專利名稱：玫瑰黃鏈霉菌的一個負調控基因及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體的說，涉及玫瑰黃鏈霉菌(Streptomyces roseoflavus) Men-myco-93-63 的 nsdBmgh 基因、制備方法及其應用。
背景技術：
棉花黃萎病被稱為棉花上的“癌癥”，作為一種典型土壤傳播病害，其防治始終是世界性難題，至今既無高抗品種，又無理想的防治方法。黃瓜白粉病是生產上另一重要的真菌性植物病害，俗稱白毛，全國各地都有發(fā)生，是保護地黃瓜的主要病害之一，除危害黃瓜外，還危害西葫蘆、南瓜、甜瓜、冬瓜、西瓜和絲瓜等多種葫蘆科作物。番茄灰霉病是由葡萄孢屬引起的真菌性病害，主要危害番茄、黃瓜、韭菜、葡萄、草莓等多種蔬菜、果樹及觀賞植物，是一種毀滅性病害。目前生產上主要采用三唑類、嘧啶胺類等殺菌劑防治白粉病、灰霉病，但化學藥劑使用時間長、用量大，病菌容易產生抗性，而且生食瓜果中的農藥殘留還會直接危害人體健康。隨著人們環(huán)保意識的增強，生物防治因其對環(huán)境、生態(tài)和人類健康安全的優(yōu)點，在世界各國得到了廣泛的重視并發(fā)揮著越來越重要的作用。采用生物制劑防治黃萎病、白粉病、灰霉病等病害，被認為是控制生產上主要病害最切實有效的方法，具有廣闊的應用前景。目前，本研究小組已經獨立發(fā)現(xiàn)并從土壤中分離得到生防鏈霉菌菌株 Men-myco-93-63，而且在室內及大田實驗中，已經證實該菌株及其發(fā)酵液對棉花黃萎病菌、番茄灰霉病菌、瓜類白粉病菌等十幾種重要植物病原菌的生長均表現(xiàn)很強的抑制作用(Liu D Q, Anderson N A, Kinkel L L. Selection and characterization of Streptomyces suppressive to the potato scab pathogens. Canadian Journal of Microbiology, 1996，42(5) : 487-502 ；劉大群，楊文香，祁碧菽，等.拮抗鏈霉菌 Men-myco-93-63及其發(fā)酵液對棉花黃萎病菌生長的影響.河北農業(yè)大學學報，1999， 22(4): 79-82;郭敬華，孟慶芳，李亞寧，等.玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63發(fā)酵液對黃瓜白粉病抗性的影響[J].華北農學報，2007，22 (s)，Γ4.；孟慶芳，張汀，劉大群.番茄灰霉病生防菌的篩選與研究[J].中國生物防治，2005，21:13纊144.)。由中科院微生物所經16S r RNA序列分析及120bp的、可變區(qū)BLAST比較，結合形態(tài)學及生理生化特征分析，將該菌株鑒定玫瑰黃鏈霉菌(Sti^ptomyces roseoflavus)(中科院微生物微檢2005 年AOOl號)。另外，本研究小組已在Men-myco-93-63菌株中克隆得到了 nsdAmgh基因(沈鳳英，劉力強，吳偉剛，等.玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63負調控基因nsdAmgh的克隆及序列分析.華北農學報，2009，24(5): 77-80)，試驗表明，阻斷該負調控基因后，突變株在搖瓶水平上對棉花黃萎病菌的抑制能力提高了一倍(沈鳳英.玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63接合轉移體系及nsdA基因的研究.河北農業(yè)大學，碩士學位論文， 2009)。基于上述研究成果，本發(fā)明人進一步深入研究Men-myco-93-63菌株，得到一種負調控基因。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 IisdBmgh基因。本發(fā)明的第二個目的在于提供上述玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因的制備。本發(fā)明的第三個目的在于提供上述玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因的應用。本發(fā)明人經過研究對比發(fā)現(xiàn)，在天藍色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的/^必基因同M說基因結構相似，都含有TPR結構。/^必可能編碼含有502個氨基酸的調控蛋白，該蛋白與灰色鏈霉菌產袍蛋白nrsA的5 個氨基酸有27. 9%的一致性，與as說的491個重疊氨基酸有似％ 的一致性。阻斷/^必基因能夠使菌株的放線紫紅素和鈣依賴抗生素產量均提高，但形態(tài)分化沒有明顯變化。因此，本發(fā)明人根據天藍色鏈霉菌A3G)抗生素代謝途徑中重要的負調控基因 nsdB的序列自主設計引物Ns8F和Ns8R，擴增玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因組DNA， 得到了 1121bp的片段。