專利名稱：一種耐高溫中性木聚糖酶基因及含有該基因的工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種耐高溫中性木聚糖酶基因及含有該基因的工程菌。
背景技術(shù)：
木聚糖酶(1，4_β-D-xylanase ;EC3. 2. 1.8)是一種重要的工業(yè)用酶，在造紙工業(yè)、食品、能源、飼料以及環(huán)境等領(lǐng)域中顯示了廣闊的應(yīng)用前景，特別是在紙漿生物漂白中的巨大應(yīng)用潛力早已引起各界的高度關(guān)注。木聚糖酶處理各種漿料的作用是降解漿中的木聚糖，使?jié){中半纖維素的含量降低，并使纖維素細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得松弛，同時(shí)使與漿中殘余木素連接的半纖維素降解，形成脫木素或有利于脫木素的狀態(tài)。通過木聚糖酶的預(yù)處理，不僅可以提高紙漿的白度，降低打漿的能耗，改善漿料的強(qiáng)度性能，而且，可以減少后繼工序漂劑的用量，降低廢液的毒性，減輕環(huán)境污染。目前，以無(wú)元素氯和全無(wú)氯漂白工藝為代表的紙漿綠色清潔漂白已經(jīng)成為世界各國(guó)造紙業(yè)紙漿漂白發(fā)展的必然趨勢(shì)，木聚糖酶酶法助漂新工藝已在歐洲和北美的30余家大型紙廠得到應(yīng)用，成為生物技術(shù)在造紙工業(yè)應(yīng)用最成功的一例。其中，加拿大已有約10 % 的硫酸鹽法紙漿廠采用了該項(xiàng)新工藝。丹麥諾維信公司和美國(guó)山道斯化學(xué)公司等多家酶制劑廠商，紛紛推出了專門用于紙漿處理的木聚糖酶和纖維素酶新產(chǎn)品，但到目前為止，工業(yè)上用于紙漿漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最適反應(yīng)溫度大多在50°C左右，眾所周知， 紙漿蒸煮和漂白基本都是在高溫和強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行的，使得現(xiàn)有的低溫酸性木聚糖酶產(chǎn)品在此領(lǐng)域的應(yīng)用受到了極大的限制，另外，在飼料和食品領(lǐng)域，木聚糖酶應(yīng)用在飼料的造粒和食品的焙烤工序中，仍然要求所用的木聚糖酶在高溫條件下能夠保持較高的酶活，因此，研究開發(fā)耐高溫的木聚糖酶產(chǎn)品將會(huì)帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。國(guó)外對(duì)木聚糖酶的研究已達(dá)到了分子水平，自上世紀(jì)七十年代末開展木聚糖酶基因的研究工作以來，已有150多種來自真菌和細(xì)菌的木聚糖酶基因被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)° 其中，Ossi Turunen 等人使用 Swiss-pdbviewer 對(duì)來源于 Trichoderma ressei 的 GHll家族木聚糖酶XYNII的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；并用PCR的方法在XYNII中引入5個(gè)Arg點(diǎn)突變時(shí)，突變酶在65°C的半衰期提高4-5倍，最適pH也有所提高；Miyazaki K等人對(duì)來源于 Bacillus subtilis的木聚糖酶基因運(yùn)用DNA shuffling技術(shù)進(jìn)行研究，獲得了一株最適反應(yīng)溫度提高了 10°C，60°C時(shí)熱穩(wěn)定性提高了 M倍的突變酶；2009年，Ismail Akyol等克隆到Neocallimastix sp. GMLF2的木聚糖酶基因xyn2A，并在大腸桿菌中得到表達(dá)，其最適作用溫度和PH分別為50°C和6. 5。我國(guó)在木聚糖酶方面的研究起步較晚，但發(fā)展迅速。上世紀(jì)八十年代初期，中國(guó)科學(xué)院微生物所在張樹政院士的帶領(lǐng)下，開始了我國(guó)對(duì)木聚糖酶的早期研究工作，首次從海棗曲酶(Aspergillus phoe-nicis)中純化得到了四種木聚糖酶酶I、酶II、酶III和酶IV，并深入研究了活力較高的組分酶III的酶學(xué)性質(zhì)?！熬盼濉逼陂g，山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曲音波教授等開展了木聚糖酶在造紙方面的應(yīng)用研究，從堿性假單胞菌sp. G6-2分離出兩種木聚糖酶XynA和XynB。