專利名稱：D-天冬酰胺的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種D-天冬酰胺的制備方法，屬于化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
D-天冬酰胺是一種重要的藥物合成中間體，可用于制備具有良好的催產(chǎn)性和降低血壓性的催產(chǎn)素，亦可以用作重要的藥物中間體β-Homo-天冬酰胺原料。此外，D-天冬酰胺還常用于藥理學(xué)方面的研究，研究表明它對(duì)霧化氨水刺激引起的小鼠咳嗽以及乙酰膽堿和組織胺引起的豚鼠哮喘有明顯的抑制作用，還可用于治療支氣管炎。D-天冬酰胺的合成方法文獻(xiàn)報(bào)道很少，國(guó)內(nèi)有學(xué)者(中國(guó)專利200810020843. 2) 以DL-天冬氨酸甲酯為原料，經(jīng)化學(xué)拆分得到D-天冬氨酸-β -甲酯；再將D-天冬氨酸-β-甲酯進(jìn)行氨解得到D-天冬酰胺。制備過程所用拆分劑價(jià)格昂貴，D-天冬酰胺收率低。目前制備D-型氨基酸的主流方法是以廉價(jià)的L-氨基酸為原料，經(jīng)化學(xué)或生物的方法消旋得到DL-氨基酸，再用生物或化學(xué)拆分的方法獲得D-型氨基酸。但作為制備D-天冬酰胺的原料DL-天冬酰胺難以用L-天冬酰胺經(jīng)化學(xué)消旋得到，主要是由于L-天冬酰胺的酰胺基不穩(wěn)定，消旋過程中易分解。因此，DL-天冬酰胺基本上是直接用化學(xué)方法合成的。DL-天冬酰胺的化學(xué)合成方法，主要有(1)以順酐(馬來酸酐)為原料，經(jīng)一系列化學(xué)反應(yīng)，最后合成DL-天冬酰胺(J. Am. Chem. Soc.，75，330-332，1953 ；精細(xì)化工，17 (2)， 112-114,2000) ； (2)以DL-天冬氨酸為原料，與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)生成鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸，再與醋酐回流反應(yīng)得鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐，再經(jīng)氨解、脫保護(hù)基得到DL-天冬酰胺(J. Chem. Soc.，3315，1949)。我們對(duì)方法( 進(jìn)行了改進(jìn)，不僅可以用DL-天冬氨酸也可以用L-天冬氨酸為原料，合成DL-天冬酰胺。起初試圖利用微生物中的L-天冬酰胺α -脫羧酶，轉(zhuǎn)化DL-天冬酰胺中L型對(duì)映體，分離制備D-天冬酰胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種微生物中的L-天冬酰胺α-脫羧酶的活性都很低，難以用此方法獲得D-天冬酰胺。最后通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，埃希氏菌Ε. coli AS 1.588菌體中的L-天冬酰胺酶能專一水解L-天冬酰胺為 L-天冬氨酸，通過等電點(diǎn)結(jié)晶和離子交換柱完成了 D-天冬酰胺與L-天冬氨酸的分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用廉價(jià)的DL-天冬氨酸或L-天冬氨酸為原料，通過化學(xué)合成與生物轉(zhuǎn)化制備D-天冬酰胺的方法、其技術(shù)方案為一種D-天冬酰胺的制備方法，其特征在于采用以下步驟(1)在130°C 180°C條件下，L-天冬氨酸與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)生成鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸；(2)步驟⑴獲得鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸與醋酸酐及消旋試劑一起回流反應(yīng)，生成鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐；(3)將步驟⑵獲得鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐與氨的四氫呋喃溶液反應(yīng)，得到鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺；
3
(4)將步驟(3)得到鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺與水合胼反應(yīng)，脫除鄰苯二甲?；玫紻L-天冬酰胺；(5)將步驟(4)得到DL-天冬酰胺，利用微生物的L-天冬酰胺酶，專一性水解其中的L-天冬酰胺，分離得D-天冬酰胺與L-天冬氨酸。所述的D-天冬酰胺的制備方法，在步驟(1)中，L-天冬氨酸與鄰苯二甲酸酐的摩爾比為0.8 1.2，反應(yīng)溫度130°C 180°C，反應(yīng)時(shí)間20 60分鐘。所述的D-天冬酰胺的制備方法，在步驟⑵中，醋酸酐與鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸的摩爾比為1. 8 10，消旋試劑用量為原料量的0. 1 1%，回流反應(yīng)時(shí)間為20 60分鐘。所述的D-天冬酰胺的制備方法，在步驟(2)中消旋試劑指的是鄰苯二甲酰亞胺的堿金屬鹽或乙酸鈉。所述的D-天冬酰胺的制備方法，在步驟(3)中氨的四氫呋喃溶液中氨的質(zhì)量百分比濃度為1 10%，氨與鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐摩爾比為1. 