非特異性引物錨定PCR方法(Nonspecific Anchored PCR, NPA-PCR)是基于隨機引物PCR的原理，由彭華正的抑制序列非特異錨定PCR染色體步移方法改進而來。非特異性引物錨定PCR (NPA-PCR)中共用到四條引物，兩條隨機引物，SAPl (Sequence Anchoring Primer)和SAP2，SAP 2是SAPl的一部分，起到非特異性錨定的作用；基因特異性引物 GSPl (Gene Specific Primer)和 GSP2，GSPl 為外引物，GSP2 為內引物。NPA-PCR 包括四輪反應。第一輪反應通過一個低嚴謹性循環(huán)使得引物SAPl非特異地結合到變性DNA上。第一輪反應結束后加入GSP1，第二輪反應即SAPl和GSPl的擴增反應，以篩選第一輪反應中正確的結合子。非特異性擴增序列由于兩端接合的同樣引物在退火時形成莖環(huán)結構，產生 PCR抑制效應，被稀釋消除。第三輪PCR是往第二輪反應產物中加入SAP2，擴增反應在引物 SAP2、GSP1之間進行，富集模板量。稀釋的第三輪產物作為第四輪反應模板加入SAP2、GSP2 進行擴增，擴增得到片段即為目的片段。在設計引物Ns8F和Ns8R擴增Men-myco-93-63基因組DNA得到1121bp片段的基礎上，我們利用非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)方法對該靶序列兩端進行延伸，5’端延伸得到534bp，3’端延伸得到702bp，拼接后得到長度為2073bp的基因全長序列，并在拼接序列兩端設計引物驗證延伸的正確性，比對發(fā)現(xiàn)擴增結果與拼接序列一致。該全長序列包含一個完整的開放閱讀框，共編碼464個氨基酸，與天藍色鏈霉菌A3 O)中nsdB基因核苷酸序列有87%同源性，將該新基因命名為nsdBmgh新基因的制備為進一步研究和探明玫瑰黃鏈霉菌抗生素合成代謝途徑和調控機理提供了又一重要依據，為抗生素高產基因工程菌株的獲得奠定了重要基礎。根據上述實驗過程，本發(fā)明提供了所述玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 IisdBmgh基因，其序列如下
CCTGAGACCTATTACCGCCCAGAGGATCTCCGTGTTGTGTGCATGGGCGATACAGATCCCTTCGTGTGCCTG TTGCATTGCGTGCACCTCCCGGCCCGGCCGCTTTCGGGTGCACCCTGGGGAGTGCCTTGCGGCGACCGGGTCGGGGTGGCGCACTCCTACCTGACACCCGGGGCCCCCTGGCACACCATCTGGCGCACCCTGGCGAACCCTGGCGAATAGTCGC TCAGCAACTGACAGGCGGTTACTGTCAACTCAGCCGAGAACCTGGGGGCTTGACGTGAACGGACAACCCAACACCCG CCTTTCGGACCTGTTCGGCCTGGCCGGCTGGTCCAAGGGTGAGCTCGCGAGGCTGGTGAACCGGCAGGCGGCGGCCA TGGGCCATCCCCAGCTGGCCACCGACACCTCGCGGGTGCGGCGGTGGATCGACACGGGGGAGATCCCCCGCGATCCG GTGCCGCGGGTGCTGGCGGTCCTGTTCACCGAGCGTCTCGGCCGTGTCGTGACCACTGAGGATCTCGGTCTGGTCCG GCAGGGACGCCCAGGGAAGCGGCAGGGCGACGGGAGTGTGGAGCACCCCGACGGCGTGCCGTGGGCGCCCGAGCGGA CGGCCTCGGTCCTCACCGAATTCACGGGAATGGACCTCATGCTCAACCGACGCGGCTTGGTGGGCGCGGGCGCTGCG CTTGCCGCAGGCTCCGCGCTCAGCAGCGCCATGCAAGACTGGCTGCACGTCGACCCGGCCCTCGCGGCCGACGCCCC CCGTACCCACGACCCCCTGCACGTCGACCCCGCAGCCGCCGACCGCTACGAGGCCGCTCCCGTCGGCTCCCAGGAGA TCGAGGAGCTGGAGCGCTCGGTCGAGGTGTTCCGCGCCTGGGACGCGTCCCGCGGCGGCGGACTCCAGCGCAAGGCC GTGGTGGGCCAGCTCAACGAGGTGGGCGGCATGCTCGCCTACCGCCACCCCGACCACCTCCAGCGACGCCTGTGGGG CGTCGCCGCCAACCTCGCAGTCCTCGCCGGCTGGATGTCGCACGACGTCGGCCTCGAACCCACGGCGCAGAAGTACT TCGTCATCGCGGCGCACGCGGCGCGGGAGGGCGGGGACCGGCCGCGTGCCGGGGAGGCCCTGTCGCGGGCCGCGCGC CAGATGGTGCACCTCGGCAAGCCGGACGACGCCCTGGACCTGATGAAGCTGGCCAAGTCCGGCGGCGGTGAGGAGGC