目前，我國(guó)對(duì)木聚糖酶的研究大多停留在產(chǎn)酶菌株的篩選、酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)研究方面，部分課題已涉及木聚糖酶的分子生物學(xué)研究、 木聚糖酶基因克隆、表達(dá)和重組。Chen等用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)來源于真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶進(jìn)行定向進(jìn)化研究，獲得了比野生型蛋白質(zhì)耐堿性更強(qiáng)的木聚糖酶。09年Yingguo Bai等從云南溫泉中分離到產(chǎn)木聚糖酶的菌株thermoacidophilic Alicyclobacillus sp. A4，克隆得到木聚糖酶基因XynA4，并在大腸桿菌中表達(dá)。測(cè)得該木聚糖酶XynA4的最適作用pH和最適作用溫度分別為7.0和55°C。Jing Wang等在造紙廠污水中分離到產(chǎn)堿性木聚糖酶的Baci llus pumilus BYG野生型菌株，該木聚糖酶的最適作用 PH為8. 0-9. 0，最適作用溫度50°C，并克隆到木聚糖酶基因XynBYG，該基因長(zhǎng)度為687bp， 編碼2 個(gè)氨基酸，成功應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)將該酶的最適作用溫度提高了 5°C。據(jù)統(tǒng)計(jì)， 目前國(guó)內(nèi)木聚糖酶的研究中，木聚糖酶的最適作用溫度最高為85°C，而其最適作用pH為 6. 5，來自于2009年新疆大學(xué)的Wei Zhang等將嗜熱網(wǎng)團(tuán)菌(Dictyoglomus thermophilum Rt46B. 1)的木聚糖酶基因xynB在Bacillus subtilis中表達(dá)后獲得的木聚糖酶。綜上可見，國(guó)內(nèi)外各研究機(jī)構(gòu)正致力于獲得不同來源的具有一定優(yōu)良性質(zhì)的木聚糖酶基因，并且構(gòu)建合適的工程菌株，使其更適合工業(yè)應(yīng)用的極端條件，開拓其更廣的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過產(chǎn)木聚糖酶菌種的篩選，從而獲得編碼耐高溫中性木聚糖酶的基因，并且進(jìn)一步構(gòu)建能高效表達(dá)此耐高溫中性木聚糖酶的基因工程菌。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下一種耐高溫中性木聚糖酶基因，基因序列見序列1。而且，具體方法如下根據(jù)已報(bào)道木聚糖酶基因，分析其保守序列，設(shè)計(jì)本發(fā)明的耐高溫中性木聚糖酶基因的擴(kuò)增引物如下上游引物為序列2，下游引物為序列3，擴(kuò)增模板為坎皮納斯類芽孢桿菌基因組DNA，其擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95°C 5min ； 94°C 45S，55°C 45S，72°C 90S, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延長(zhǎng) IOmin ；擴(kuò)增體系50 μ L :ddH20 35. 5 μ L, IOXbuffer 5 μ L, dNTPs 2. 5mmol/L 每個(gè) 5 μ L,上游引物ΙΟμ θΙ/L 1. 5μ L，下游引物 ΙΟμ θΙ/L 1. 5 μ L，DNA 模板 1 μ L，TaqDNA 聚合酶0.5yL;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到1134bp的單一條帶，回收PCR產(chǎn)物，得到耐
高溫中性木聚糖酶全基因；一種序列1的耐高溫中性木聚糖酶基因的基因工程菌。而且，宿主菌為大腸桿菌E. coli BL21。