專利名稱：一種用于體外分離純化有核細(xì)胞的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于體外分離純化骨髓、臍帶血或外周血中有核細(xì)胞的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細(xì)胞，是機(jī)體的起源細(xì)胞，是形成人體各種組織器官的原始細(xì)胞。干細(xì)胞可以從骨髓、臍帶血和外周血中分離純化干細(xì)胞，單個核細(xì)胞常用的分離方法主要有以下幾種6%羥乙基淀粉沉降法、甲基纖維素沉降法、Ficoll分離法、Percoll分離法、3%明膠分離法、氯化銨溶解紅細(xì)胞法，直接離心法等。常用的單核細(xì)胞的分離方法為Ficoll或Percoll直接分離法。即將血液稀釋后直接加于分 離液上經(jīng)密度梯度離心獲得單個核細(xì)胞。Ficoll和Percoil均為常用的淋巴細(xì)胞分離液，有人曾對這兩種分離液對比研究，認(rèn)為Ficoll分離獲得的單個核細(xì)胞最為純凈?，F(xiàn)有技術(shù)中從骨髓、臍帶血和外周血中分離純化干細(xì)胞的方法存在著干細(xì)胞活率及回收率較低等缺點，本研究預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，采用Ficoll和Percoll直接分離法操作時間長、不同批次的Fieoll或Pcrcoll、不同的血液樣本、同一樣本同樣操作，收集的單個核細(xì)胞的 數(shù)量多少不一，影響單個核細(xì)胞的穩(wěn)定收集。我們的實驗通過對比研究認(rèn)為，采用6%羥乙基淀粉結(jié)合Ficoll用于分離血液中單核細(xì)胞提高了單核細(xì)胞的回收率和活率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于體外分離純化骨髓、臍帶血或外周血中有核細(xì)胞的方法和試劑盒以及該試劑盒的使用方法。本發(fā)明所述的試劑盒包括各自隔離包裝的沉淀液、純化液和懸浮液，其中沉淀液是溶于生理鹽水的羥乙基淀粉，其重量體積濃度為6%，純化液是聚蔗糖泛影鈉，懸浮液是生理鹽水。所謂隔離包裝是指沉淀液、純化液和懸浮液各自密封在互不相通的容器中，優(yōu)選地，各自獨立包裝。本發(fā)明所述的試劑盒，其中所述的沉淀液純化液懸浮液的體積比為(2-5) (3-9) I。本發(fā)明的試劑盒其中所述試劑盒中還包括使用說明書，所述說明書載明了所述試劑盒的使用方法，所述方法包括如下步驟(I)將經(jīng)過抗凝處理的骨髓/臍帶血/外周血倒入沉淀液試劑瓶中，擰緊瓶蓋顛倒混勻5次，擰松瓶蓋，靜置22-25分鐘；(2)用IOml的移液管將上清液轉(zhuǎn)到50ml的離心管中，每管25ml，盡量不要吸到紅細(xì)胞沉淀，并配平。(3)將兩個離心管4°C，離心力710xg (轉(zhuǎn)速2000rpm)，5分鐘離心，離心完畢后，棄
去上清，用手指輕輕震開沉淀，每管加25ml生理鹽水重懸細(xì)胞。
(4)將純化液按每管25ml加到另外兩個50ml新的離心管中，將第3步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心カ710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm) ,20分鐘離心,關(guān)閉離心機(jī)剎車功能。(5)離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C,配平。離心カ400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細(xì)胞兩次。(6)將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。本發(fā)明所述的試劑盒，用于體外分離純化骨髓/臍帶血/外周血中有核細(xì)胞。它利用細(xì)胞與無機(jī)鹽離子聯(lián)合聚集沉淀的原理，采用逆向收集法分離純化有核細(xì)胞。本發(fā)明的試劑盒通常在2-8°C保存。本發(fā)明所述的試劑盒，使用的樣品類型為骨髓/臍帶血/外周血，可以按照通用的 方法收集所需的骨髄/臍帶血/外周血樣本；確保骨髄/臍帶血/外周血收集后轉(zhuǎn)入一次性抗凝血袋；骨髄/臍帶血/外周血收集后應(yīng)在6小時內(nèi)進(jìn)行分離純化有核細(xì)胞。本發(fā)明所述的試劑盒，回收率可以達(dá)到》90%，分離的有核細(xì)胞活率> 96%，最大程度地維持了干細(xì)胞在體外微環(huán)境的恒定。本發(fā)明還公開了所述試劑盒的使用方法，包括如下步驟(I)將經(jīng)過抗凝處理的骨髄/臍帶血/外周血倒入沉淀液試劑瓶中，擰緊瓶蓋顛倒混勻5次，擰松瓶蓋，靜置22-25分鐘；(2)用IOml的移液管將上清液轉(zhuǎn)到50ml的離心管中，每管25ml，盡量不要吸到紅細(xì)胞沉淀，并配平。(3)將兩個離心管4°C，離心カ710xg (轉(zhuǎn)速2000rpm)，5分鐘離心，離心完畢后，棄