CCTGCCGCGCACCAAGGCCATGCTGTACACCATCGAGGCCTGGGCGCAGGCGTCGATGGGGCGCGGCCAGGCCATGC GGCGCACGCTCGGCCTCGCCGAGGACCTCTTCGTCTCCGACAAGGGGGACGTGGAGCCGCCGAGCTGGATGCAGATG TTCGACGAGGCGGACCTGCACGGCATGCAGGCCCTGGCCTACCGCACGCTCGCCGAACACGACCCGGCGGCGGCGAG CGTCGCGCAGCGGCACGCCAAACTCGCCATCGAGCTGCGGGCCAAGGGCCGCGACCGCTCGCAGATCTTCGACTACA TCTCGCTGGCCTCCGCCTGCTTCATCGCCGACGACCCGGAGCAGGCCGACCGCTACGCACGCCTGGCCCTGGTGTCG ATAAACTCCAACTCCTCCCACCGCACCTGGGACCGGCTGCGCGAGATGTTCCGACTGACCGCGCAGTACTCCGACTA CCCGAAGATCCAGGACCTGCGCGAGGAGATCAAGCTCGCGCTGCCGAAGGGGGTCAAGGCGGGAGGCAGGACGGCGA GGGCGTGACGCGCCCGTCCTGAACACCGGCCCGAGCCCGTCCTCACCACCGAACCGAGGGCGACCGGCCGGACCGTG TCGTCAGGCGCGGGTCACACCCGTGCCATCAGCAGACAGGCGTCGGCCTCACGCGGCACCTCGTCGAACGCCTCCAT GACGGCGCGCACGCAGTCCTGCGCGTTGAGCGCCCCGGTGAAGCGGGGTGCCATCGAGAGAAGTTCGGTCGTGGCCG CGTCCCGGTCGCACCGGGGGACCAGACCGTCGATGCAAAAAACACGGAGATCCTCTGGGCGGTAATAGGTCTCAGG
根據上述實驗過程，本發(fā)明還提供上述玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 /^0 ^基因的制備方法。所述制備方法是以玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因組DNA為模板，進行PCR擴增得到1121bp的片段，利用非特異引物錨定PCR(NPA-PCR)方法對該靶序列兩端進行延伸， 5’端延伸得到534bp，3’端延伸得到702bp，拼接后得到長度為2073bp的全長序列，并在拼接序列兩端設計引物驗證延伸的正確性，比對發(fā)現(xiàn)擴增結果與拼接序列一致。該序列包含一個完整的開放閱讀框，共編碼464個氨基酸，與天藍色鏈霉菌A3 O)中nsdB基因核苷酸序列有87%同源性，將該基因命名為具體的說，本發(fā)明所述的制備方法包括以下步驟
1)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因部分片段的獲得根據國際基因庫
(GenBank)上天藍色鏈霉菌nsdB基因(GenBank登錄號11(^690 ；編號為SC0725》的序列設計一對特異引物 Ns8F (GTGGATCGACATGGGAGAGAT )和 Ns8R (CCATGGACAGGTAGTCGAAGAT )， PCR擴增玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因組DNA ；PCR產物電泳檢測，然后將PCR產物連接到克隆載體PMD19-T上，并轉化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序；
2)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 /^0 ^基因5’端和3’端非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)根據步驟1)中PCR的測序結果，設計5’端非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)特異性引物 GSPl (GAGCATGAGGTCCATTCCCGTGA)和 GSP2 (CGGACCAGACCGAGATCCTCAGTG)；3‘端非特異引物錨定 PCR (NPA-PCR)特異性引物 GSP3 (GACGCCCTGGACCTGATGAAGCTG)和 GSP4 (GATGCAGATGTTCGACGAGGCGG)，進行非特異引物錨定PCR擴增；PCR產物電泳檢測，然后將 PCR產物連接到克隆載體PMD19-T上，并轉化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序。其中，所述步驟1)是，PCR反應體系為模板DNA 50 ng, LA Taq酶1 U,5 μ mol · L-I 的上、下游引物各 0. 5 μ L, 10 mmol · L-I 的 dNTP 1 μ L，2XGC buffer I 緩沖液12. 5 μ ，用無菌蒸餾水補充反應體系至25 μ L ;PCR反應程序為先95°C 5 min ；然后 940C 1 min, 600C 1 min，72°C 1 min30s，共；35 個循環(huán)；最后 72°C 10 min，4°C保存；