而且，構(gòu)建方法如下(1)重組質(zhì)粒ρΕΤ-XynGl-l的構(gòu)建與鑒定將XynGl-I基因的PCR純化產(chǎn)物與載體pET_22b (+)經(jīng)Hind III和XhoI雙酶切后，分別用小量DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，應(yīng)用DNA連接試劑盒的Solution I在16°C 的條件下連接12h，將目的基因XynGl-I定向連接至載體pET_22b (+)，將連接產(chǎn)物應(yīng)用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Amp的LA培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)后提質(zhì)粒，用Hind III和B10I雙位點(diǎn)單、雙酶切鑒定，測(cè)序；(2)大腸桿菌E. coli BL21基因工程菌的構(gòu)建將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒ρΕΤ-XynGl-l應(yīng)用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下本發(fā)明提供了一種來源于坎皮納斯類芽孢桿菌(TCCC11578)的耐高溫中性木聚糖酶基因以及帶有該基因序列的E. coli BL21基因工程菌，本發(fā)明提供并表達(dá)的基因區(qū)別于已報(bào)道的木聚糖酶基因序列，并在個(gè)別氨基酸組成上有差異，該重組酶的最適作用溫度和最適PH分別為60°C和7.0，在？!17.0、701保溫lh，相對(duì)酶活在65%以上，在pH9，溫度 60°C條件下lh，相對(duì)酶活在60%以上。本發(fā)明的木聚糖酶在高溫下有良好的穩(wěn)定性，適合造紙、食品和飼料等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明的耐高溫中性木聚糖酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(其中M為 DNAMarker 從上到下分子量分別為 IOOOObp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、 3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，1 為以坎皮納斯類芽孢桿菌基因組為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增到的木聚糖酶基因XynGl-I)；圖2為本發(fā)明的耐高溫中性木聚糖酶基因XynGl-I與原核表達(dá)載體pET_22b (+) 連接構(gòu)建流程圖；圖3為本發(fā)明以pET-2^ (+)空質(zhì)粒作對(duì)照分別單、雙酶切驗(yàn)證ρΕΤ-XynGl-l的電泳圖(其中M為DNAMarker從上到下分子量分別為IOOOObp、8000bp、6000bp、5000bp、 4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，1 和 2 分別為pET-22b (+)空質(zhì)粒經(jīng)Hindi II單切、Hindi 11/Xho I雙酶切的結(jié)果；3和4分別為 ρΕΤ-XynGl-l 經(jīng) HindIII 單切、Hindlll/Xhol 雙酶切的結(jié)果)；圖4-1與圖4-2為本發(fā)明以攜帶空質(zhì)粒的出發(fā)菌E. coli BL21/pET_22b (+)為對(duì)照的基因工程菌E. coli BL21/pET-XynGl-l的平板篩選圖(圖4_1為未加IPTG的篩選平板；圖4-2為加有IPTG的篩選平板)；圖5本發(fā)明重組木聚糖酶最適作用溫度的測(cè)定曲線；圖6本發(fā)明重組木聚糖酶溫度穩(wěn)定性的測(cè)定曲線；圖7本發(fā)明重組木聚糖酶最適作用PH的測(cè)定曲線；圖8本發(fā)明重組木聚糖酶pH穩(wěn)定性的測(cè)定曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進(jìn)一步說明；下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。一種耐高溫中性木聚糖酶基因，序列見序列1，本耐高溫中性木聚糖酶基因全長(zhǎng)為1134bp，命名為XynGl-I，其編碼377個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量為4U67Da，其中前39個(gè)氨基酸為其信號(hào)肽，第49 235個(gè)氨基酸為糖苷水解酶GHll家族的保守序列，第263 377個(gè)氨基酸為碳水化合物結(jié)合組件CBM6家族的保守序列。經(jīng)NCBI序列相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道的木聚糖酶的氨基酸序列最高相似度為97%，有14個(gè)氨基酸的差異。