去上清，用手指輕輕震開沉淀，每管加25ml生理鹽水重懸細(xì)胞。(4)將純化液按每管25ml加到另外兩個50ml新的離心管中，將第3步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心カ710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm), 20分鐘離心,關(guān)閉離心機(jī)剎車功能。(5)離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C,配平。離心カ400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細(xì)胞兩次。(6)將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。本發(fā)明的細(xì)胞活率是采用如下方法進(jìn)行檢測的I.吸管吸取90微升分離后的有核細(xì)胞懸液。2.加入O. 2%的臺盼藍(lán)染色液10微升，混勻。3.靜置3分鐘。4.吸取混合溶液，滴一滴至細(xì)胞計數(shù)板，均勻鋪開后，顯微鏡下觀察。5.顯微鏡200倍下人エ計數(shù)，藍(lán)染的細(xì)胞為死細(xì)胞(A)，無染色的細(xì)胞為活細(xì)胞(B)。有核細(xì)胞活率=B/(A+B)*100%
具體實施例方式實施例I細(xì)胞處理試劑盒(骨髄、臍帶血、外周血)SlOO型的制備方法沉淀液的制備羥こ基淀粉2. 40g溶解在生理鹽水40ml中，濃度為6%，37°C水浴，從水浴鍋溫度穩(wěn)定在37°C開始計時8小吋，37°C水浴8小時后，從水浴鍋中取出，室溫半小時，保存。純化液的制備HIST0PAQUE1077液(聚蔗糖泛影鈉)60ml，從冰箱溫度穩(wěn)定在4°C開始計時8小吋。4°C 8小時后，從4度冰箱中取出，室溫半小時，保存。懸浮液的制備用量筒量取20ml生理鹽水，保存。細(xì)胞處理試劑盒(骨髄、臍帶血、外周血)SlOO型說明書產(chǎn)品名稱通用名細(xì)胞處理試劑盒英文名CellIsolation Kit包裝規(guī)格SlOO型沉淀液(羥こ基淀粉2.40g溶解在生理鹽水40ml中，濃度為6% )40ml ;純化液(聚蔗糖泛影鈉)60ml ;懸浮液(生理鹽水)20ml預(yù)期用途用于體外分離純化骨髓/臍帶血/外周血中有核細(xì)胞作用原理利用細(xì)胞與無機(jī)鹽離子聯(lián)合聚集沉淀的原理，采用逆向收集法分離純化有核細(xì)胞。主要組成組份沉淀液羥こ基淀粉、生理鹽水；純化液聚蔗糖泛影鈉和生理鹽水；懸浮液生理鹽水貯存條件及有效期2-8°C保存，有效期24個月。適用儀器低溫離心機(jī)、離心管和移液管要求使用一次性產(chǎn)品(使用者自備，推薦使用無菌產(chǎn)品)。樣本要求
本方法推薦的樣品類型為骨髄/臍帶血/外周血 按照通用的方法收集所需的骨髄/臍帶血/外周血樣本； 確保骨髄/臍帶血/外周血收集后轉(zhuǎn)入一次性抗凝血袋； 骨髓/臍帶血/外周血收集后應(yīng)在6小時內(nèi)進(jìn)行分離純化有核細(xì)胞 微生物污染的樣本對測定結(jié)果的影響尚未確定。試驗方法本試劑盒可分離純化骨髄/臍帶血/外周血中有核細(xì)胞。細(xì)胞活率檢測I吸管吸取90微升分離后的有核細(xì)胞懸液。2加入O. 2%的臺盼藍(lán)染色液10微升，混勻。3靜置3分鐘。4吸取混合溶液，滴一滴至細(xì)胞計數(shù)板，均勻鋪開后，顯微鏡下觀察。5顯微鏡200倍下人エ計數(shù)，藍(lán)染的細(xì)胞為死細(xì)胞(A)，無染色的細(xì)胞為活細(xì)胞⑶。有核細(xì)胞活率=BバA+B) *100%操作步驟I將經(jīng)過抗凝處理的骨髄/臍帶血/外周血倒入沉淀液試劑瓶中，擰緊瓶蓋顛倒混勻5次，擰松瓶蓋，靜置22-25分鐘。2用IOml的移液管將上清液轉(zhuǎn)到兩個50ml的離心管中，不要吸到紅細(xì)胞沉淀，并配平。
3將兩個離心管4°C，離心カ7IOxg (轉(zhuǎn)速2000rpm)，5分鐘離心，離心完畢后，棄去
上清，用手指輕輕震開沉淀，每管加25ml生理鹽水重懸細(xì)胞。4將純化液按每管25ml加到另外兩個50ml新的離心管中，將第3步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心カ710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm) ,20分鐘離心,關(guān)閉離心機(jī)剎車功能。5離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C,配平。離心カ400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細(xì)胞兩次。6將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。正常參考值分離的有核細(xì)胞活率彡96%。