隨后PCR產物在的瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，將PCR產物連接到克隆載體 PMD19-T上，并轉化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜，挑取3 個陽性克隆進行測序，在國際基因庫(GenBank)上進行序列分析獲得nsdBmgh基因的部分片段序列。步驟2)所述非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)擴增體系和程序為
第一輪反應為15 μ L體系包含1 U LA Taq酶、50 ng模板DNA、0. 2 μ M dNTP混合物、 10 μ L 2XGC buffer Ι、0· 1 μΜ SAPl (非特異引物錨定PCR通用引物)，用無菌蒸餾水補充反應體系至15 UL0 PCR反應程序為94°C 5 min, 30°C 3 min，以0. 2°C / s升到65°C， 65°C 5 min。第二輪反應為向第一輪反應體系中加入5 μ L引物GSPl (5’端延伸所用引物)或 GSP3 (3，端延伸所用引物)(終濃度為0.5 μΜ)。PCR反應程序為94°C 30 s，65°C 3 min，共 10 個循環(huán)；72°C 5 min。第三輪反應為向第二輪PCR產物中另加2. 5 yL SAP2(非特異引物錨定PCR)(終濃度為 0.5 μΜ)和 2. 5yL 2XGC buffer I。PCR 反應程序為先 94°C 2 min ；然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 20 個循環(huán)；72°C 5 min。第四輪反應以1 μ L 50倍稀釋的第三輪產物為模板進行擴增，反應體系為0.5 μΜ GSP2(5’端延伸所用引物)或GSP4 (3’端延伸所用引物)，0.5 μ M SAP2,0. 2 μΜ dNTPs，2XGC buffer I 禾口 IU LA Taq 酶。PCR 反應程序為先 94°C 2 min ；然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 30 個循環(huán)；72°C 5 min，4°C保存。隨后，將PCR產物在的瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，PCR產物連接到克隆載體 PMD19-T上，并轉化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜，挑取3 個陽性克隆進行測序，在國際基因庫(GenBank)上進行序列分析獲得基因的5’端和 3’端基因序列。另外，本發(fā)明所述的制備方法，在步驟2)之后，還包括步驟^nsdBmgh基因全長序列的驗證。步驟3)是根據步驟1)中獲得的測序結果與步驟B中5’端和3’端的延伸結果進行序列拼接，設計一對特異引物I3R (ACGACCGAACTTCTCTCGATGG)和PF(ATACAGATCCCTTCGTGTGCCTGT)進行PCR擴增驗證拼接結果的正確性。其中，所述PCR反應體系為模板DNA 50 ng，LA Taq酶1 U, 5 μ mol · L-1的上、下游引物各0. 5 μ L，10 mmol · L-I的dNTP 1 μ L，2 X GC buffer I緩沖液12. 5 μ ，用無菌蒸餾水補充反應體系至 25 μ L ;PCR 反應程序為先 95°C 5 min ；然后 94°C 1 min，65°C 1 min，72°C 3 min，共；35 個循環(huán)；最后72°C 10 min，4°C保存。PCR產物在的瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，將PCR 產物按上述方法進行克隆，挑取3個陽性克隆進行測序，在國際基因庫(GenBank)上進行序列分析。經過比對發(fā)現(xiàn)，擴增結果與拼接序列一致。該序列包含一個完整的開放閱讀框，共編碼464個氨基酸，與天藍色鏈霉菌A3 O)々nsdB基因核苷酸序列有87%同源性，將該基因命名為nsdBmgh。禾Ij 用 InterPro database 數(shù)據 (http//www. ebi. ac. uk/interpro/)對 Men-myco-93-63中克隆到的nsdBmgh基因編碼的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其與天藍色鏈霉菌A3(2) WnsdB基因編碼的NsdB蛋白在結構域組織方式上相同，都具有TPR結構域，表明玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63中克隆到的nsdBmgh基因很可能起著與天藍色鏈霉菌中的nsdB基因類似的功能，即在菌株代謝途徑中起到負調控作用。