專利名稱：一步法檢測豬藍(lán)耳病病毒核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種一步法檢測豬藍(lán)耳病病毒核酸的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有豬藍(lán)耳病病毒核酸的檢測方法有抗體檢測和抗原檢測?？贵w檢測往往滯后于抗原檢測，從而不能及時準(zhǔn)確的快速發(fā)現(xiàn)疫病，導(dǎo)致疫病的爆發(fā)流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失；現(xiàn)有抗原檢測方法中病毒分離時間長、環(huán)境設(shè)施要求高，技術(shù)水平要求高，而農(nóng)村及邊遠(yuǎn)地區(qū)廣大中小養(yǎng)殖戶乃至大中型養(yǎng)殖場由于環(huán)境設(shè)施和人員技術(shù)不合要，預(yù)警或可疑標(biāo)本只能送到大型檢測中心檢測；而且其靈敏度不高；并且存在如何保存RNA不降解，一直是分子生物學(xué)領(lǐng)域的難題，迄今沒有簡便可行的保存方法；傳統(tǒng)方法運(yùn)輸和儲存這些病毒標(biāo)本是需要專業(yè)的冰凍和運(yùn)輸技術(shù)的，這種方法成本高而且需要一定的專業(yè)知識，不易推廣， 從而不能及時和準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)疫病。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種一步法檢測豬藍(lán)耳病病毒核酸的方法。以實現(xiàn)現(xiàn)采樣、運(yùn)輸和儲存方便可行，操作步驟簡單快捷，檢測靈敏、準(zhǔn)確。一步法檢測豬藍(lán)耳病病毒核酸的方法，包括以下步驟 (一)樣品采集和處理
(1)點(diǎn)樣將采集的80-100U1動物血液樣品滴加至FTA卡樣品區(qū)內(nèi)，自然干燥1小時，于陰涼干燥處儲存0-9天。(2)取樣用打孔器將FTA樣品區(qū)整個樣品盤打下，把樣品盤放入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增管中；
(3)孵育加入400μ L核糖核酸處理緩沖液(IOmM三羥甲基氨基甲烷_HC1，ρΗ 8. 0，0. ImM EDTA, 200 μ g/mL糖原和2mM 二硫蘇糖醇)，并上下吹打兩次，蓋上蓋子，在冰上孵育15分鐘，每5分鐘混合一次；
(4)純化加入40ul3M的乙酸鈉(pH5. 2)和400ul冰預(yù)冷的異丙醇，從洗滌溶液中沉淀核糖核酸RNA，在-20°C下孵育1小時；把管放置在微量離心管內(nèi)，在12，000轉(zhuǎn)/分條件下離心5分鐘，去除上清液；再用冰預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀顆粒，在12，000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；去除上清液；
(5)室溫自然干燥約5分鐘
(6)把沉淀重懸在15-50 μ 1三羥甲基氨基甲烷-EDTA緩沖液中。(二)測量
(1)設(shè)計針對通用型豬藍(lán)耳病病毒的特異性引物和探針，并在探針上標(biāo)記好FAM和 TAMARA熒光基團(tuán)所述特異性引物是上游引物序列5’GGCAAATGATAACCACGCA 3’;下游引物序列 5，GCATATTTGACAAGGTTTACCACT 3，；所述探針序列是 5，CGGCGCCACGACGGTCAACG 3，， 在其5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，在其3’端標(biāo)記TAMARA淬滅基團(tuán)；(2)配制和優(yōu)化檢測體系和反應(yīng)條件，反應(yīng)體系為25或50ul的三羥甲基氨基甲烷-HCl (ρΗ7· 8-9. 0)，上下游引物各0. 1-0. 5uM,脫氧核苷酸混合物各100_400uM， 探針0.1-0. 5uM，莫洛尼小鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶100-300U，熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶 1-5U, Mg2+_4-8M，均一化參比染料R0X300-500nM，每反應(yīng)加入前述重懸在三羥甲基氨基甲烷-EDTAE緩沖液中樣本l_15ul。(3)用熒光PCR檢測儀ABI 7300上機(jī)檢測，設(shè)置反應(yīng)程序為
權(quán)利要求