注意事項
本品用于體外分離純化骨髓/臍帶血/外周血中有核細(xì)胞； 操作前應(yīng)仔細(xì)閱讀使用說明書，嚴(yán)格按說明書的操作程序進(jìn)行； 各試劑使用前應(yīng)觀察有無渾濁，如有則應(yīng)更換試劑，嚴(yán)格控制每步離心的時間和溫度。
權(quán)利要求
1.一種用于體外分離純化骨髓、臍帶血或外周血中有核細(xì)胞的試劑盒，包括各自隔離包裝的沉淀液、純化液和懸浮液，其中沉淀液是溶于生理鹽水的羥乙基淀粉，其重量體積濃度為6 %，純化液是聚蔗糖泛影鈉，懸浮液是生理鹽水。
2.如權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述的沉淀液、純化液和懸浮液各自獨立包裝。
3.如權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述的沉淀液純化液懸浮液的體積比為(2-5) (3-9) I。
4.如權(quán)利要求1-3的任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中所述試劑盒中還包括使用說明書，所述說明書載明了所述試劑盒的使用方法，所述方法包括如下步驟 (1)將經(jīng)過抗凝處理的骨髓/臍帶血/外周血倒入沉淀液試劑瓶中，擰緊瓶蓋顛倒混勻5次，擰松瓶蓋，靜置22-25分鐘； (2)用IOml的移液管將上清液轉(zhuǎn)到50ml的離心管中，每管25ml，盡量不要吸到紅細(xì)胞沉淀，并配平； (3)將兩個離心管4°C，離心力710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm)，5分鐘離心，離心完畢后，棄去上清，用手指輕輕震開沉淀，每管加25ml生理鹽水重懸細(xì)胞； (4)將純化液按每管25ml加到另外兩個50ml新的離心管中，將第3步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm) ,20分鐘離心,關(guān)閉離心機(jī)剎車功能； (5)離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C，配平。離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細(xì)胞兩次； (6)將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。
5.如權(quán)利要求1-4的試劑盒的使用方法，包括如下步驟 (1)將經(jīng)過抗凝處理的骨髓/臍帶血/外周血倒入沉淀液試劑瓶中，擰緊瓶蓋顛倒混勻5次，擰松瓶蓋，靜置22-25分鐘； (2)用IOml的移液管將上清液轉(zhuǎn)到50ml的離心管中，每管25ml，盡量不要吸到紅細(xì)胞沉淀，并配平； (3)將兩個離心管4°C，離心力710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm)，5分鐘離心，離心完畢后，棄去上清，用手指輕輕震開沉淀，每管加25ml生理鹽水重懸細(xì)胞； (4)將純化液按每管25ml加到另外兩個50ml新的離心管中，將第3步中的細(xì)胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg(轉(zhuǎn)速2000rpm) ,20分鐘離心,關(guān)閉離心機(jī)剎車功能； (5)離心后，吸取中間層細(xì)胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C，配平。離心力400xg(轉(zhuǎn)速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細(xì)胞兩次； (6)將洗后的細(xì)胞加到懸浮液中，備用。
全文摘要
一種用于體外分離純化有核細(xì)胞的試劑盒，包括各自隔離包裝的沉淀液、純化液和懸浮液，其中沉淀液是溶于生理鹽水的羥乙基淀粉，其重量體積濃度為6％，純化液是聚蔗糖泛影鈉，懸浮液是生理鹽水。本發(fā)明還提供了所述試劑盒的使用方法。
文檔編號C12N5/0786GK102747034SQ201110097289
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者蔡云松, 遲明國 申請人:北京同盛頤和生物科技有限公司