鏈霉菌是好氧的革蘭氏陽性細菌，能產生多種次級代謝物并且經歷復雜的形態(tài)分化，有很多基因已被確認在形態(tài)分化中充當重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)這些基因的表達產物均含有類TPR結構。TPR是一個含有34個氨基酸的蛋白重復序列，編碼α螺旋-轉角-α螺旋的二級結構片段，通常以串連形式重復出現(xiàn)在蛋白結構中，參與蛋白間的相互作用和細胞內的功能調節(jié)(Gaisser S, Bohm G A, Cortes J, et al. Analysis of seven genes from theeryAI-eryKregion of the erythromycin biosynthetic gene cluster in Streptomyces erythraeus. MolGen Genet, 1997, 256(3): 239-251)。天藍色鏈霉菌中就預測有70個含類TPR結構的蛋白，其中包括負調控基因nsdB。nsdB基因目前只在天藍色鏈霉菌中被研究和報道，發(fā)現(xiàn)阻斷該基因會使菌株的放線紫紅素和鈣依賴抗生素產量提高，菌株形態(tài)分化沒有明顯變化(Zhang L, Li W C, Zhao C H, et al. NsdB, a TPR-Iike-domain-containing protein negatively affecting production of antibiotics in Streptomyces coelicolor A3(2). Acta Microbiologica Sinica, 2007, 47(5):84054)0本試驗發(fā)現(xiàn)玫瑰黃鏈霉菌的nsdBmgh基因編碼的氨基酸序列與天藍色鏈霉菌的nsdB基因編碼的NsdB蛋白的結構域相同，都含有TPR結構，因此推測 nsdBmgh基因在玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63中也可能起到重要的負調控作用。因此，本發(fā)明提供的玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的nsdBmgh基因可用于對該生防菌的遺傳改造，通過阻斷該負調控基因使菌株產生抗生素能力提高，以適用于生防菌株的工業(yè)化生產。對負調控基因的研究對生產菌株的超量表達和開發(fā)新的有實際應用價值的抗生素具有重要的理論和實踐意義。將有利于改良抗生素生產菌株及進行新型抗生素的研發(fā)，為改造鏈霉菌抗生素生物合成相關基因、提高菌株抗生素產量提供理論依據，還將有助于發(fā)現(xiàn)新的有價值的天然產物。本發(fā)明利用非特異性引物錨定PCR (NPA-PCR)方法制備了玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63的一個新的負調控基因aso _。玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株及其發(fā)酵液對不同致病力的棉花黃萎病菌及其它十幾種植物病原菌的生長均表現(xiàn)較強的抑制作用。本發(fā)明中得到的^基因將為玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63中進一步研究和探明該生防菌抗生素合成代謝途徑和調控機理，以期獲得抗生素高產的基因工程菌株提供重要依據。


圖1是對天藍色鏈霉菌M145和玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 nsdB基因的PCR 擴增結果；
圖2是用NPA-PCR方法對玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 nsdBmgh基因5’端進行延伸的結果；
圖3是用NPA-PCR方法對玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 nsdBmgh基因3’端進行延伸的結果；
圖4是驗證拼接序列正確性的PCR擴增結果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。如無特別指明，實施例中采用的原料均為市購，其中所述玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63購自河北農大生防實驗室，天藍色鏈霉菌M145購自中國科學院微生物所；基因組DNA的制備參見文獻=Sambrook J, Russell D W. Molecular cloning: a laboratory mannual(3rd Edition). Cold Spring Harbor, New York: Cold spring Harbor Laboratory Press.2001)。