3， 為引物，擴增并得到煙草抗花葉病基因的PCR產(chǎn)物，如圖1所示，其核苷酸保守序列長度為 565bPo將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，提取重組子質(zhì)粒DNA ，并根據(jù)質(zhì)粒DNA的PCR檢測結果(圖2)，選取陽性克隆進行測序。PCR反應體系
權利要求
1.一種檢測煙草種質(zhì)花葉病抗性的特異引物，其特征在于所述特異引物的核苷酸序列為CNF :5’ - AGGAAGGAAAGCACCAAATGG -3，； CNR :5’ - CGCAACCCGTATTCAACTCC -3，。
2.一種利用權利要求1所述的特異引物檢測煙草種質(zhì)花葉病抗性的方法，其特征在于利用特異引物對待檢測煙草種質(zhì)的基因組DNA進行PCR擴增，如果能特異性地擴增出 565 bp的產(chǎn)物，即可判斷其抗性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種應用特異引物檢測煙草種質(zhì)抗花葉病特性的方法。所述特異引物的核苷酸序列為CNF5’-AGGAAGGAAAGCACCAAATGG-3’；CNR5’-CGCAACCCGTATTCAACTCC-3’。利用特異引物對待檢測煙草種質(zhì)的基因組DNA進行PCR擴增，如果能特異性地擴增出565bp的產(chǎn)物，即可判斷其抗性。本發(fā)明可以滿足在分子水平上進行煙草種質(zhì)抗花葉病特性的檢測需要，可以避免傳統(tǒng)田間檢測方法易造成的病毒污染，具有操作簡單等特點。
文檔編號C12Q1/68GK102206711SQ20111009557
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月18日 優(yōu)先權日2011年4月18日
發(fā)明者單睿陽, 周以飛, 張艷云, 方盼, 潘大仁, 郭金平 申請人:福建農(nóng)林大學