一、耐高溫中性木聚糖酶基因的獲得1、篩選出一種產(chǎn)耐高溫中性木聚糖酶的菌株，經(jīng)16s rDNA鑒定為坎皮納斯類芽孢桿菌Paenibacillus campinasensis,并命名為Paenibacillus campinasensis Gl-1 (TCCC 11578)，提取其基因組DNA，大約201Λρ，坎皮納斯類芽孢桿菌基因組DNA的提取步驟如下(1)將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液(約7 12h)取ImL, 12000r/min離心Imin收集菌體。(2)將菌體懸浮于90 μ L ddH20中，加50mg/mL溶菌酶10 μ L，充分混勻后37°C水浴保溫20min。(3)加入400 μ L裂解液混勻至產(chǎn)生大量泡沫，補(bǔ)加5mol/L NaCl 200 μ L，輕輕顛倒混勻，1200r/min 離心 IOmin0(4)上清轉(zhuǎn)移至另一 Ep管中，加1/2體積苯酚和1/2體積氯仿，溫和混勻。12000r/ min 離心 3min。(5)取上清，加入1/2體積的苯酚、氯仿反復(fù)抽提，離心，吸上清。重復(fù)此步驟直到兩相界面看不到白色物質(zhì)為止。(6)加入等體積的氯仿進(jìn)行抽提，離心，吸上清。(7)用兩倍體積的無(wú)水乙醇-70°C沉淀DNA大約30min，12000r/min離心8min， 200 μ L70%乙醇洗滌兩次，12000r/min離心5min，室溫晾干。(8) DNA溶于溶于20 μ LddH2O中_20°C短期保存。2、根據(jù)已報(bào)道木聚糖酶基因，分析其保守序列，設(shè)計(jì)本發(fā)明的耐高溫中性木聚糖酶基因的擴(kuò)增引物如下上游引物為CCCAAGCTTATGAAAATCTATGGGAAGAGGAGGA下劃線為 Hind III 酶切位點(diǎn)；下游引物為:CCGCTCGAGTCACCGGATCTCCAAATAGTCAATG下劃線為 XhoI 酶切位點(diǎn)；擴(kuò)增模板為坎皮納斯類芽孢桿菌基因組DNA，其擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95°C 5min ； 94°C 45S，55°C 45S，72°C 90S, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延長(zhǎng) lOmin。擴(kuò)增體系(50μ L) ddH20 35. 5 μ L，10 X buffer 5 μ L, dNTPs (2. 5mmol/L each) 5 μ L,上游引物(10ymol/L)1.5yL,下游引物(10μ mol/L) 1. 5 μ L, DNA 模板 1 μ L， TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，得到1134bp的單一條帶(圖1)，用小量 DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，得到本發(fā)明的耐高溫中性木聚糖酶全基因。二、耐高溫中性木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒ρΕΤ-XynGl-l的構(gòu)建與鑒定(圖2)將PCR純化產(chǎn)物與載體pET-22b(+)經(jīng)Hind III和XhoI雙酶切后，分別用小量DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，應(yīng)用DNA連接試劑盒的Solution I在16°C的條件下連接12h，將目的基因XynGl-I定向連接至載體pET_22b (+)，將連接產(chǎn)物應(yīng)用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Amp的LA培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)后提質(zhì)粒， 用Hind III和XhoI雙位點(diǎn)單、雙酶切鑒定(圖3)，測(cè)序(序列1)。得到全長(zhǎng)為1134bp的木聚糖酶基因，命名為XynGl-Ι，其編碼377個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量為4U67Da，其中前39 個(gè)氨基酸為其信號(hào)肽，第49 235個(gè)氨基酸為糖苷水解酶GHll家族的保守序列，第263 377個(gè)氨基酸為碳水化合物結(jié)合組件CBM6家族的保守序列。