本發(fā)明以玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因組DNA為模板，進行PCR擴增得到 1121bp的片段，利用非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)方法對該靶序列兩端進行延伸，5’端延伸得到534bp，3’端延伸得到702bp，拼接后得到長度為2073bp的全長序列，隨后在拼接序列兩端設計引物驗證延伸的正確性，比對發(fā)現(xiàn)擴增結果與拼接序列一致。該序列包含一個完整的開放閱讀框，共編碼464個氨基酸，與天藍色鏈霉菌A3 (2) 中nsdB基因核苷酸序列有87%同源性，將該基因命名為如前所述，具體的說，本實施例中的玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 /^0 ^基因序列的制備方法為
k、nsdBJa基因部分片段的獲得；
Bj1S0Si^基因5’端和3’端非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)； LnsdBmgh基因全長序列的驗證。步驟A是根據國際基因庫(GenBank)上天藍色鏈霉菌aso 基因(編號為SC07252) 的序列設計一對特異引物Ns8F和Ns8R，擴增玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因組DNA(對照菌株為天藍色鏈霉菌M145)，
PCR反應體系為模板DNA 50 ng，LA Taq酶1 U, 5 ymol 'L-I的上、下游引物各0.5 UL, 10 mmol · L-I的dNTP lyL,2XGC buffer I緩沖液12. 5 μ ，用無菌蒸餾水補充反應體系至 25 “1^屮0 反應程序為先951 5 min;然后 94°C 1 min,60°C 1 min，72°C 1 min30s，共35個循環(huán)；最后72°C 10 min，4°C保存。PCR產物在的瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，檢測結果如圖1所示(M為DL2000 marker，1是以M145基因組為模板，2是以 Men-myco-93-63基因組為模板)。將PCR產物連接到克隆載體pMD19_T上，并轉化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜，挑取3個陽性克隆進行測序，結果得到長度為1121bp的片段。在國際基因庫(GenBank)上進行序列分析，與天藍色鏈霉菌nsdB 基因的核苷酸序列同源性為86%。步驟B是根據步驟A中PCR的測序結果，設計5’端非特異引物錨定PCR(NPA-PCR) 特異性引物GSPl和GSP2 ；3’端非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)特異性引物GSP3和GSP4。 非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)擴增體系和程序為
第一輪反應為15 μ L體系包含1 U LA Taq酶、50 ng模板DNA、0. 2 μ M dNTP混合物、 10 μ L 2XGC buffer Ι、0· 1 μΜ SAPl (非特異引物錨定PCR通用引物)，用無菌蒸餾水補充反應體系至15 yL。PCR反應程序為94°C 5 min,30°C 3 min，以0. 2°C/ s升到65°C， 65°C 5 min。第二輪反應為第一輪反應體系中加入5 μ L引物GSPl (5’端延伸所用引物)或 GSP3 (3，端延伸所用引物)(終濃度為0.5 μΜ)。PCR反應程序為94°C 30 s，65°C 3 min，共 10 個循環(huán)；72°C 5 min。第三輪反應為第二輪PCR產物中另加2. 5 μ L SAP2 (非特異引物錨定PCR)(終濃度為 0.5 μΜ)和 2. 5yL 2XGC buffer I。PCR 反應程序為先 94°C 2 min ；然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 20 個循環(huán)；72°C 5 min。第四輪反應以1 μ L 50倍稀釋的第三輪產物為模板進行擴增，反應體系為0.5 μΜ GSP2(5’端延伸所用引物)或GSP4 (3’端延伸所用引物)，0.5 μ M SAP2,0. 2 μΜ dNTPs，2XGC buffer I 禾口 IU LA Taq 酶。PCR 反應程序為先 94°C 2 min ；然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共30個循環(huán)；72°C 5 min，4°C保存。PCR產物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，5，端檢測結果如圖2，3’端檢測如圖3 (其中M為DL2000 marker，1和2為 Men-myco-93-63)。將PCR產物按上述方法進行克隆，挑取3個陽性克隆進行測序并在國際基因庫(GenBank)上進行序列分析。