0 10，反應(yīng)溫度為0 40 "C。所述的D-天冬酰胺的制備方法，在步驟(4)中水合胼與鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺摩爾比為1. 0 5. 0，在乙醇中回流反應(yīng)30 60分鐘。所述的D-天冬酰胺的制備方法，在步驟(5)中微生物指的是埃希氏菌E. coli AS 1. 588菌株。所述的D-天冬酰胺的制備方法，在步驟(5)中專一性水解反應(yīng)指的是利用已培養(yǎng)的含酶細(xì)胞與DL-天冬酰胺溶液混合，再加入表面活性劑吐溫-80或十六烷基三甲基溴化銨，在溫度觀 45°C、pH值6. 5 8. 5條件下，進(jìn)行酶促反應(yīng)。所述的D-天冬酰胺的制備方法，在步驟( 中分離D-天冬酰胺與L-天冬氨酸是采用等電點(diǎn)結(jié)晶法和離子交換法。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，在化學(xué)合成DL-天冬酰胺以及生物轉(zhuǎn)化制備D-天冬酰胺方面都有著顯著的有益效果，主要表現(xiàn)在(一 )化學(xué)合成DL-天冬酰胺1、鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸與醋酸酐及少量消旋試劑一起回流反應(yīng)，直接生成鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐，擴(kuò)大了制備DL-天冬酰胺原料范圍，不僅可以使用DL-天冬氨酸，也可以直接使用L-天冬氨酸為原料，制備DL-天冬酰胺；2、以四氫呋喃的氨溶液替代乙醚氨溶液，提高了反應(yīng)先擇性；3、采用乙醇回流脫除保護(hù)基(鄰苯二甲?；?，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，顯著提高了產(chǎn)物的收率。( 二)生物轉(zhuǎn)化制備D-天冬酰胺1、采用E. coli. ASl. 588菌株，DL-天冬酰胺為原料，反應(yīng)條件溫和，L-天冬酰胺酶
專一性強(qiáng)、活性高，轉(zhuǎn)化效率高；2、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物D-天冬酰胺與L-天冬氨酸理化性質(zhì)有較大差異，可以用簡(jiǎn)單的等電點(diǎn)結(jié)晶法分離，分離成本低；3、原料來源豐富，價(jià)格低廉，整過制備過程操作簡(jiǎn)便，適合大規(guī)模生產(chǎn)。具體實(shí)施方法
實(shí)施例11)148克鄰苯二甲酸酐與133克L-天冬氨酸混合，升溫至155°C，反應(yīng)50分鐘，加水1000毫升溶解，冷卻析出晶體；過濾、干燥得252克鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸；2)252克鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸和0. 5克鄰苯二甲酰亞胺的鈉鹽加入到300毫升醋酸酐中，回流反應(yīng)30分鐘，冷卻結(jié)晶，過濾、干燥得到鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐2 克；3) 122. 5克鄰苯二甲酰_DL_天冬氨酸酐加入到200毫升含氨5%的四氫呋喃氨溶液中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸出并回收四氫呋喃，固體物加入600毫升水，用6M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至9使固體物全部溶解，再用6M的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3，重新析出固體產(chǎn)物，過濾、 干燥得98克鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺；4) 79克鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺和20克80 %的水合胼分別加入到300毫升無水乙醇中，回流反應(yīng)60分鐘，冷卻、過濾收集固體物，將所得固體加入到300毫升水中，用6M 的鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3，過濾除去固體，酸性濾液用氨水調(diào)節(jié)pH值到6，減壓濃縮、冷卻結(jié)晶、 過濾、干燥得到36. 2克DL-天冬酰胺；5)將E.coli. ASl. 588菌株培養(yǎng)在含蛋白胨10克，NaCl 5克，牛肉膏3克，L-天冬酰胺1克的1000毫升培養(yǎng)基中，維持pH 7. 0，溫度35°C，搖瓶振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，4000rpm 離心15分鐘得濕細(xì)胞。將所得細(xì)胞加入到含DL-天冬酰胺36克、吐溫-80 0. 03克的600 毫升PH為7的硼酸緩沖液中，37°C振蕩反應(yīng)36小時(shí)，L-天冬酰胺轉(zhuǎn)化率大于98%。將反應(yīng)液用6M的NaOH調(diào)pH值到6，升溫到60°C，活性碳脫色，過濾除去菌體，濾液用6M的鹽酸調(diào)PH值至3，減壓濃縮到120毫升，冷卻結(jié)晶，過濾、干燥得13克L-天冬氨酸；L-天冬氨酸結(jié)晶母液加水稀釋，用6M的NaOH調(diào)pH值到5，上大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂D201吸附 L-天冬氨酸，含D-天冬酰胺的流出液調(diào)節(jié)pH值到6，活性碳脫色、濾液堿壓濃縮至50毫升， 加入等體積的95%乙醇，析出晶體，過濾、干燥得15. 