經(jīng)NCBI序列相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道的木聚糖酶的氨基酸序列最高相似度為97%，有14個(gè)氨基酸的差異。其中大腸桿菌化轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備方法(1)從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落，接種于aiil LB培養(yǎng)基試管中，37°C 180r/ min搖床培養(yǎng)過夜。( 取500 μ 1菌液轉(zhuǎn)接到一個(gè)含有50ml LB培養(yǎng)基的250ml錐型瓶中，37°C 180r/ min搖床培養(yǎng)2 3h，(此時(shí)OD6tltlnm彡0. 4 0. 5，細(xì)胞數(shù)務(wù)必< 108/ml，此為實(shí)驗(yàn)成功關(guān)鍵)(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，冰上放置IOmin。(4)4°C、4000r/min 離心 lOmin，回收菌體細(xì)胞。(5)倒出培養(yǎng)液，將管倒置lmin，以便液體培養(yǎng)基流盡。(6)用冰冷的0. ImoVLCaCl2溶液IOml懸浮沉淀，立即放在冰上保溫30min。(7) 4°C>4000r/min 離心 lOmin，回收菌體細(xì)胞。(8)用冰冷的0. ImoVLCaCl2和15%的甘油混合液2ml重懸細(xì)胞。(9)分裝細(xì)胞，每份50 μ 1，即得到感受態(tài)細(xì)胞。其中重組質(zhì)粒ρΕΤ-XynGl-l化學(xué)轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的具體步驟為(1)加入5 μ 1質(zhì)粒DNA連接產(chǎn)物于50 μ 1感受態(tài)中，充分混勻。(2)冰上放置 30min。C3)42°C水浴 90s。(4)冰上放置1 2min。(5)將感受態(tài)細(xì)胞加入800 μ ILB培養(yǎng)基中，搖床37°C，180r/min復(fù)蘇培養(yǎng)lh。(6)復(fù)蘇培養(yǎng)后，取菌液8000r/min離心2min，吸掉1/3上清液后，將菌體重懸，涂布于Amp抗性平板，37°C倒置培養(yǎng)12 16。2、大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)基因工程菌的構(gòu)建將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒載體ρΕΤ-XynGl-l應(yīng)用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到E. coli BL2KDE3)感受態(tài)中(轉(zhuǎn)化方法同上)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。其中誘導(dǎo)表達(dá)的具體方法為將大腸桿菌工程菌株E. coli BL21 (pET-XynGl-l)接種于2mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C水浴振蕩培養(yǎng)過夜，按8%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有5mL含Amp LB培養(yǎng)基的試管中，37°C水浴振蕩培養(yǎng)2 3h(0D_ = 0. 8 1. 0)，一組加入IPTG (終濃度為lmmol/L)， 37°C誘導(dǎo)表達(dá)3h，一組作為非誘導(dǎo)對(duì)照進(jìn)行37°C培養(yǎng)。3、大腸桿菌E. coli BL21(DE3)基因工程菌的篩選由于該木聚糖酶基因的信號(hào)肽可以被E. coli BL2KDE3)宿主菌識(shí)別，所以帶有該木聚糖酶基因的工程菌可在同時(shí)含有IPTG和底物木聚糖的LA平板(Amp抗性)上生長(zhǎng)并在菌體周圍形成透明圈，并且發(fā)現(xiàn)在不加IPTG的情況下，工程菌也能形成透明圈(圖4)，這是由于在LA培養(yǎng)基成分中含有少量的乳糖，它是IPTG的類似物，也可以起到一定程度的誘導(dǎo)作用，因此，可以直接用含有木聚糖底物的LA平板(Amp抗性)篩選攜帶有本發(fā)明木聚糖酶基因的E. coli BL21(DE3)基因工程菌。