結果為5，端延伸，擴增得到534bp的片段，與nsdB基因核苷酸序列同源性為91%。3’端延伸，擴增得到702bp的片段，與nsdB基因核苷酸序列同源性為81%。步驟C是根據步驟A中獲得的測序結果與步驟B中5’端和3’端的延伸結果進行序列拼接得到2073bp的全長序列。設計一對特異引物I3R和PF進行PCR擴增驗證拼接結果的正確性。PCR反應體系為模板DNA 50 ng，LA Taq酶1 U, 5 μ mol *L-1的上、下游引物各 0.5 yL, 10 mmol .L-I 的 dNTP lyL,2XGC buffer I 緩沖液 12. 5 μ ，用無菌蒸餾水補充反應體系至25 4 1^屮0 反應程序為先951 5 min;然后94°C 1 min，65°C 1 min, 72°C 3 min，共35個循環(huán)；最后72°C 10 min，4°C保存。PCR產物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，將PCR產物按上述方法進行克隆，挑取3個陽性克隆進行測序。該引物對在玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63中預期片段為194!3bp，電泳顯示擴增條帶大小與預期相符，如圖4所示(M為DL2000 marker, 1為Men-myco-93-63)。在國際基因庫(GenBank)上進行序列分析發(fā)現(xiàn)擴增結果與拼接序列一致，說明拼接結果正確。具體的說，上述制備方法中采用的各引物序列見表1
表1制備玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因的引物序列
引物名稱序列(5’ to3')Ns8FGTGGATCGACATGGGAGAGATNs8RCCATGGACAGGTAGTCGAAGAT
權利要求
1.一種玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 /^oB:基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，或與SEQ ID NO :1所示核苷酸編碼相同蛋白的核苷酸序列。
2.一種由權利要求1所述基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID N0:12所示的氨基酸序列。
3.含有權利要求1所述基因的載體，或進一步包括含有該載體的宿主。
4.權利要求1所述基因在制備轉基因植物或在提高植物抗蟲活性中的應用。
5.權利要求2所述蛋白在制備生物殺蟲劑或在殺滅植物害蟲中的應用。
6.一種制備權利要求1所述基因的方法，包括如下步驟1)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 IisdBmgh基因部分片段的獲得根據GenBank 登錄號11(^690的天藍色鏈霉MnsdB基因的序列設計一對特異引物NsSF GTGGATCGACATGGGAGAGAT 和 Ns8R CCATGGACAGGTAGTCGAAGAT, PCR 擴增玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63基因組DNA ；PCR產物電泳檢測，然后將PCR產物連接到克隆載體pMD19_T 上，并轉化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序；2 )玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 IisdBmgh基因5 ’端和3 ’端非特異引物錨定 PCR:根據步驟1)中PCR的測序結果，設計5’端非特異引物錨定PCR特異性引物GSPl GAGCATGAGGTCCATTCCCGTGA 和 GSP2 CGGACCAGACCGAGATCCTCAGTG ； 3，端非特異弓丨物錨定 PCR 特異性引物GSP3 :GACGCCCTGGACCTGATGAAGCTG和GSP4 GATGCAGATGTTCGACGAGGCGG,進行非特異引物錨定PCR擴增；PCR產物電泳檢測，然后將PCR產物連接到克隆載體PMD19-T上， 并轉化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中PCR反應體系為模板 DNA 50 ng, LA Taq 酶 1 U，5 μ mol · L-I 的上、下游引物各 0. 5 μ L, 10 讓ol ·廠1 的 dNTP lyL,2XGC buffer I緩沖液12. 5 μ ，用無菌蒸餾水補充反應體系至25 yL;PCR反應程序為先 95°C 5 min;然后 94°C 1 min,60°C 1 min，72°C 1 min30s，共；35 個循環(huán)；最后 72°C 10 min，4°C保存；隨后PCR產物在的瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，將PCR產物連接到克隆載體 PMD19-T上，并轉化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜，挑取3 個陽性克隆進行測序，在國際基因庫上進行序列分析獲得nsdBmgh基因的部分片段序列。