1克D-天冬酰胺，結(jié)晶母液循環(huán)套用。實(shí)施例21)178克鄰苯二甲酸酐與133克L-天冬氨酸混合，升溫至180°C，反應(yīng)20分鐘，加水1000毫升溶解，活性碳脫色，冷卻析出晶體；過濾、干燥得255克鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸；2)255克鄰苯二甲酰_L_天冬氨酸和1. 0克乙酸鈉加入到300毫升醋酸酐中，回流反應(yīng)20分鐘，冷卻結(jié)晶，過濾、干燥得到鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐220克；3) 122. 5克鄰苯二甲酰_DL_天冬氨酸酐加入到300毫升含氨10%的四氫呋喃氨溶液中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸出并回收四氫呋喃，固體物加600毫升水，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) PH值至9使固體物全部溶解，再用6M的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3，重新析出固體產(chǎn)物，過濾、干燥得90克鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺；4) 79克鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺和40克80 %的水合胼分別加入到300毫升無水乙醇中，回流反應(yīng)反應(yīng)20分鐘，冷卻、過濾收集固體物，將所得固體加入到300毫升水中， 用6M的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3，過濾除去固體，酸性濾液用氨水調(diào)節(jié)pH值到6，減壓濃縮、冷卻結(jié)晶、過濾、干燥得到36. 4克DL-天冬酰胺；5)以下操作參數(shù)和步驟與實(shí)施例1完全相同。實(shí)施例3
1)120克鄰苯二甲酸酐與133克L-天冬氨酸混合，升溫至130°C，反應(yīng)60分鐘，加水1000毫升溶解，冷卻析出晶體；過濾、干燥得180克鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸；2) 180克鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸和0. 5克鄰苯二甲酰亞胺的鈉鹽加入到300毫升醋酸酐中，回流反應(yīng)60分鐘，冷卻結(jié)晶，過濾、干燥得到鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐162 克；3) 122. 5克鄰苯二甲酰_DL_天冬氨酸酐加入到300毫升含氨4%的四氫呋喃氨溶液中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸出并回收四氫呋喃，固體物加600毫升水并用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) PH值至9使固體物全部溶解，再用6M的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3，重新析出固體產(chǎn)物，過濾、干燥得92克鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺；4)79克鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺和25克80 %的水合胼分別加入到300毫升無水乙醇中，回流反應(yīng)反應(yīng)40分鐘，冷卻、過濾收集固體物，將所得固體加入到300毫升水中， 用6M的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3，過濾除去固體，酸性濾液用氨水調(diào)節(jié)pH值到6，減壓濃縮、冷卻結(jié)晶、過濾、干燥得到35. 9克DL-天冬酰胺；5)以下操作參數(shù)和步驟與實(shí)施例1完全相同。實(shí)施例41)化學(xué)合成DL-天冬酰胺(實(shí)施例1中的步驟1至4)的操作參數(shù)及步驟與實(shí)施例1完全相同；2)將E.coli. ASl. 588菌株培養(yǎng)在含玉米漿5克，NaCl 5克，牛肉膏10克，L-天冬酰胺1克的1000毫升培養(yǎng)基中，維持pH 7. 2，溫度37°C，搖瓶振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，4000rpm 離心15分鐘得濕細(xì)胞。將所得細(xì)胞加入到含DL-天冬酰胺36克、CTAB 0. 02克的600毫升 pH為7. 2的Tris緩沖液中，35°C振蕩反應(yīng)48小時(shí)，L-天冬酰胺轉(zhuǎn)化率大于95%。將反應(yīng)液用6M的NaOH調(diào)pH值到6，升溫到60°C，加活性碳脫色，過濾除去菌體，濾液用6M的鹽酸調(diào)PH值至3，減壓濃縮到120毫升，冷卻結(jié)晶，過濾、干燥得12. 6克L-天冬氨酸；L-天冬氨酸結(jié)晶母液加水稀釋，用6M的NaOH調(diào)pH值到5，上弱酸型陽離子交換樹脂101吸附D-天冬酰胺，吸附飽和后，用1 %稀氨水洗脫，收集洗脫液，調(diào)節(jié)PH值到6，活性碳脫色、濾液堿壓濃縮至50毫升，加入等體積的95%乙醇，析出晶體，過濾、干燥得14. 8克D-天冬酰胺，結(jié)晶母液循環(huán)套用。