1.一步法檢測豬藍(lán)耳病病毒核酸的方法，包括樣品采集和處理和檢測，其特征在于，所述樣品采集將80-100U1動物血液樣品滴加至FTA卡樣品區(qū)內(nèi)；所述檢測包括(1)設(shè)計針對通用型豬藍(lán)耳病病毒的特異性引物和探針，并在探針上標(biāo)記好FAM和 TAMARA熒光基團(tuán)所述特異性引物是上游引物序列5’GGCAAATGATAACCACGCA 3’;下游引物序列 5，GCATATTTGACAAGGTTTACCACT 3，；所述探針序列是 5，CGGCGCCACGACGGTCAACG 3，， 在其5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，在其3’端標(biāo)記TAMARA淬滅基團(tuán)；(2)配制和優(yōu)化檢測體系和反應(yīng)條件，反應(yīng)體系為25或50ul的三羥甲基氨基甲烷-HCl (ρΗ7· 8-9. 0)，上下游引物各0. 1-0. 5uM,脫氧核苷酸混合物各100_400uM， 探針0.1-0. 5uM，莫洛尼小鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶100-300U，熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶 1-5U, Mg2+_4-8M，均一化參比染料R0X300-500nM，每反應(yīng)加入前述重懸在三羥甲基氨基甲烷-EDTAE緩沖液中樣本l_15ul。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步法檢測豬藍(lán)耳病病毒核酸的方法，其特征在于，所述樣品的處理包括以下步驟(1)取樣用打孔器將FTA樣品區(qū)整個樣品盤打下，把樣品盤放入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增管中；(2)孵育加入400 μ L ρΗ 8.0的核糖核酸處理緩沖液，并上下吹打兩次，蓋上蓋子，在冰上孵育15分鐘，每5分鐘混合一次；(3)純化加入40ul 3M 的乙酸鈉和400ul冰預(yù)冷的異丙醇，從洗滌溶液中沉淀核糖核酸RNA，在-20°C下孵育1小時；把管放置在微量離心管內(nèi)，在12，000轉(zhuǎn)/分條件下離心5分鐘，去除上清液；再用冰預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀顆粒，在12，000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；去除上清液；(4)室溫自然干燥約5分鐘把沉淀重懸在15-50 μ 1三羥甲基氨基甲烷-EDTA緩沖液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步法檢測豬藍(lán)耳病病毒核酸的方法，其特征在于，所述檢測是用熒光PCR檢測儀ABI 7300上機(jī)檢測，設(shè)置反應(yīng)程序為
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步法檢測豬藍(lán)耳病病毒核酸的方法，其特征在于，核糖核酸處理緩沖液是IOmM三羥甲基氨基甲烷-HC1， 0. ImM EDTA, 200 μ g/mL糖原和2mM 二硫蘇糖醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步法檢測豬藍(lán)耳病病毒核酸的方法，其特征在于，所述 FTA卡是采用英國產(chǎn)Whatman FTA卡；是一種經(jīng)化學(xué)試劑特殊處理的棉纖維卡片。
全文摘要
一步法檢測豬藍(lán)耳病病毒核酸的方法，包括樣品采集和處理和檢測，其樣品采集是將動物血液樣品滴加至FTA卡樣品區(qū)內(nèi)；所述檢測包括(1)設(shè)計針對通用型豬藍(lán)耳病病毒的特異性引物和探針，并在探針上標(biāo)記好FAM和TAMARA熒光基團(tuán)；(2)配制和優(yōu)化檢測體系和反應(yīng)條件，反應(yīng)體系為25或50μl的三羥甲基氨基甲烷-HCl(pH7.8-9.0)，上下游引物各0.1-0.5μM，脫氧核苷酸混合物各100-400μM，探針0.1-0.5μM，莫洛尼小鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶100-300U，熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶1-5U，Mg2+-4-8M，均一化參比染料ROX300-500nM，每反應(yīng)加入前述重懸在三羥甲基氨基甲烷-EDTAE緩沖液中樣本1-15μl。本發(fā)明樣品采集簡便，使含有RNA樣品的FTA卡可按普通郵件郵寄到任何一個中心試驗室進(jìn)行檢測；降低污染風(fēng)險，提高了檢測靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK102181580SQ20111009667
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月18日
發(fā)明者劉東波, 張柳瑩, 王睿 申請人:湖南農(nóng)安生物技術(shù)有限公司