8.根據權利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)擴增體系和程序為第一輪反應為15 μ L體系包含1 U LA Taq酶、50 ng模板DNA、0. 2 μ M dNTP混合物、 10 μ L 2XGC buffer I、0. 1 μ M SAP1，用無菌蒸餾水補充反應體系至15 yL;PCR反應程序為94°C 5 min, 30°C 3 min，以 0. 2°C / s 升到 65°C，65°C 5 min ；第二輪反應為向第一輪反應體系中加入5 μ L引物GSPl或GSP3，其終濃度為0.5 μΜ； PCR 反應程序為94°C 30 s，65°C 3 min，共 10 個循環(huán)；72°C 5 min ；第三輪反應為向第二輪PCR產物中另加2. 5 yL SAP2，其終濃度為0. 5 μΜ和2.5yL 2XGC buffer I ；PCR 反應程序為先 94°C 2 min;然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 20 個循環(huán)；72°C 5 min ；第四輪反應以1 PL 50倍稀釋的第三輪產物為模板進行擴增，反應體系為0.5 μΜ GSP2 或 GSP4, 0.5 μΜ SAP2,0. 2 μ M dNTPs，2XGC buffer I 禾口 IU LA Taq 酶；PCR 反應程序為先 94°C 2 min;然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 30 個循環(huán)；72°C 5 min，4°C保存；隨后，將PCR產物在的瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，PCR產物連接到克隆載體 PMD19-T上，并轉化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜，挑取3 個陽性克隆進行測序，在國際基因庫上進行序列分析獲得基因的5’端和3’端基因序列。
9.根據權利要求6-8任意一項所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)之后，所述的制備方法還包括步驟1^nsdBmgh基因全長序列的驗證。
10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于，步驟3)是根據步驟1)中獲得的測序結果與步驟Β中5’端和3’端的延伸結果進行序列拼接，設計一對特異引物ra: ACGACCGAACTTCTCTCGATGG和 PF :ATACAGATCCCTTCGTGTGCCTGT 進行 PCR 擴增驗證拼接結果的正確性；其中，所述PCR反應體系為模板DNA 50 ng，LA Taq酶1 U,5 ymol*L_l的上、 下游引物各 0. 5 μ L, 10 mmol · Γ1 的 dNTP 1 μ L，2 XGC buffer I 緩沖液 12. 5 μ ，用無菌蒸餾水補充反應體系至25 “1^屮0 反應程序為先951 5 min;然后94°C 1 min,65°C 1 min,72°C 3 min，共35個循環(huán)；最后72°C 10 min，4°C保存；PCR產物在的瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，將PCR產物按上述方法進行克隆，挑取3個陽性克隆進行測序，在國際基因庫上進行序列分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及玫瑰黃鏈霉菌(Streptomycesroseoflavus)Men-myco-93-63的nsdBmgh基因、制備方法及其應用。本發(fā)明以天藍色鏈霉菌A3(2)抗生素代謝途徑中重要的負調控基因nsdB的序列自主設計引物Ns8F和Ns8R，擴增玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因組DNA,得到了1121bp的片段；隨后利用非特異引物錨定PCR(NPA-PCR)方法對該靶序列兩端進行延伸，獲得玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63nsdBmgh基因。nsdBmgh基因的制備為進一步研究和探明玫瑰黃鏈霉菌抗生素合成代謝途徑和調控機理提供了又一重要依據，為抗生素高產基因工程菌株的獲得奠定了重要基礎。
文檔編號C12N15/82GK102212533SQ20111009622
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月18日 優(yōu)先權日2011年4月18日
發(fā)明者冀紅柳, 劉大群, 孟慶芳, 張娜, 張汀, 張立榮, 李亞寧, 李星 申請人:河北農業(yè)大學