專利名稱：綿羊肺炎支原體Hsp70(DnaK)C末端基因重組質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于微生物學、分子生物學與基因工程研究領域，涉及微生物學、分子生物學與基因工程的相關實驗方法與技術(shù)，特別涉及一種綿羊肺炎支原體Hsp70 (DnaK) C末端基因重組質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae, MO)能感染并危害綿羊，是引起綿羊傳染性胸膜肺炎(Contagious ovine pleuropneumonia)的主要致病菌，并且也能感染 1-3月齡的羔羊和山羊。綿羊傳染性胸膜肺炎是一種綿羊慢性呼吸道傳染病，以咳嗽、喘氣， 漸進性消瘦及慢性增生性間質(zhì)性肺炎為主，是一種世界性的傳染病。研究認為，熱休克蛋白70 (Hsp70)，也稱DnaK，具有多種生物學功能，包括分子伴侶功能，參與免疫反應，抗細胞凋亡功能，抗氧化功能，提高細胞的應激耐受性，促進細胞增殖，參與細胞骨架的形成和修復等等，廣泛的生物學功能使其成為當今生命科學研究中的熱點。進一步研究認為，Hsp70不僅具有良好的免疫原性，可誘導和增強機體體液免疫和細胞免疫的發(fā)生，同時它還具有免疫佐劑的功能。到目前為止，綿羊肺炎支原體基因組全序列尚未見報道。本研究在先期首次克隆獲得Hsp70 (DnaK)基因全長cDNA的基礎上，利用 DNAstar對Hsp70蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測，分析結(jié)果顯示α螺旋在整個蛋白質(zhì)中均有分布， 其中50-175、210-250、480-576是主要分布區(qū)，尤其是在C末端的480-576區(qū)含有大量的α 螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)可能與蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)有關。而整個蛋白質(zhì)當中β折疊較少，僅在360-380區(qū)有較少的β折疊。分析還表明C末端還具有較強親水性，很有可能是蛋白質(zhì)的抗原表位。表面抗原分析MO Hsp70的結(jié)果較為復雜，有多處區(qū)段都有可能處在蛋白質(zhì)表面，其中在MO Hsp70C末端分布較為連續(xù)。在350-390區(qū)是蛋白質(zhì)的跨膜區(qū))，蛋白質(zhì)的螺旋卷曲集中在218-256、472-5沈、530-580區(qū)。通過對MO Hsp70蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預測分析發(fā)現(xiàn):M0 Hsp70C末端有較強的親水性和較多的螺旋卷曲結(jié)構(gòu)；α螺旋結(jié)構(gòu)在C末端也大量集中出現(xiàn)，這與蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)有關；抗原表位結(jié)果顯示在C末端連續(xù)分布。上述結(jié)果預測MO Hsp70C末端是抗原表位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種綿羊肺炎支原體Hsp70(DnaK)C末端基因重組質(zhì)粒，從而為后續(xù)的綿羊肺炎支原體的分子生物學研究、相關疫病臨床診斷試劑與基因工程疫苗的研制等奠定了堅實的基礎。本發(fā)明的目的按照下述技術(shù)方案實現(xiàn)根據(jù)MO hsp70基因序列及引物設計原則設計并合成如下引物P2 -GGG GTCGAC TTAATTTTGTTTGATTTC ；P3 :CAG GGATCC ACTCCTTTAACTTTAGGo 其中 P2 和 P3 陰影處分別表示 Sal I和BamH I的酶切位點；以質(zhì)粒T_Hsp70 (含MO Hsp70全長cDNA序列)為模板，利用上述引物P2、P3，進行PCR擴增得到了 Hsp70C末端基因cDNA片段，片段大小約為700bp。將該片段與pET28a(+)相連接，獲得了重組質(zhì)粒pET28a(+)-HSp70C，酶切鑒定與核苷酸序列測定結(jié)果表明目的基因序列和閱讀框架正確。進一步將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中， 并對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE，得到大小約為^kDa的目的蛋白；Western blotting分析表明，目的蛋白表達特異，且可特異性識別臨床血清。本發(fā)明在前期克隆獲得MO Hsp70全長基因的基礎上，對Hsp70C末端基因700bp 進行了克隆與原核重組質(zhì)粒的構(gòu)建，并對重組質(zhì)粒所表達目的蛋白的生物學特性進行了初步研究。實驗結(jié)果為綿羊肺炎支原體的分子生物學研究、相關疫病臨床診斷試劑與基因工程疫苗的研制等奠定了堅實的基礎。


圖1是本發(fā)明PCR擴增Hsp70C末端基因電泳圖，其中1. Marker2000, 2. PCR電泳