權(quán)利要求
1.一種D-天冬酰胺的制備方法，其特征在于采用以下步驟(1)在130°C 180°C條件下，L-天冬氨酸與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)生成鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸；(2)步驟(1)獲得鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸與醋酸酐及消旋試劑一起回流反應(yīng)，生成鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐；(3)將步驟( 獲得鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐與氨的四氫呋喃溶液反應(yīng)，得到鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺；(4)將步驟C3)得到鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺與水合胼反應(yīng)，脫除鄰苯二甲?；玫?DL-天冬酰胺；(5)將步驟(4)得到DL-天冬酰胺，利用微生物的L-天冬酰胺酶，專一性水解其中的 L-天冬酰胺，分離得D-天冬酰胺與L-天冬氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-天冬酰胺的制備方法，其特征在于在步驟(1)中，L-天冬氨酸與鄰苯二甲酸酐的摩爾比為0. 8 1. 2，反應(yīng)溫度130°C 180°C，反應(yīng)時(shí)間20 60 分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-天冬酰胺的制備方法，其特征在于在步驟O)中，醋酸酐與鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸的摩爾比為1.8 10，消旋試劑用量為原料量的0. 1 1%， 回流反應(yīng)時(shí)間為20 60分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-天冬酰胺的制備方法，其特征在于在步驟( 中消旋試劑指的是鄰苯二甲酰亞胺的堿金屬鹽或乙酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-天冬酰胺的制備方法，其特征在于在步驟(3)中氨的四氫呋喃溶液中氨的質(zhì)量百分比濃度為1 10%，氨與鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐摩爾比為 1. 0 10，反應(yīng)溫度為0 40°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-天冬酰胺的制備方法，其特征在于在步驟(4)中水合胼與鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺摩爾比為1. 0 5. 0，在乙醇中回流反應(yīng)30 60分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-天冬酰胺的制備方法，其特征在于在步驟( 中微生物指的是埃希氏菌E. coli AS 1. 588菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-天冬酰胺的制備方法，其特征在于在步驟(5)中專一性水解反應(yīng)指的是利用已培養(yǎng)的含酶細(xì)胞與DL-天冬酰胺溶液混合，再加入表面活性劑吐溫-80或十六烷基三甲基溴化銨，在溫度觀 45°C、pH值6. 5 8. 5條件下，進(jìn)行酶促反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-天冬酰胺的制備方法，其特征在于在步驟(5)中分離 D-天冬酰胺與L-天冬氨酸是采用等電點(diǎn)結(jié)晶法和離子交換法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種D-天冬酰胺的制備方法，其特征在于采用以下步驟(1)在130℃～180℃條件下，L-天冬氨酸與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)，生成鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸；(2)步驟(1)獲得鄰苯二甲酰-L-天冬氨酸與醋酸酐及消旋試劑一起回流反應(yīng)20～60分鐘，生成鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐；(3)將步驟(2)獲得鄰苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐與氨的四氫呋喃溶液反應(yīng)，得到鄰苯二甲酰-DL-天冬酰胺；(4)將步驟(3)得到鄰苯二甲酰-DL-天冬酰氨與水合肼反應(yīng)，脫除鄰苯二甲酰基得到產(chǎn)物DL-天冬酰胺；(5)將步驟(4)得到DL-天冬酰胺利用微生物的L-天冬酰胺酶，專一性水解其中的L-天冬酰胺，分離得D-天冬酰胺與L-天冬氨酸。
文檔編號(hào)C12P13/20GK102226208SQ20111009683
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者崔洪友, 錢紹松, 陳月虎 申請(qǐng)人:山東理工大學(xué)