其中含有IPTG和底物木聚糖的LA平板(Amp抗性)配制方法如下IOOml LA 培養(yǎng)基+Ig 稻殼木聚糖+100 μ IAmp (50mg/ml)+20 μ IIPTG (20mg/ml)121 °C高壓滅菌20min，倒平板(5 6個(gè))。三、重組木聚糖酶XynGl-I的純化及其酶學(xué)特性分析1、應(yīng)用超聲破碎儀破碎菌體細(xì)胞，破碎后4°C 12000r/min離心IOmin取上清，即得到基因工程菌產(chǎn)耐高溫中性木聚糖酶的粗酶液，并采用DNS法測(cè)定其酶活。其中超聲破碎方法如下(1)將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。(2) 40C 5000r/min 離心 lOmin。(3)離心后，倒出上清液，加入IOml細(xì)胞裂解液(20mM Tris-HCl ρΗ7· 5與IOOmM NaCl的混合溶液)，用移液器將沉淀的細(xì)胞打散。(4)超聲破碎電壓50%，總時(shí)間30min，開5s，關(guān)9. 9s。其中木聚糖酶酶活測(cè)定方法為(DNS法):吸取0. ImL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液到5mL具塞刻度試管中，再加入10g/L的木聚糖底物溶液0. lmL。蓋緊試管塞，50°C水浴恒溫反應(yīng)lOmin，立即向試管中加入0. 6mLDNS試劑并混勻終止反應(yīng)，然后在沸水中煮沸l(wèi)Omin，冷卻后加水定容至5mL，充分搖勻。根據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出反應(yīng)體系的含糖量。試驗(yàn)中對(duì)木聚糖酶活力單位的定義為lmL酶液每分鐘產(chǎn)生1 μ moL的還原糖(以木糖計(jì))為一個(gè)活力單位，用U表示，U = NXR/10minX0. ImL式中N為酶液稀釋倍數(shù)；R為回歸方程計(jì)算出的木糖含量。2、對(duì)所得粗酶液應(yīng)用鎳離子親和層析進(jìn)行一步純化，得到純酶。其中具體純化方法如下超聲破碎得到粗酶液，加入10%的TX-100，終濃度為1%，12000rpm，離心20min，
取上清。取1ml beadS(Ni柱)于50ml離心管中，加入20ml裂解液洗脫，除去酒精，4°C， 5000rpm，離心15min，去除上清。將離好的上清(可溶蛋白)加入到beads中，混勻，冰上孵育池(增加特異性)，孵育前加IOmM咪唑。40C，2000rpm,離心 3min，用 20mM 咪唑洗 3 次，2000rpm，離心 3min，再用含 50mM 咪唑的 washing buffer 洗一次。洗脫250mM咪唑的洗脫液1. 5ml加入beads中，混勻，冰浴IOmin后，洗脫。用PD-IODesalting column去鹽，即得重組木聚糖酶XynGl-Ι的純蛋白。3、重組木聚糖酶XynGl-I酶學(xué)特性的測(cè)定
其中溫度對(duì)酶活力的影響1)該木聚糖酶最適作用溫度的測(cè)定在不同溫度(40°C、45°C、50°C、55°C、6(rC、 65°C、70°C、80°C )，pH7. 0條件下測(cè)定重組木聚糖酶的酶活力，單位為U/ml (圖5)。2)該木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性測(cè)定將重組木聚糖酶純酶液分別置于不同溫度 (30 V、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C )、pH為7. 0的條件下，保溫Ih后，測(cè)定各自的殘余酶活力，將其中最高酶活力定為100% (圖6)。其中pH對(duì)酶活力的影響1)該木聚糖酶最適作用pH的測(cè)定:在不同？!1(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，溫度為60°C的條件下測(cè)定重組木聚糖酶的酶活力，單位為U/ml (圖7)。2)該木聚糖酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定將重組木聚糖酶純酶液分別調(diào)至不同pH(5.0、 6.0,7.0,8.0,9.0,10. 0)、溫度60°C條件下，保溫Ih后，測(cè)定各自的殘余酶活力，將其中最高酶活力定為100% (圖8)。本發(fā)明的重組木聚糖酶最適作用溫度為60°C，在pH7. 0、70°C保溫lh，相對(duì)酶活在 65%以上，重組木聚糖酶最適作用pH為7. 0，在pH9、溫度60°C條件下Ih，相對(duì)酶活在60% 以上，本發(fā)明的重組木聚糖酶在以上特性上與原始菌產(chǎn)生的木聚糖酶基本一致，酶學(xué)特性未發(fā)生改變。