結(jié)果；圖2是本發(fā)明表達載體酶切電泳圖，其中l(wèi).Marker 10000 ；2. BamH I單酶切片斷，3. BamH I/Sal I 雙酶切片斷，4. PCR 鑒定；5. Marker 2000 ；圖3是本發(fā)明重組質(zhì)粒pET28a-HSp70-C測序結(jié)果；圖 4 是本發(fā)明 BL21 (DE3) (pET28a(+) -Hsp70-C)表達產(chǎn)物 SDS-PAGE 圖譜；其中:1.BL21(DE3)(pET_22b(+))表達產(chǎn)物；2. BL21 (DE3) (pET28a(+) -Hsp70-C)誘導 3h 表達產(chǎn)物；3. BL21 (DE3) (pET28a(+) -Hsp70-C)誘導 4h 表達產(chǎn)物；4. Protein Marker ；圖 5. BL21 (DE3) (pET28a(+) -Hsp70-C)表達產(chǎn)物 Western blotting 結(jié)果，其中:1.BL21(DE3)(pET28a(+))表達產(chǎn)物，2.預染 Protein Marker ；圖6. BL21 (DE3) (pET28a (+)-Hsp70-C)表達產(chǎn)物與臨床血清反應結(jié)果；其中1-5 表達產(chǎn)物與血凝抑制實驗陽性血清反應結(jié)果；6-8 表達產(chǎn)物與血凝抑制實驗陰性血清反應結(jié)果。
具體實施例方式一、MO Hsp70C末端基因的克隆根據(jù)MO hsp70基因序列及引物設計原則設計并合成如下引物P2 GGGGTCGACTTAATTTTGTTTGATTTC ；P3 CAGGGATCCACTCCTTTAACTTTAGG 其中 P2 和 P3 陰影處分別表示Ml I和BamH I的酶切位點。利用PCR技術(shù)，以P2和P3為引物，以T_Hsp70質(zhì)粒(含MO Hsp70全長cDNA序列)為模板，擴增了 Hsp70C末端基因700bp片段(見圖1)。二、MO Hsp70C末端基因原核表達載體的構(gòu)建將Hsp70C末端基因擴增產(chǎn)物和表達載體pET28a (+)分別經(jīng)Ml I和BamH I雙酶切，以 Wizard PCR preps DNA Purification System 試劑盒純化回收后用 T4DNA Lingase 進行連接，4°C過夜。連接產(chǎn)物按轉(zhuǎn)化至DH (5 α)中，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定(見圖幻，將篩選得到的陽性重組子命名為pET28a(+)-Hsp70C。對其進行核苷酸序列測定(見圖3)，結(jié)果表明其基因序列和閱讀框架正確。三、表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析將pEI^8a-Hsp70-C 轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3)，IPTG 誘導 3_4h，常規(guī)處理后，用 SDS-PAGE 分析，結(jié)果表明總蛋白中含目的蛋白(圖4)，分子量大小均約為^kDa,與理論值相符，表明融合基因可在BL21(DE3)中實現(xiàn)表達。四、表達產(chǎn)物的Western blotting分析利用Western blotting，對 BL21 (DE3) (pED8a (+)-Hsp70_C)表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)膜后蛋白進行檢測。結(jié)果表明，在約^kDa處出現(xiàn)識別條帶，重組蛋白可以被His-Tag特異性抗體識別，而陰性對照在相同位置無條帶(結(jié)果如圖5所示)。五、表達產(chǎn)物與臨床血清的雜交反應前期實驗中，以綿羊傳染性胸膜肺炎血凝抑制實驗檢測試劑盒對8份臨床血清樣本進行了檢測，獲得5份陽性血清、3份陰性血清。以BL21(DE3) (pET28a(+)-Hsp70-C)表達產(chǎn)物與臨床血清樣本進行western blotting雜交(見圖6)，雜交結(jié)果與血凝抑制試驗檢測結(jié)果相符。結(jié)果表明本研究中所表達的Hsp70C末端可有效區(qū)分臨床陽性、陰性血清； HSP70可能是可能誘導機體抗MO感染的優(yōu)勢抗原。
權(quán)利要求
1. 一種綿羊肺炎支原體Hsp70(DnaK)C末端基因重組質(zhì)粒，其構(gòu)成方法為首先設計并合成如下引物P2: GGGGTCGACTTAATTTTGTTTGATTTC ；P3 CAGGGATCCACTCCTTTAACTTTAGG,再以質(zhì)粒T_Hsp70為模板，利用上述引物P2、P3進行PCR擴增，得到Hsp70 C末端基因cDNA片段，片段大小約為700 bp，將該片段與pET28a(+)相連接，獲得重組質(zhì)粒pET28a(+)-HSp70C，進一步將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)中，并對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE，得到大小約為四kDa的目的蛋白。
全文摘要
一種綿羊肺炎支原體Hsp70(DnaK)C末端基因重組質(zhì)粒，其構(gòu)成方法為首先設計并合成如下引物P2:GGGGTCGACTTAATTTTGTTTGATTTC；P3:CAGGGATCCACTCCTTTAACTTTAGG，再以質(zhì)粒T-Hsp70為模板，利用上述引物P2、P3進行PCR擴增，得到Hsp70C末端基因cDNA片段，片段大小約為700bp，將該片段與pET28a(+)相連接，獲得重組質(zhì)粒pET28a(+)-Hsp70C，進一步將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，并對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE，得到大小約為29kDa的目的蛋白。
文檔編號C12R1/35GK102242140SQ20111009814
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者劉曉明, 徐慶春, 李敏, 王玉炯, 謝琴, 馬春驥 申請人:寧夏大學