權(quán)利要求
1.一種耐高溫中性木聚糖酶基因，其特征在于基因序列見序列1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐高溫中性木聚糖酶基因，其特征在于所述耐高溫中性木聚糖酶基因全長(zhǎng)為1134bp，命名為XynGl-Ι，其編碼377個(gè)氨基酸，其分子量為4U67Da，其中前39個(gè)氨基酸為其信號(hào)肽，第49 235個(gè)氨基酸為糖苷水解酶GHll家族的保守序列， 第263 377個(gè)氨基酸為碳水化合物結(jié)合組件CBM6家族的保守序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐高溫中性木聚糖酶基因，其特征在于所述基因來源于坎皮納斯類芽孢桿菌。
4.一種攜帶權(quán)利要求1中所述的耐高溫中性木聚糖酶基因的菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的攜帶耐高溫中性木聚糖酶基因的菌株，其特征在于宿主菌為大腸桿菌E. coli BL21。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的攜帶耐高溫中性木聚糖酶基因的菌株，其特征在于構(gòu)建方法如下(1)根據(jù)已報(bào)道木聚糖酶基因，分析其保守序列，設(shè)計(jì)本發(fā)明的耐高溫中性木聚糖酶基因的擴(kuò)增引物如下上游引物為序列2，下游引物為序列3 ；擴(kuò)增模板為坎皮納斯類芽孢桿菌基因組DNA，其擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95°C 5min； 94°C 45S，55°C 45S，72°C 90S, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延長(zhǎng) lOmin，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，得到1134bp的單一條帶，回收PCR產(chǎn)物，得到耐高溫中性木聚糖酶全基因；(2)重組質(zhì)粒ρΕΤ-XynGl-l的構(gòu)建與鑒定將PCR純化產(chǎn)物與載體pET-22b(+)經(jīng)Hind III和)(hoI雙酶切后，分別回收酶切產(chǎn)物， 應(yīng)用DNA連接試劑盒的Solution I在16°C的條件下連接12h，將目的基因XynGl-I定向連接至載體pET-22b(+)，將連接產(chǎn)物應(yīng)用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Amp的LA培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)后提質(zhì)粒，用Hind III和B10I雙位點(diǎn)單、雙酶切鑒定，測(cè)序；(3)大腸桿菌E.coliBL21基因工程菌的構(gòu)建將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒ρΕΤ-XynGl-l應(yīng)用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐高溫中性木聚糖酶基因及含有該基因的工程菌，基因序列見序列1，基因全長(zhǎng)為1134bp，命名為XynG1-1，其編碼377個(gè)氨基酸，其分子量為41267Da，其中前39個(gè)氨基酸為其信號(hào)肽，第49～235個(gè)氨基酸為糖苷水解酶GH11家族的保守序列，第263～377個(gè)氨基酸為碳水化合物結(jié)合組件CBM6家族的保守序列。本發(fā)明提供的工程菌發(fā)酵得到的重組酶的最適作用溫度和最適作用pH分別為60℃和7.0，在pH7.0、70℃保溫1h，相對(duì)酶活在65％以上，在pH9、溫度60℃條件下保溫1h，相對(duì)酶活在60％以上。本發(fā)明的木聚糖酶在高溫下有良好的穩(wěn)定性，適合造紙、食品和飼料等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/07GK102191260SQ20111009690
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月18日
發(fā)明者劉逸寒, 王建玲, 王春霞, 路福平, 鄭宏臣 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)